专利名称：人宫颈癌2原癌基因及其编码的蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的原癌基因和编码该基因的蛋白质，更具体地，涉及人宫颈癌1原癌基因和源自该基因的蛋白质，其可用于诊断各种癌症。
背景技术：
较高等动物包括人每个携带约100,000个基因，但其中仅约15％被表达，并且各个生物学过程的特征依赖于表达的基因所决定，所述生物学过程如起源，分化，稳态，对刺激的反应，细胞分节运动的控制，老化和编程性细胞死亡(程序性细胞死亡)(参见Liang，P.和A.B.Pardee，Scienc，257967-.971(1992))。
致病现象如肿瘤发生是由基因突变引起的，基因的突变致使基因表达的方式发生了改变。因此，已在各种细胞中进行基因表达的比较研究，以提供建立可行方案的基础，以理解各种生物学现象。
例如，Liang和Pardee提出的mRNA差异显示(DD)方法在阐明肿瘤抑制基因、控制编程性细胞死亡的细胞周期相关基因和转录调节基因的性质方面是有效的(参见Liang，P.和A.B.Pardee，见上文)。而且，DD法已广泛用于研究细胞中各种细胞的相互关系。
已报道了肿瘤发生是由各种遗传改变引起的，所述遗传改变例如染色体杂合性的缺失，致癌基因的活化和肿瘤抑制基因如p53基因的失活(参见Bishop，J.M.，Cell，64235-248(1991)；和Hunter，T.，Cell，64249-270(1991))。另外，已报道了人10-30％的癌症是由于原癌基因的扩增导致致癌基因活化产生的。
因此，原癌基因的活化在很多肿瘤的病因学中扮演重要的角色，并且存在着鉴定原癌基因的需要。
本发明人已试图阐明在宫颈癌的肿瘤发生中涉及的机制；并且意外地发现了一种新的原癌基因—人宫颈癌2(HCCR-2)，在癌细胞中特异地过量表达。这个原癌基因可有效地用于诊断、预防和治疗各种癌症如白血病，淋巴瘤，结肠癌，乳腺癌，肾癌，胃癌，肺癌，卵巢癌和宫颈癌。
发明概述因此，本发明的主要目的是提供一种新的原癌基因和它的一种片段。
本发明的其它目的是提供包含所述原癌基因或它的一种片段的重组载体，和用该载体转化的微生物；所述原癌基因或它的片段编码的蛋白质；包含所述原癌基因或它的片段的诊断癌症的试剂盒；包含所述蛋白质或它的片段的诊断癌症的试剂盒；具有与所述原癌基因或其片段的序列互补的碱基序列的反义基因；和一种通过使用所述反义基因治疗或预防癌症的方法。
依据本发明的一个方面，提供了具有SEQ ID No1核苷酸序列的原癌基因或它的一种片段。
依据本发明的另一个方面，提供了包含所述原癌基因或它的一种片段的重组载体和用所述载体转化的微生物。
依据本发明的另一个方面，提供了衍生自所述原癌基因或它的片段的具有SEQ ID No2氨基酸序列的蛋白质或它的片段。
附图简述当结合附图，从本发明的下述描述中，本发明的上述和其它目的将变得明显，所述附图分别如下
图1DD鉴定在正常宫颈组织、原发性宫颈癌组织、转移性淋巴节组织和宫颈癌细胞系(CUMC-6)中的被改变的基因表达；图2在正常宫颈组织、宫颈癌组织和宫颈癌细胞系(CaSki和CUMC-6)中表达的HCCR-2基因的RNA印迹分析结果；图3A在正常人12-lane多样性组织中表达的HCCR-2基因的RNA印迹分析结果；图3B用图3A的相同的样品与β-肌动蛋白杂交获得的结果；图4A在人癌细胞系中表达的HCCR-2基因的RNA印迹分析结果；图4B用图4A的相同的样品与β-肌动蛋白杂交获得的结果；图5A在人肿瘤组织和它们的正常对应组织中表达的HCCR-2基因的RNA印迹分析结果；图5B用图5A的相同的样品与β-肌动蛋白杂交获得的结果；图6单层培养的野生型NIH/3T3细胞的相差特征；图7单层培养的HCCR-2-转染的NIH/3T3细胞(HCCR-2M细胞)的相差特征；图8单层培养的HCCR-2-转染的NIH/3T3细胞的苏木精-伊红染色；图9HCCR-2-转染的NIH/3T3细胞在裸鼠中的致瘤力；图10在裸鼠中，衍生自HCCR-2-转染的NIH/3T3细胞的皮下肿瘤结节的苏木精-伊红染色；图11单层培养的来自裸鼠的HCCR-2MN细胞的相差特征；图12表示IPTG诱导前后蛋白表达模式的十二烷基硫酸钠(SDS)-PAGE结果；图13未转染的NIH/3T3细胞(野生型)、用pcDNA3载体单独转染的NIH/3T3细胞(pcDNA3)和HCCR-2转染的NIH/3T3细胞(HCCR-2M细胞)的蛋白印迹分析结果；图14人肾、乳房、肺、卵巢和胃的肿瘤组织和它们的正常对应组织的蛋白印迹分析结果；图15A和15B在正常白细胞和人白血病细胞中表达的HCCR-2蛋白的免疫组织化学染色结果(×200)；图16A和6B在正常淋巴细胞和人淋巴瘤组织中表达的HCCR-2蛋白的免疫组织化学染色结果(×200)；图17A和17B在正常乳房组织和人乳腺癌中表达的HCCR-2蛋白的免疫组织化学染色结果(×200)；
图18A和18B在正常结肠组织和人结肠癌中表达的HCCR-2蛋白的免疫组织化学染色结果(×100)；图19A和19B在正常肾组织和人肾肿瘤组织中表达的HCCR-2蛋白的免疫组织化学染色结果(×100)；图20A和20B在正常宫颈组织和人宫颈癌组织中表达的HCCR-2蛋白的免疫组织化学染色结果(×100)；图21单层培养的野生型人胚肾293上皮细胞的相差特征；图22单层培养的HCCR-2转染的293上皮细胞(HCCR-2H细胞)的相差特征；图23单层培养的HCCR-2转染的293上皮细胞的苏木精-伊红染色；图24在裸鼠中，HCCR-2转染的293上皮细胞的致瘤力；图25在裸鼠中，衍生自HCCR-2转染的293上皮细胞的皮下肿瘤结节的苏木精-伊红染色；图26单层培养的来自裸鼠的HCCR-2HN细胞的相差特征；和图27野生型293上皮细胞和HCCR-2转染的293上皮细胞(克隆A，B，C，D和E)的RNA印迹分析结果。
