专利名称：亚硝基化合物及其作为自旋捕集剂的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的亚硝基化合物及其作为自旋捕集剂的用途。
Jansen等人，JACS(1968)905909-10创建了该技术。此后，已经有许多关于适合的自旋捕集剂的合成研究。最常使用的自旋捕集剂是在与自由基的反应中形成氮氧化物(nitroxide)的那些。
可商购的自旋捕集剂是3，5-二溴-4-亚硝基苯磺酸酯的钠盐(DBNBS)。参见Kaur等人，JCS Chem.Comm.(1981)142-3。DBNBS是水溶性芳香族C-亚硝基自旋捕集剂，已经报道了其捕获了亚硫酸根阴离子(SO3-)、超氧化物、烷基、一氧化氮和亚硒酸阴离子基团。还报道了当将DBNBS氧化成能通过ESR光谱学检测的基团阳离子DBNBS+时，DBNBS就能在尿毒症病人的血浆中检测到氧化类物质。参见Roselaar等人，国际肾学杂志(KidneyInternational)(1995)48199-206，和WO-A-92/18874。
Reist等人，FEBS Lett.(1998.423231-4)，公开了亚硫酸盐对肺是有毒的，并且能引起变态反应如哮喘症中的支气管缩窄。Reist等人，肾病学杂志(J.Nephrology)(1998)712431-8报道了亚硫酸盐同过硝酸盐结合对神经元细胞的毒性作用。因此，对于亚硫酸盐来说，有效的自旋捕集剂具有很大潜在的价值。
Matsuo等人，游离基生物与医学(Free Radical Biology and Medicine)(1998)25929-35，报道了对于乙型肝炎表面(HBs)抗原检测非常灵敏的‘ELISA-ESR’方法，该方法使用4-亚肼基甲基-1-羟基-2，2，5，5-四甲基-3-咪唑啉-3-氧化物(HHTIO)作为自旋捕集剂。在该方法中，用第一HBs抗体包被玻璃珠，并且用辣根过氧化物酶(HRP)标记第二HBs抗体。在HBs抗原的存在下，HRP标记的抗体将同抗原连接，抗原同玻璃珠连接。在洗涤之后，将抗原-抗体复合物加入到含有对乙酰氨基苯酚(p-AP)、过氧化氢和HHTIO的溶液中。在过氧化氢的存在下，通过HRP作用将p-AP转化为苯氧基，用HHTIO捕集苯氧基以形成稳定的能通过ESR光谱学检测的氮氧基(nitroxide radical)。
DCNBS至少有几个优于DBNBS的优点。这些优点包括改进了自旋捕集剂在含水系统中的溶解性和较狭窄的ESR信号(其将导致较大的信/噪比)。
已经使用DCNBS成功地检测了肾衰竭患者的渗析液中的氧化剂(氧化剂将DCNBS氧化为其基团阳离子DCNBS+，接着通过ESR光谱学进行检测)。
DCNBS将捕获一氧化氮。并且其还是对烷基自由基、过氧化物和亚硒酸根阴离子(SeO3-)来说的潜在的自旋捕集剂。
就亚硫酸根阴离子(SO3-)来说，发现DCNBS是比DBNBS具有更大灵敏度的自旋捕集剂。同样DMNBS优于DBNBS或其同位素类似物(15N和d2)或DCNBS。对SO3-加合物来说，用DMNBS获得的ESR信号比用DBNBS获得的多20倍。
因此，DMNBS作为亚硫酸根阴离子的自旋捕集剂具有巨大的潜能。此外，DMNBS可用作通过ESR检测ELISAs中抗体-过氧化物酶复合物存在的检测器分子。
DCNBS和DMNBS可以如DBNBS一样以相同的方式配制和使用。下面描述它们的合成和应用。
例如，可以用本发明的化合物分析任何适合的存在亚硫酸盐阴离子、一氧化氮、烷基自由基或过氧化物的样品。还可用本发明的化合物分析尿毒症患者渗析液中的氧化剂。并且参见英国专利申请No.0024938.3。
在本发明的分析中，可以通过ESR光谱学检测基团。
