专利名称：转基因植物及其制品的检测方法
技术领域：
本发明属于转基因植物安全管理技术领域和生物技术领域，具体涉及转基因植物及其制品的快速检测方法。
背景技术：
1、转基因植物的安全管理转基因植物(transgenic plant)是指人为地通过一定方法将外源基因转移到植物的基因组中，并遗传、表达的植物变异体，被转入植物基因组的外源基因称为转化基因(transgene)。
1983年人类首次报道转基因烟草诞生，到2000全球转基因植物种植面积达4420万公顷。转基因植物从诞生之日起，就有人担心它们可能存在的生态和食品安全问题，这些担心曾受到一些研究结果的支持。为了加强对转基因生物的管理，避免其可能带来的生态、食品威胁，保护消费者权益，保证转基因植物研究正常发展，许多国际组织、国家和地区都制定了相应的法律、法规。这些法律、法规的实施，首先要求相关职能部门、研究机构在实施管理时，对有关植物及其产品进行检测、鉴定。建立一套通用的，快速、准确、经济、方便地检测鉴定技术，是当前国内外的一个研究热点。
2、转基因植物检测技术的发展和存在的问题迄今，转基因植物的检测主要限于目的基因检测，报告或标记基因检测。目的基因即赋予植物有用性状的功能基因，如抗病、抗虫、抗除草剂基因等，目前在研的目的基因数以万计，而且每天都在增加，涉及植物种类超过100种。截止2001年12月，仅美国FDA批准产业化的51种转基因植物所含目的基因就超过65种；截止1999年12月，我国农业部共批准150多项转基因植物进入商品化生产、环境释放或中间试验，涉及基因约103种。报告或标记基因是为了方便筛选和鉴别转基因植物而采用的植物基因组没有的外源基因，常用的报告或标记基因约20种，如nos、NPTII、GUS、GFP、bar基因等。在具体检测方法上，又有四个层次(1)DNA的分子杂交(Southern杂交)、聚合酶链式反应(PCR)等分析技术，用以探测目标基因存在状况，PCR技术因简便易行而用得最多。但过去人们主要针对目的基因、报告或标记基因，其局限性是，如果一个具体植物不知道研究者导入何种基因，如果一种制品含有多种植物成分，用上述方法将带有很大的盲目性，要花较长的时间才能确定它(们)是否转基因植物或制品。
(2)RNA的分子杂交(Northern杂交)、反转录PCR(RT-PCR)等分析技术，用以探测目标基因在RNA水平的表达状况，其缺陷与上述相同，而且检测样品必需是鲜活的植物材料，无法检测干枯、死亡材料和以植物为原料各种制品。
(3)蛋白质的ELISA、Western blot等分析技术，利用抗体-抗原之间的免疫反应来分析基因在蛋白质水平上的表达状况，其不足是，如果一个具体植物不知道研究者导入何种基因，如果一种制品含有多种植物成分，将难以确定选用何种基因产物的抗体进行检测。
(4)基因功能分析技术，一些转化基因产物(酶或蛋白质)的功能可用转基因植物的活体、活组织、蛋白粗提液与底物反应来观察；而另一些基因编码抗生素抗性、除草剂抗性等，则可以通过简单的种子萌发等活体试验加以分析。不难看出，它们都必须用活体或活组织，且在结果的判断上容易出现误差。
国内外均未见利用T-DNA左右边界序列、CaMV 35S polyA、nos启动子、nos终止序列设计合成引物进行PCR检测转基因植物及其制品的报道。虽有几篇利用CaMV 35S启动子检测转植物及其制品的报道，但对于易感染CaMV的十字花科植物，单独使用CaMV 35S启动子检测有可能造成重要误差。
发明内容
本发明的目的是提供一种转基因植物及其制品的检测方法。该方法根据转基因植物最普遍的特征序列T-DNA左右边界序列、CaMV 35S polyA、nos启动子、nos终止序列设计合成引物，进行PCR检测转基因植物及其制品，从而克服上述现有检测方法所存在的问题。
为了获得转基因植物，通常将外源基因构建到由农杆菌(Agrobacterium)Ti质粒(tumer-inducingplasmid)或Ri质粒(root-inducing plasmid)衍生而来的载体T-DNA区构成植物表达载体，在这种载体上总是存在25bp的T-DNA左右边界序列(right border sequence，RB；left border sequence，LB)，以及与外源基因配合使用的CaMV 35S启动子、CaMV 35S polyA、nos启动子、nos终止序列，植物表达载体通过农杆菌共培养法(co-cultivation)、基因枪法(gene gun，particle bombardment)等方法导入植物细胞，使外源基因整合到植物基因组并在转基因植物中表达。
本发明方法是采用常规方法提取被测样品的DNA，根据T-DNA左右边界序列、CaMV 35S启动子、CaMV 35S polyA、nos启动子、nos终止序列设计合成一对或多对引物，进行PCR，得到相应的DNA扩增产物或扩增产物的信号。
本发明方法具体包括以下步骤(1)合成2条以上引物，其中一条为T-DNA左右边界序列引物，长度18-25nt，其它为CaMV 35S启动子、CaMV 35S polyA、nos启动子和nos终止序列中任意一段或多段序列，长度≥18nt；(2)取T-DNA左右边界序列引物，与一条或多条其它引物配成一对或多对PCR引物，按常规方法对样品DNA进行PCR扩增反应，以pBI121或pCAMBIA1300等质粒DNA作正对照，以未转基因植物或制品DNA作负对照，PCR反应条件是94℃预变性5分钟，反应25-35循环，每循环包括94℃变性1分钟，45-65℃退火1分钟，72℃延伸反应30秒-10分钟，循环结束后，追加72℃延伸反应5分钟；(4)PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙啶染色，紫外灯下观察到大小50-10000bp的DNA扩增片段。