发明详述本发明的新的原癌基因，即人宫颈癌2(下文为“HCCR-2原癌基因”)，由2003个碱基对组成，具有SEQ ID NO1的DNA序列。
在SEQ ID NO1中，相应于碱基号63-977的完全的开放阅读框是蛋白质编码区，衍生于此的推导的氨基酸序列示于SEQ ID NO2中，其由304个氨基酸组成(“HCCR-2蛋白”)。而且，SEQ ID NO1的321-380核苷酸表示的区域编码一个单独的跨膜结构域，其具有SEQ ID NO2的氨基酸号87-106的推导的氨基酸序列。这提示本发明的原癌基因是膜结合基因。
单一的潜在的N-糖基化位点(相应于SEQ ID NO1的碱基号831-839和SEQ ID NO2的氨基酸号257-259)存在于HCCR-2蛋白的C-末端，提示HCCR-2是II型膜蛋白。多腺苷酸化信号相应于SEQ ID NO1的核苷酸号1894-1898。
考虑到密码子的简并性和将用于表达本发明的原癌基因的具体动物中优选的密码子，可在例如它的编码区，在未不利地改变表达的蛋白质的氨基酸序列的条件下，或例如在非编码区，在未不利地影响原癌基因的表达的条件下，对SEQ ID NO1的DNA序列进行各种改变和修改。因此，在它的范围内，本发明还包含基本上具有与本发明的原癌基因相同的碱基序列的多核苷酸和它的片段。本文中使用的“基本上相同的多核苷酸”表示其碱基序列与本发明的原癌基因具有80％和更多，优选90％或更多，最优选95％或更多同源性的多核苷酸。
表达自本发明的原癌基因的蛋白质由304个氨基酸组成，具有SEQ IDNO2的氨基酸序列。该蛋白的分子量约为45kDa。然而，在未不利地影响该蛋白的功能的条件下，可对该蛋白的氨基酸残基进行各种取代，加成和/或缺失。此外，当实现一个具体的用途时，可使用该蛋白的一部分。这些被修饰的氨基酸和它们的片段也包含在本发明的范围内。因此，在它的范围内，本发明包含基本上具有与衍生自本发明的原癌基因(oncogene)的蛋白相同的氨基酸序列的多肽和它的片段。本文中使用的“基本上相同的多肽”表示其氨基酸序列与SEQ ID NO2的氨基酸序列具有80％和更多，优选90％或更多，最优选95％或更多同源性的多肽。
本发明的原癌基因或蛋白可获自人癌组织或用常规的DNA或肽合成方法来合成。此外，如此制备的基因可插入到常规的载体中，以获得一种表达载体，其反过来可被引入到一种合适的宿主中，所述宿主如微生物例如大肠杆菌(E.coli)或酵母，或一种动物细胞例如小鼠或人细胞。
被转化的宿主可随后用于大规模生产本发明的DNA或蛋白质。例如，用含本发明的HCCR-2基因的表达载体pCEV-LAC(Miki，T.等，Gene，83137-146(1989))(表示为HCCR-2/pCEV-LAC)转化大肠杆菌JM109，以获得大肠杆菌转化子，表示为JM109/HCCR2，为了专利程序，按照国际公认的微生物保藏的布达佩斯条约，其于1999年10月11日保藏于韩国典型培养物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures)(KCTC)(地址韩国生物科学和生物技术研究所(Korea Research Institute ofBioscience and Biotechnology)(KRIBB)，#52，Oun-dong，Yusong-ku，大田，305-333，韩国)，保藏号为KCTC 0668BP。
在制备载体过程中，依据使用的宿主细胞，适当地选择表达控制序列如启动子，终止子，自我复制序列和分泌信号。
本发明的原癌基因的超表达不发生在正常的子宫颈组织，而是发生在宫颈癌组织和宫颈癌细胞系中。这提示本发明的原癌基因诱导宫颈癌。此外，当用本发明的原癌基因转染正常的成纤维细胞如NIH/3T3细胞系时，产生了异常细胞。光学和电子显微镜的形态学特征显示异常细胞具有肿瘤细胞的形状。
当将用本发明的原癌基因转染的正常成纤维细胞注射到裸鼠的后侧面时，注射后约21天观察到肿瘤生成，在40天内肿瘤大小变成1cm×1cm。通过利用苏木精-伊红染色方法，可证实肿瘤细胞是癌性的。
除了上皮组织如宫颈癌组织，在各种其它癌症肿瘤如白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肾癌、卵巢癌、肺癌和胃癌中同样观察到了本发明原癌基因的超表达。因此，认为本发明的原癌基因是所有形式的各种癌症共有的因子，它可有利地用于诊断各种癌症和被转化动物的生产以及用于反义基因治疗。
利用本发明的原癌基因实施的诊断方法可包含，例如，用含本发明的原癌基因或它的片段的探针与分离自受试者体液的核酸杂交，和通过使用本领域中的常规检测方法确定所述受试者是否具有原癌基因的步骤。通过用放射性同位素或酶标记探针可容易地检测原癌基因的存在。因此，包含本发明的原癌基因或它的片段的癌症诊断试剂盒同样包含在本发明的范围内。
通过将本发明的原癌基因引入到哺乳动物而产生的转化的动物如大鼠也包含在本发明的范围内。在产生这种转化动物过程中，优选在第8细胞周期前将本发明的原癌基因引入到动物的受精卵中。被转化的动物可有利地用于筛选致癌物质或抗癌剂如抗氧化剂。
本发明还提供了一种用于基因治疗的反义基因。本文中使用的术语“反义基因”表示包含完全或部分互补于转录自原癌基因或它的片段的mRNA的序列的碱基序列的多核苷酸，所述原癌基因具有SEQ ID NO1的碱基序列，所述多核苷酸能通过将其附着到mRNA的蛋白质结合位点而防止原癌基因的开放阅读框(ORF)的表达。
在本发明的范围内还包含一种通过向受试者给药治疗有效量的本发明的反义基因来在受试者中治疗或预防癌症。