在本发明特别的实施方案中，在上述的ELISA-ESR分析中，可以用DMNBS代替HHTIO。基于同样的原理，通过HRP的作用(图2)，由亚硫酸盐、过氧化氢和DMNBS的反应混合物可形成DMNBS-SO3-加合物。许多HRP标记的抗体是普遍有效的。初步的结果暗示了DMNBS分析优于HHTIO分析，这表明本发明的化合物可用作通过ESR检测ELISAs中抗体-过氧化物酶复合物存在的检测器分子。
下面的实施例阐明了本发明化合物的制备。接下来的测试阐明了其应用。
在SO3-体系中，通过DBNBS和DCNBS测量基团形成的程度。当DBNBS同辣根过氧化物酶/过氧化氢/亚硫酸盐反应时，在上面指定的ESR条件下能观测到成对的三重峰。三重峰是由于在DBNBS分子中苯环4位的氮超精细分裂，成对是由于在苯环2和6位的氢超精细分裂。当用DCNBS代替DBNBS时，较小的氯原子代替了大的溴原子，这将引起信号线宽度从0.087到0.085mT的下降。
在SO3-体系中，DBNBS在17.72mM、DCNBS在20-25mM达到了最佳浓度。因此在这些浓度处比较自旋捕集剂的灵敏度。各自的信号/标记比率为3.33和10.62，这表明DCNBS比DBNBS的灵敏度大3倍。
当以捕获亚硫酸根阴离子(SO3-)(由HRP，过氧化氢，SO32-产生)的方式来比较水溶性的自旋捕集剂DMNBS，DCNBS，DBNBS，DBNBS-d2，DBNBS-15N和DBNBS-d2-15N时，发现DMNBS获得最大的ESR信号。发现该信号的高度比DBNBS获得的大20倍。而且还发现比用同位素标记的DBNBS类似物DBNBS-d2-15N多3倍。因此DMNBS是对亚硫酸根阴离子特别有用的自旋捕集剂。
一氧化氮的反应用氮气将
图1所示的仪器冲洗15分钟。然后将含有去离子水(4毫升)的vacutainer同系统连接，再用氮气冲洗15分钟，以除去在系统中存在的任何氧气，因而阻止了二氧化氮的形成。使NO气体经系统鼓泡通过去离子水45分钟。通过鼓泡通过两瓶2M氢氧化钠除去在加压的一氧化氮容器中存在的少量的二氧化氮。然后，将气体鼓泡通过含有去离子水的洗瓶以除去任何碱性的气溶胶污物。在去离子水步骤之后，将过量的一氧化氮鼓泡通过含有1M高锰酸钾/1M氢氧化钠的洗瓶，以阻止过量的一氧化氮从通风橱中逸出。在得到的一氧化氮饱和的水中，一氧化氮的浓度为2.0mM。自旋捕集剂溶液将DBNBS、DCNBS和DMNBS样品称重放入vacutainer，蒸发。Tris-HCl缓冲液，0.01M，pH7.4，通过用氮气鼓泡15分钟去氧。通过气体密封的注射器将去氧的缓冲液加入自旋捕集剂中，得到最后的自旋捕集剂的浓度为0.30M。将该自旋捕集剂溶液简单地用氮气冲洗，然后备用。时程将一氧化氮饱和的水(1毫升)加入每个1毫升自旋捕集剂溶液(DBNBS、DCNBS和DMNBS)中。自旋捕集剂的最终浓度为0.15M，一氧化氮为1mM。通过将1毫升去氧水加入自旋捕集剂溶液中得到平行空白液。在每一个时间点，从待测溶液中取出样品，用ESR光谱分析该样本和空白液，该空白液作为光谱的基准物。
时程试验表明在使用的条件下，DBNBS(0.15M)同一氧化氮(1.0mM)的反应很慢。发现DBNBS同一氧化氮的反应在约50小时达到最大。发现DMNBS同一氧化氮的反应在24-28小时达到最大。发现DCNBS同一氧化氮的反应进行的最快，在20-24小时达到最大。自旋捕集剂的剂量反应如上制备自旋捕集剂溶液，获得反应混合物中最终浓度为0.05，0.1，0.15，0.2和0.25M和平行空白液。将一氧化氮饱和的溶液(0.5毫升，最终浓度1mM)加入测试溶液中，将去氧水(0.5毫升)加入空白液中。在用ESR光谱学分析之前，将具有DBNBS的反应混合物温育26小时，而具有DCNBS的反应混合物温育22小时。分别将空白液作为其平行测试光谱的基准物。灵敏性研究在浓度为0.15M的DBNBS处得到DBNBS同一氧化氮反应的最大信号强度。就DCNBS同一氧化氮反应来说，在0.05-0.40M的DCNBS处观测到平顶。因此被选择用来评价DBNBS和DCNBS同一氧化氮反应的灵敏度的浓度是0.15M。