在本发明的反义基因治疗过程中，以常规的方式将本发明的反义基因对受试者给药，以防止原癌基因的表达。例如，依据Kim，J.S.等公开的方法(J.Controlled Release，53175-182(1998))，通过静电相互作用将反义ODN与疏水的聚-L-赖氨酸混合，并将得到的混合的反义ODN对受试者静脉内给药。
在本发明的范围内还包括一种抗癌组合物，其包含作为活性成分的本发明的反义基因，以及药用载体，如果需要，可包含赋形剂或其它添加剂。优选以适于注射给药的形式配制本发明的药物组合物。
依据各种相关因素来确定反义基因实际给药的量，所述因素包括治疗的疾病，给药的选择途径，个体患者的年龄和体重，和患者症状的严重程度。
表达自本发明的原癌基因的蛋白质可用于生产用作诊断工具的抗体。通过使用具有SEQ ID NO2的氨基酸序列或它的片段的蛋白质，依照本领域中熟知的任何方法，可将本发明的抗体制成单克隆抗体或多克隆抗体的形式。利用本领域中任何已知的方法如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、夹心分析法、免疫组织化学染色法、在聚丙稀凝胶上进行蛋白印迹或免疫测定印迹来进行癌症诊断，以评估是否该蛋白质在受试者的体液中表达。因此，包含具有SEQ ID NO2的氨基酸序列或它的片段的蛋白质的癌症诊断试剂盒也包含在本发明的范围内。
可通过使用本发明的原癌基因建立连续的能生存的癌细胞系，这种细胞系可获自例如在裸鼠背部形成的肿瘤组织，所述肿瘤组织是通过注射用本发明的原癌基因转化的成纤维细胞而形成的。如此制备的细胞系可有利地用于寻找抗癌试剂。
提供的下述实施例和试验实施例仅是为了解释，而不是意图限制本发明的范围。实施例1mRNA的差异显示(步骤1)总RNA的分离正常的外宫颈组织是在子宫切除过程中从子宫肌瘤患者获得的，未处理的原发宫颈癌和转移性普通骼骨淋巴结组织样品是在根治性子宫切除过程中获得的。在Waymouth MB 751/1培养基中培养人宫颈癌细胞系CUMC-6(Kim JW等，Gynecol Oncol，62230-240(1996))。
利用商售体系(RNeasy总RNA试剂盒，Qiagen Inc.，德国)从组织样品和细胞中提取总RNA，并利用信息清除试剂盒(Message clean kit)(GenHunter Corp.，Brookline，MA)从中去除DNA污染物。(步骤2)差异显示按照Liang等(Science，257967-971(1992)；和Cancer Res.，526966-6968(1992))的方法，如下进行较小的改动进行差异显示。
使用SEQ ID NO3的引物，将0.2μg步骤1中获得的每个总RNA进行反转录，所述引物作为锚定寡-dT引物(RNAimage试剂盒，GenHunter)，然后进行聚合酶链式反应(PCR)，所述PCR使用相同的锚定引物和任意5’13mer(RNAimage引物对1，H-AP 1-32)，在存在0.5mM[α-35S]-标记的dATP(1200Ci/mmol)的条件下进行。重复PCR热循环40次，每个循环为95℃40秒，40℃2分钟，72℃40秒，最后在72℃进行反应5分钟。将如此获得的PCR产物在6％聚丙稀酰胺测序凝胶上电泳，然后放射自显影。
图1表示使用锚定寡-dT引物H-T11C(SEQ ID NO5)和SEQ ID NO3的任意5’13mer，正常外宫颈组织、宫颈癌组织、转移性组织和宫颈癌细胞系CUMC-6的差异显示结果，其中箭头表示206bp片段，表示为CC214，在宫颈癌和转移性普通骼骨淋巴结组织和人宫颈癌细胞系CUMC-6中表达。
从干燥的测序凝胶切除片段CC214条带，并在水中煮沸15分钟，以洗提片段CC214。除了去除[α-35S]-标记的dATP和20μM dNTPs以外，使用相同的条件进行PCR扩增CC214。使用TA克隆体系(普洛麦格，美国)将扩增的片段CC214克隆到pGEM-T Easy载体中，并使用测序酶2.0版本DNA测序体系(美国生物化学公司(United States Biochemical Co.，)，美国)确定其核苷酸序列。使用BLAST和FASTA程序进行片段CC214的核苷酸序列与GenBank数据库的比较分析，结果表明，该片段具有与GenBank数据库中登记的任何核苷酸序列很小的相似性。实施例2cDNA文库筛选用32P-标记的随机引发的CC214 cDNA探针通过噬菌斑杂交筛选噬菌体λgtll人肺胚成纤维细胞cDNA文库(由韩国汉城的Hanyang大学的IYChung教授慷慨提供)(Sambrook，J.等.，Molecular CloningA laboratorymanual，纽约Cold Spring Harbor Laboratory(1989))，以获得全长cDNA克隆(表示为HCCR-2)。确定全长HCCR-2cDNA的核苷酸序列。
全长HCCR-2cDNA克隆包含2003bp具有SEQ ID NO1核苷酸序列的插入片段，相应于碱基号63-977的完全开放阅读框为蛋白编码区，衍生于此的推导的氨基酸序列示于SEQ ID NO2中，由304个氨基酸组成。此外，SEQ ID NO1的核苷酸号321-380表示的区域编码单一的跨膜结构域，其具有SEQ ID NO2的氨基酸号87-106的推导的氨基酸序列。这提示本发明的原癌基因是膜结合基因。
单一潜在的N-糖基化位点(相应于SEQ ID NO1的碱基号831-839和SEQ ID NO2的氨基酸号257-259)存在于HCCR-2蛋白的C-末端，这提示HCCR-2是II型膜蛋白。多腺苷酸化信号相应于SEQ ID NO1的核苷酸号1894-1898。
全长HCCR-2cDNA克隆的核苷酸序列在GenBank中登记，登记号为AF315598。
将全长HCCR-2cDNA插入到载体pCEV-LAC(Miki，T.等.，Gene，83137-146(1989))中以获得重组载体HCCR-2/pCEV-LAC，用重组载体HCCR-2/pCEV-LAC转化大肠杆菌JM109以获得被转化的大肠杆菌JM109/HCCR2，其于1999年10月11日保藏于韩国典型培养物保藏中心(地址#52，Oun-dong，Yusong-ku，大田305-333，韩国)，保藏号为KCTC0668BP。实施例3RNA印迹分析为确定HCCR-2基因在各种正常组织，癌症组织和癌细胞系中的表达水平，如下进行RNA印迹分析。
通过重复实施例1的步骤1的程序，从正常外宫颈组织、原发宫颈癌组织；和人宫颈癌细胞系(ATCC CRL 1550)和CUMC-6中制备总RNA。变性20μg每种总RNA，然后通过1％甲醛琼脂糖凝胶电泳，并转移到尼龙膜(Boehringer-Mannheim，德国)上。于42℃用32P-标记的随机引发的HCCR-2cDNA探针过夜杂交斑点，所述探针用rediprime II随机引物标记系统(Amersham，英格兰)制备。始终如一地重复RNA印迹分析结果两次，通过光密度测定法量化，并用β-肌动蛋白探针杂交相同的斑点以证实mRNA的完整性。
使用正常人12多样性组织(Clontech)和人癌症细胞系(Clontech)，如供应商所推荐的方法同样进行RNA印迹分析。
图2表示使用HCCS-1cDNA探针，正常宫颈组织，原发宫颈癌组织和宫颈癌细胞系CUMC-6和CaSki的RNA印迹分析结果；和用β-肌动蛋白探针杂交相同的斑点的RNA印迹分析结果。从图2可以看出，在宫颈癌组织和宫颈癌细胞系中HCCR-2基因的表达水平提高，但在所有正常宫颈组织中几乎不表达。
图3A表示使用HCCR-2cDNA探针，正常人组织，即脑，心脏，骨骼肌，结肠，胸腺，脾，肾，肝脏，小肠，胎盘，肺和外周血白细胞的RNA印迹分析结果；和图3B表示用β-肌动蛋白探针杂交相同的斑点。从图3A中可以看出，在很多正常组织少量地存在或不存在HCCR-2mRNA(～2.0kb)，但在正常肾组织中表达水平却是高的。
图4A表示使用HCCR-2cDNA探针，表达HCCR-2基因的人白血病和淋巴瘤细胞系即早幼粒细胞白血病HL-60，HeLa宫颈癌细胞，慢性骨髓性白血病K-562细胞，原淋巴细胞白血病MOLT-4细胞，Burkitt’s淋巴瘤Raji细胞，SW480结肠癌细胞，A549肺癌细胞和G361黑素瘤细胞的RNA印迹分析；和图4B表示用β-肌动蛋白探针杂交相同的斑点。从图4A和4B中可以看出，HCCR-2在人白血病和淋巴瘤细胞系如慢性骨髓性白血病K562，Burkitt’s淋巴瘤Raji，原淋巴细胞白血病MOLT-4细胞和早幼粒细胞白血病HL-60以及HeLa中被高水平转录。
特别是，与正常白细胞相比，K-562，MOLT-4和HL-60显示更高的转录水平，分别约为190，90和70。HCCR-2在结肠直肠癌SW480，肺癌A549和黑素瘤G361细胞系中的表达水平比在白血病和淋巴瘤中的表达水平低。
此外，进行人肾癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌和胃癌组织和它们的正常对应组织的RNA印迹分析。如图5A所示，HCCR-2在人癌细胞中以高水平转录，而在正常细胞中几乎观察不到HCCR-2基因的表达。图5B表示用β-肌动蛋白探针杂交相同的样品以证实mRNA完整性获得的结果。实施例4表达载体的构建和动物细胞的转化(步骤1)制备含HCCR-2的载体如下构建含HCCR-2编码区的表达载体。
首先，将实施例2中获得的完整的HCCR-2cDNA插入到原核表达载体pCEV-LAC的SalI限制位点(参见Miki，T.等，Gene，83137-146(1989))。然后，从pCEV-LAC/HCCR-2载体中分离SalI片段。
然后，用XhoI消化pcDNA3(Invitrogen)，产生与SalI一致的末端。将含全长HCCR-2编码序列的SalI片段插入到XhoI消化的pcDNA3中。脂转染胺(Gibco BRL)用于将得到的pcDNA3/HCCR-2表达载体引入到NIH/3T3细胞(ACTC CRL，1658，美国)，然后在补充以G418(Gibco)的培养基中筛选。获得的用HCCR-2转染的NIH/3T3细胞表示为“HCCR-2M细胞”。制备另一个单独含pcDNA3的NIH/3T3细胞群作为对照，并表示为“pcDNA3细胞”。(步骤2)用HCCR-2原癌基因转染的NIH/3T3成纤维细胞野生型正常NIH/3T3细胞，一种分化的成纤维细胞系，是具有长纤细核和稀疏量的细胞质的纺锤形细胞，如图6所示。当HCCR-2在获自步骤1的表达HCCR-2的NIH/3T3(HCCR-2M细胞)中表达时，细胞形状变成具有卵圆形核和饱满细胞质的多边形，如图7所示。
用苏木精-伊红染色的单层培养的HCCR-2转染的NIH/3T3细胞显示核多态性，独特的核，粒状的染色质模式，肿瘤巨细胞和非典型有丝分裂特征，如图8所示。实施例5HCCR-2M细胞在动物中的致瘤力为分析致瘤力，5×106HCCR-2转染的NIH/3T3细胞(HCCR-2M细胞)皮下注射到10只小鼠(5周龄的无胸腺nu/nu BALB/c小鼠)躯干后侧面。当皮下肿瘤直径达到1.5-2.5cm时处死裸鼠。
所有用HCCR-2M细胞注射的10只小鼠29天后显示明显的肿瘤，如图9所示。