在一氧化氮饱和的水中，一氧化氮的浓度是2.0mM。用去氧水稀释该一氧化氮溶液，得到反应混合物中最终浓度为0，0.25，0.5，1，2.5，5，10，50和100μM。将一氧化氮溶液加入DBNBS和DCNBS中，得到最终自旋捕集剂的浓度为0.15M。通过向自旋捕集剂溶液中加入0.5毫升去氧水，得到空白液(或零点)。将含有DBNBS的反应混合物温育50小时，含有DCNBS的温育20小时。从每一个光谱计算信/噪比。溶液的取出和加入都是使用气体密封的注射器进行。
从曲线的直线部分从0-10μM计算检测界限(信/噪比等于3)和定量界限(信/噪比等于10)。发现对于DCNBS，测量界限和定量界限各自为4.06μM和17.30μM。发现对于DBNBS，测量界限是0.23μM，定量界限是0.92μM。因此就一氧化氮来说，发现DBNBS是比DCNBS更加灵敏的自旋捕集剂，而发现DCNBS同一氧化氮的反应比DBNBS更快。氧化剂反应该研究使用来自肾衰竭患者的在不卧床连续腹膜透析(CAPD)中的渗析液。当更换渗析液袋时收集渗析液。
将10mM的DBNBS和DCNBS的溶液(5、8、12、25和30微升，最终浓度为0.5、0.8、1.2、2.5和3.0mM)加入到60微升的渗析液中。体积方面的区别在于PBS。将反应混合物彻底混合，在室温下温育25分钟后进行ESR光谱学分析。
当DBNBS和DCNBS同氧化剂反应时，获得典型的三线ESR信号。当DCNBS代替DBNBS时，观测到峰宽从0.495下降为0.306mT。在ESR光谱学中，峰宽的降低一般被认为是有利的，因为其可以导致灵敏度增加。
为了比较DBNBS和DCNBS的灵敏度，应当使用过量的自旋捕集剂。剂量反应实验表明在氧化剂系统中，DBNBS在最终额定浓度大约为1.2mM时达到过量，而DCNBS在最终额定浓度大约为2.5mM时达到过量。因此DBNBS和DCNBS的灵敏度各自在1.2mM和2.5mM时进行比较。发现它们获得了几乎一致的结果，即各自的信号/标志比(signal/marker ratios)为0.516和0.521。DCNBS具有的优点是其比DBNBS更易溶，所以DCNBS不会遇到浑浊问题。因此对于分析尿毒症患者渗析液中的氧化剂来说，DCNBS是优选的自旋捕集剂。
权利要求
1.一种下式的化合物或者其盐，其中X是Cl或CH3。
2. 3，5-二氯-4-亚硝基苯磺酸酯或者其盐。
3.根据权利要求2的化合物，所述化合物为3，5-二氯-4-亚硝基苯磺酸酯的钠盐。
4. 3，5-二甲基-4-亚硝基苯磺酸酯或者其盐。
5.根据前述权利要求任何一项的化合物，所述化合物被同位素标记。
6.根据权利要求5的化合物，其中同位素是2H或者15N。
7.根据前述权利要求任何一项的化合物作为自旋捕集剂的用途。
8.根据权利要求7的用途，用于分析亚硫酸根阴离子、尿毒症患者渗析液中的氧化剂、一氧化氮、烷基自由基或过氧化物。
9.根据权利要求7的用途，用于分析酶联免疫吸附试验中抗体-过氧化物酶配合物的存在。
10.根据权利要求7-9任何一项的用途，在分析中，其中通过电子自旋共振光谱学来检测基团。
全文摘要
一种右式的化合物或者其盐,其中X是Cl或CH
文档编号C12Q1/28GK1362405SQ0114544
公开日2002年8月7日 申请日期2001年12月12日 优先权日2000年12月12日
发明者L·汉密尔顿, P·G·温亚德 申请人:兰道克斯实验有限公司