具有HCCR-2M异源移植的裸鼠显示上皮癌的特征。图10显示采自裸鼠的皮下肿瘤结节的苏木精-伊红染色结果。肿瘤结节切面显示由纤维基质分离的典型的上皮细胞巢。实施例6从HCCR-2M细胞诱导的肿瘤组织中建立新的癌细胞系使用2％胎牛血清，以常规的方式培养获自实施例5的肿瘤组织的细胞，将培养的细胞表示为HCCR-2MN细胞，其在体外具有与HCCR-2M相似的细胞学特征，如图11所示。实施例7确定用HCCR-2原癌基因转染大肠杆菌后表达的蛋白的大小将SEQ ID NO1的全长HCCR-2原癌基因插入到pET-32b(+)载体(Novagen)的多克隆位点，并将得到的pET-32b(+)/HCCR-2载体转染到大肠杆菌BL21(ATCC 47092)中。在旋转摇动的培养箱中用LB肉汤培养基培养被转染的大肠杆菌，所述大肠杆菌被稀释100倍，培养3小时。向其中加入1mM异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，Sigma)以诱导蛋白质的合成。
在IPTG诱导前后，用超声波破碎培养的大肠杆菌细胞，并用12％十二烷基硫酸钠(SDS)进行凝胶电泳。图12表示SDS-PAGE结果，其显示用pET-32b(+)/HCCR-2载体转染的大肠杆菌BL21菌株的蛋白表达模式。IPTG诱导后，在约45kDa处发现明显的蛋白条带。这个45kDa融合的蛋白质包含由pET-32b(+)载体中的基因表达的约20kDa的Trix-Tag硫氧还蛋白。实施例8抗体的产生使用His-Bind试剂盒(Novagen)纯化分离自实施例7中用pET-32b(+)/HCCR-2载体转染的大肠杆菌BL21菌株的45kDa融合蛋白质。纯化肽的免疫印迹证实存在大量的45kDa蛋白质。
然后，两只6周龄的Sprague-Dawley大鼠，每只重约150g，用1mg如此获得的肽皮下免疫，每周3次。从免疫的大鼠中采血样，并离心以获得多克隆血清。通过酶联免疫吸附测定(1∶10,000)测定并证实多克隆血清的抗HCCR-2活性。实施例9证实抗体特异性的免疫印迹为了蛋白印迹分析，按照Laemmli描述的方法(Nature，227680-685(1970))，收获在实施例7中鉴定的细胞，并在Laemmli样品缓冲剂中裂解。通过10％SDS-PAGE分离细胞蛋白，然后电印迹到硝酸纤维素膜上。用实施例8中制备的大鼠多克隆抗HCCR-2血清孵育膜16小时。洗涤后，用封闭液孵育膜，所述封闭液包含作为次级抗体的1∶1,000稀释的结合过氧化物酶的羊抗大鼠免疫球蛋白的(JacksonImmunoResearch)。用ECL-蛋白印迹检测试剂盒(Amersham)展示蛋白质。
如图13所示，HCCR-2蛋白在HCCR-2细胞中超表达，而野生型和单独用载体(pcDNA3)转染的细胞仅观察到的微弱的条带。这个结果说明多克隆血清中抗HCCR-2抗体的特异性。
此外，多克隆血清中HCCR-2抗体识别来自人不同组织的蛋白提取物中约45kDa的蛋白质。如图14所示，当与它们的正常对应物相比，人肿瘤组织包括肾癌、胸腺癌、肺癌、卵巢癌和胃癌显示增加的HCCR-2蛋白表达。实施例10免疫组织化学染色为确定HCCR-2蛋白在各种正常组织和癌症组织中的表达水平，按照抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶络合物方法(Hsu，S.M.等.，HistochemCytochem，29577-580(1981))如下进行免疫组织化学染色。
用二甲苯使石蜡包埋的组织脱蜡，用分级的乙醇处理，去除石蜡后再水合，并用水洗涤。然后，将组织置于用过氧化氢制得的过氧化物猝灭溶液30分钟，以去除内源过氧化物酶活性，用血清封闭溶液(ZymedLaboratories，CA，美国)处理30分钟以封闭非特异性结合，用初级抗体处理，置于4℃过夜，用磷酸盐缓冲的盐水(PBS)洗涤，用生物素化的次级抗体(Zymed)处理30分钟，并用PBS洗涤。然后，用酶交联物处理组织30分钟，用PBS洗涤，用氨乙基咔唑(Zymed)作为色原处理18分钟。然后，用苏木精复染色组织部分。
图15表示正常白细胞(A)和白血病细胞(B)的免疫组织化学染色结果。正常白细胞表现阴性强度表达，白血病细胞表现强阳性强度表达。
图16表示正常淋巴细胞(A)和淋巴瘤组织(B)的免疫组织化学染色结果。在细胞质中，正常淋巴细胞表现阴性强度表达，淋巴瘤组织表现强阳性强度表达。
图17表示正常乳房组织(A)和乳房肿瘤组织(B)的免疫组织化学染色结果。在细胞质中，正常乳房组织表现阴性强度表达，乳房肿瘤组织表现强阳性强度表达。
图18表示正常结肠组织(A)和结肠癌组织(B)的免疫组织化学染色结果。在细胞质中，正常结肠组织表现阴性强度表达，结肠癌组织表现强阳性强度表达。
图19表示正常肾组织(A)和肾癌组织(B)的免疫组织化学染色结果。在细胞质中，正常肾组织表现阴性强度表达，淋巴瘤组织表现强阳性强度表达。
图20表示正常宫颈组织(A)和宫颈癌组织(B)的免疫组织化学染色结果。正常宫颈组织部分表现阴性强度表达，宫颈癌组织表现强阳性强度表达。实施例11构建表达载体和转化人细胞(步骤1)制备含HCCR-2的载体如下构建含HCCR-2编码区的表达载体。
首先，将实施例2中获得的完整HCCR-2cDNA插入到原核表达载体pCEVIs LAC(参见Miki，T.等.，Gene，83137-146(1989))的SalI限制位点。然后，从pCEV-LAC/HCCR-2载体中分离SalI片段。
然后，用XhoI消化pcDNA3(Invitrogen)以制成与SalI一致的末端。将含全长HCCR-2编码序列的SalI片段插入到插入到XhoI消化的pcDNA3中。脂转染胺(Gibco BRL)用于将得到的pcDNA3/HCCR-2表达载体引入到人胚肾293上皮细胞(ACTC CRL，1573，美国)，然后在补充以G418(Gibco)的培养基中筛选。获得的用HCCR-2转染的293上皮细胞表示为“HCCR-2H细胞”。(步骤2)用HCCR-2原癌基因转染293上皮细胞野生型人胚肾293上皮细胞，一种分化的成纤维细胞，是具有长纤细核和稀疏量的细胞质的纺锤形细胞，如图21所示。当HCCR-2在获自步骤1的表达HCCR-2的293上皮细胞(HCCR-2H细胞)中表达时，细胞形状变成具有卵圆形核和饱满细胞质的多边形，如图22所示。
用苏木精-伊红染色的单层培养的HCCR-2转染的293上皮细胞显示核多态性，独特的核，粒状的染色质模式，肿瘤巨细胞和非典型有丝分裂特征，如图23所示。实施例12HCCR-2H原癌基因在动物中的致瘤力为分析致瘤力，5×106HCCR-2转染的人胚肾293上皮细胞(HCCR-2H细胞)皮下注射到10只小鼠(5周龄的无胸腺nu/nu BALB/c小鼠)躯干后侧面。当皮下肿瘤直径达到1.5-2.5cm时处死裸鼠。
所有用HCCR-2H细胞注射的10只小鼠20天后显示明显的肿瘤，如图24所示。
具有HCCR-2H异源移植的裸鼠显示上皮癌的特征。图25显示采自裸鼠的皮下肿瘤结节的苏木精-伊红染色结果。肿瘤结节部分显示由纤维基质分离的典型的上皮细胞巢。实施例13从HCCR-2H细胞诱导的肿瘤组织中建立新的癌症细胞系使用2％胎牛血清，以常规的方式培养获自实施例12的肿瘤组织的细胞，将培养的细胞表示为HCCR-2HN细胞，其在体外具有与HCCR-2H相似的细胞学特征，如图26所示。
此外，对野生型293上皮细胞和HCCR-2转染的293上皮细胞进行RNA印迹分析(克隆A，B，C，D和E)。如图27所示，在所有5个克隆中，HCCR-2均高水平转录，而在野生型293上皮细胞中几乎观察不到HCCR-2基因的表达。
尽管已对本发明的实施方案进行了描述和解释，但很明显，可在未脱离本发明的精神条件下，可对其进行各种改变和修改，本发明仅由后附的权利要求的范围所限定。
微生物国际保藏和存活证明(译文)
序列表<110>金振宇<120>人宫颈癌2原癌基因及其编码的蛋白质<130>KJW-0613<160>6<170>KOPATIN 1.5<210>1<211>2003<212>DNA<213>Homo sapiens<220><221>CDS<222>(63)..(974)<220><221>misc_feature<222>(321)..(380)<223>单一跨膜结构域<400>1gatggcgctc tccagggtct tcaaagcttc acctttctcc aaaggcagat gtgaagaact 60tg atg tct tat gtg gta acc aag aca aaa gcg att aat ggg aaa 104Met Ser Tyr Val Val Thr Lys Thr Lys Ala Ile Asn Gly Lys1 5 10tac cat cgt ttc ttg ggt cgt cat ttc ccc cgc ttc tat gtc ctg tac 152Tyr His Arg Phe Leu Gly Arg His Phe Pro Arg Phe Tyr Val Leu Tyr15 20 25 30aca atc ttc atg aaa gga ttg cag atg tta tgg gct gat gcc aaa aag 200Thr Ile Phe Met Lys Gly Leu Gln Met Leu Trp Ala Asp Ala Lys Lys35 40 45gct aga aga ata aag aca aat atg tgg aag cac aat ata aag ttt cat 248Ala Arg Arg Ile Lys Thr Asn Met Trp Lys His Asn Ile Lys Phe His50 55 60caa ctt cca tac cgg gag atg gag cat ttg aga cag ttc cgc caa gac 296Gln Leu Pro Tyr Arg Glu Met Glu His Leu Arg Gln Phe Arg Gln Asp65 70 75gtc acc aag tgt ctt ttc cta ggt att att tcc att cca cct ttt gcc 344Val Thr Lys Cys Leu Phe Leu Gly Ile Ile Ser Ile Pro Pro Phe Ala80 85 90aac tac ctg gtc ttc ttg cta atg tac ctg ttt ccc agg caa cta ctg 392Asn Tyr Leu Val Phe Leu Leu Met Tyr Leu Phe Pro Arg Gln Leu Leu95 100 105 110atc agg cat ttc tgg acc cca aaa caa caa act gat ttc tta gat atc 440Ile Arg His Phe Trp Thr Pro Lys Gln Gln Thr Asp Phe Leu Asp Ile115 120 125tat cat gct ttc cgg aag cag tcc cac cca gaa att att agt tat tta 488Tyr His Ala Phe Arg Lys Gln Ser His Pro Glu Ile Ile Ser Tyr Leu130 135 140gaa aag gtc atc cct ctc att tct gat gca gga ctc cgg tgg cgt ctg 536Glu Lys Val Ile Pro Leu Ile Ser Asp Ala Gly Leu Arg Trp Arg Leu145 150 155aca gat ctg tgc acc aag ata cag cgt ggt acc cac cca gca ata cat 584Thr Asp Leu Cys Thr Lys Ile Gln Arg Gly Thr His Pro Ala Ile His160 165 170gat atc ttg gct ctg aga gag tgt ttc tct aac cat cct ctg ggc atg 632Asp Ile Leu Ala Leu Arg Glu Cys Phe Ser Asn His Pro Leu Gly Met175 180 185 190aac caa ctc cag gct ttg cac gtg aaa gcc ttg agc cgg gcc atg ctt 680Asn Gln Leu Gln Ala Leu His Val Lys Ala Leu Ser Arg Ala Met Leu195 200 205ctc aca tct tac ctg cct cct ccc ttg ttg aga cat cgt ttg aag act 728Leu Thr Ser Tyr Leu Pro Pro Pro Leu Leu Arg His Arg Leu Lys Thr210 215 220cat aca act gtg att cac caa ctg gac aag gct ttg gca aag ctg ggg 776His Thr Thr Val Ile His Gln Leu Asp Lys Ala Leu Ala Lys Leu Gly225 230 235att ggc cag ctg act gct cag gaa gta aaa tcg gct tgt tat ctc cgt 824Ile Gly Gln Leu Thr Ala Gln Glu Val Lys Ser Ala Cys Tyr Leu Arg240 245 250ggc ctg aat tct acg cat att ggt gaa gat agg tgt cga act tgg ctg 872Gly Leu Asn Ser Thr His Ile Gly Glu Asp Arg Cys Arg Thr Trp Leu255 260 265 270gga gaa tgg ctg cag att tcc tgc agc ctg aaa gaa gct gag ctg tct 920Gly Glu Trp Leu Gln Ile Ser Cys Ser Leu Lys Glu Ala Glu Leu Ser275 280 285ctc ttg ctg cac aac gtg gtc ctg ctc tcc acc aac tac ctt ggg aca 968Leu Leu Leu His Asn Val Val Leu Leu Ser Thr Asn Tyr Leu Gly Thr290 295 300agg cgctgaatg aaccatggag cggatggcat tgtcctgcag tcgtatagta 1020Arg Argtagcagtgca ggaacaaaca gcacttgcca gcaaagtctg tgtgtactgt taagtgtgtg 1080ggaggcagag agaggagcag gggccatggg cttcacagca tggcacacct gtgggaactg 1140cagacattcc tctcacagct agaactgaaa caaaccctct tgctaggggt ggtccgtgtg 1200aggtgtcatc ctgtccccct cataattact aatagctgga actggcagca gcctctactg 1260ggcttttact gtgatgtgtt cagttcatgt cctaggaagt cagcttttgc cccaggtggg 1320aatccttatt tggcttagga ctgatccact tccatgttac ttacatctgt gggtttttgt 1380tgttgctgtt agaaaatttt tggctggtga aaacagcact cctttggctg gagcacttgt 1440gtccatgcat gtacttgggt gtttccctcc atcctttctg atatgaccaa aaatcaagtt 1500gttttgtttt ttgtcacctt cactggcatg ggctaaccac ttctttttca aaccctctga 1560acaccttttt ctgatgggta acttgcagga atattctatt ggaaaagata acaggaagta 1620caagtgcttc ttgacccctt cctcaatgtt tctagccttc actctccatt gtcttttctg 1680ggctgtatta cagccctctg tggatcttca actctgctgc ctccactgtg atgcagcagt 1740ccaactgtaa ctgacagtgg ctgccttctc tgggccatgg atcacacctg taaggtacta 1800attactgccc agcctgggga gatcaggaga ggtctgcata gttagtaagt tgggtttagc 1860ttttgtgtgt gcatcagtga cttagagttc tgtaataact tattgtaaat gcatgaagca 1920ctgtttttaa acccaagtaa agactgcttg aaacctgttg atggaaaaaa aaaaaaaaaa 1980aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 2003<210>2<211>304<212>PRT<213>人类<400>2Met Ser Tyr Val Val Thr Lys Thr Lys Ala Ile Asn Gly Lys Tyr His1 5 10 15Arg Phe Leu Gly Arg His Phe Pro Arg Phe Tyr Val Leu Tyr Thr Ile20 25 30Phe Met Lys Gly Leu Gln Met Leu Trp Ala Asp Ala Lys Lys Ala Arg35 40 45Arg Ile Lys Thr Asn Met Trp Lys His Asn Ile Lys Phe His Gln Leu50 55 60Pro Tyr Arg Glu Met Glu His Leu Arg Gln Phe Arg Gln Asp Val Thr65 70 75 80Lys Cys Leu Phe Leu Gly Ile Ile Ser Ile Pro Pro Phe Ala Asn Tyr85 90 95Leu Val Phe Leu Leu Met Tyr Leu Phe Pro Arg Gln Leu Leu Ile Arg100 105 110His Phe Trp Thr Pro Lys Gln Gln Thr Asp Phe Leu Asp Ile Tyr His115 120 125Ala Phe Arg Lys Gln Ser His Pro Glu Ile Ile Ser Tyr Leu Glu Lys130 135 140Val Ile Pro Leu Ile Ser Asp Ala Gly Leu Arg Trp Arg Leu Thr Asp145 150 155 160Leu Cys Thr Lys Ile Gln Arg Gly Thr His Pro Ala Ile His Asp Ile
165 170 175Leu Ala Leu Arg Glu Cys Phe Ser Asn His Pro Leu Gly Met Asn Gln180 185 190Leu Gln Ala Leu His Val Lys Ala Leu Ser Arg Ala Met Leu Leu Thr195 200 205Ser Tyr Leu Pro Pro Pro Leu Leu Arg His Arg Leu Lys Thr His Thr210 215 220Thr Val Ile His Gln Leu Asp Lys Ala Leu Ala Lys Leu Gly Ile Gly225 230 235 240Gln Leu Thr Ala Gln Glu Val Lys Ser Ala Cys Tyr Leu Arg Gly Leu245 250 255Asn Ser Thr His Ile Gly Glu Asp Arg Cys Arg Thr Trp Leu Gly Glu260 265 270Trp Leu Gln Ile Ser Cys Ser Leu Lys Glu Ala Glu Leu Ser Leu Leu275 280 285Leu His Asn Val Val Leu Leu Ser Thr Asn Tyr Leu Gly Thr Arg Arg290 295 300<210>3<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>任意引物<400>3aagctttctc tgg 13<210>4<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>H-T11G锚定的寡-dT引物<400>4aagttttttt tttttg 16<210>5<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>H-T11C锚定的寡-dT引物<400>5aagctttttt tttttc 16<210>6<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>H-T11A锚定的寡-dT引物<400>6aagctttttt ttttta 1权利要求
1.一种人宫颈癌2原癌基因，其具有SEQ ID NO1的碱基序列或它的一种片段。
2.权利要求1的原癌基因的片段，其具有相应于SEQ ID NO1的碱基63-977的碱基序列。
3.一种具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白质或它的一种片段。
4.一种包含权利要求1的原癌基因或片段的载体。
5.一种用权利要求4的载体转化的微生物。
6.权利要求5的微生物，其是大肠杆菌JM109/HCCR2(保藏号KCTC0668BP)。
7.一种制备权利要求3的蛋白质或片段的方法，其包含培养权利要求5或6的微生物的步骤。
8.一种诊断癌症的试剂盒，其包含权利要求1或2的原癌基因或片段。
9.一种诊断癌症的试剂盒，其包含权利要求3的蛋白质或片段。
10.一种反义基因，其具有与转录自权利要求1或2的原癌基因或片段的全部或部分mRNA的序列互补的碱基序列，并且能结合该mRNA以抑制所述原癌基因或片段的表达。
11.一种预防或治疗癌症的组合物，其包含治疗有效量的权利要求10的反义基因和一种药学上可接受的载体。
全文摘要
一种具有SEQ ID NO1的碱基序列或它的一个片段的人宫颈癌2原癌基因，其在各种癌症组织中超表达，并且可用于诊断各种癌症，和与其互补的反义基因，可用于治疗癌症。
文档编号C12N1/19GK1476478SQ01819447
公开日2004年2月18日 申请日期2001年7月9日 优先权日2000年11月28日
发明者金振宇 申请人:金振宇