按照上述本发明方法，还可进行实时定量PCR，具体是在步骤(2)的PCR反应管中加入与双链DNA特异结合的SYBR荧光染料，或者特异的TaqMan荧光探针；PCR扩增产物通过荧光扫描仪观测到相应荧光信号，或者按步骤(3)观察结果。
按照上述本发明方法，还可进行PCR-ELISA，具体是在步骤(1)中，用生物素标记合成的引物；PCR扩增产物与固定在微板上的链亲和素(streptavidin)-蛋白A结合，再与碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶标生物素抗体进行ELISA反应，用微板读数仪(酶标仪)读取405-410nm的吸光值，或者按步骤(3)观察结果。
本发明方法具有以下有益效果(1)广泛性。T-DNA左右边界序列、nos启动子和nos终止序列存在于绝大多数转基因植物中，CaMV35S启动子和/或CaMV 35S polyA存在于70％以上的转基因植物中，因而具有最广泛代表性，适用于当前绝大多数转基因植物及其制品的检测。
(2)快速性。大多数检测需时约2小时至2天，能保证快速检测的需要。
(3)准确性。上述几种序列都是转基因植物的特征序列，检测结果准确性强。
(4)灵敏性。只需用极少量样品，如一粒种子、一块组织、一片叶子，甚至少到ug(微克)级的样品。
具体实施例方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1利用T-DNA左右边界序列和nos终止序列引物进行PCR检测转基因番木瓜如前面所述，T-DNA左右边界序列、nos终止序列存在于绝大多数转基因植物中，故用这两种序列合成引物进行PCR，适用于当前绝大多数转基因植物及其制品的检测。我们在过去的工作中获得了转番木瓜环斑病毒(PRV)复制酶(RP)基因的抗病毒番木瓜品系，用PCR方法对其进行了转基因检测。
(1)用CTAB法提取转基因番木瓜叶片DNA。
(2)合成一对引物，其中一条为T-DNA左右边界序列引物(第4-23nt)5’-caggatatattggcgggtaa-3’，另一条为nos终止序列引物(nos终止序列第81-100nt)5’-catgcttaacgtaattcaac-3’。
(3)按常规方法对样品DNA进行PCR扩增反应，以pRPTW质粒DNA(含T-DNA左右边界序列、PRV RP基因、nos终止序列等)作正对照，以未转基因的番木瓜DNA作负对照，PCR反应条件是94℃预变性5分钟，反应30循环，每循环包括94℃变性1分钟，54℃退火1分钟，72℃延伸反应4分钟，循环结束后，追加72℃延伸反应5分钟。
(5)PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙啶染色，紫外灯下观察，样品和正对照都有1条大小约2500bp的DNA扩增片段，负对照没有任何扩增片段。结果与设计相符，表明相关序列和RP基因已整合进番木瓜基因组。
实施例2利用T-DNA左右边界序列和CaMV35S启动子引物进行实时定量PCR检测转基因烟草CaMV 35S启动子具有植物强启动子功能，无器官特异性，因而广为采用，迄今70％以上的转基因植物采用这种启动子。但少数十字花科植物易感染CaMV，故在检测这类植物及其制品时，如单独使用CaMV 35S启动子引物，可能造成重要误差，利用分别来自T-DNA左右边界序列和CaMV 35S启动子的两个引物进行PCR则可克服这一问题。采用实时定量PCR法对我们获得的转基因抗草甘膦烟草进行了检测。
(1)用CTAB法提取转基因烟草叶片DNA。
(2)合成一对引物，其中一条为T-DNA左右边界序列引物(第4-23nt互补序列)5’-ttacccgccaatatatcctg-3’，另一条为CaMV35S启动子引物(第325-344 nt)5’-atggtggagcacgacactct-3’。
(3)按常规方法对样品DNA进行PCR扩增反应，以pM12质粒DNA(含T-DNA左右边界序列、CaMV35S启动子序列、EPSPS突变体基因等)作正对照，以未转基因的烟草DNA作负对照，向反应管中加入与双链DNA特异结合的SYBR荧光染料，反应在ABI Prism7000型荧光定量PCR仪中进行，PCR反应条件是94℃预变性5分钟，反应35循环，每循环包括94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸反应2分钟，循环结束后，追加72℃延伸反应5分钟。
(4)随着循环数增加，转基因烟草和正对照PCR扩增产物荧光信号不断增强，30循环时荧光强度达到最强，负对照测不到荧光；PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙啶染色，紫外灯下观察，转基因烟草和正对照都有1条大小约2000bp DNA扩增片段，负对照没有任何扩增片段，结果与设计相符，表明相关序列和EPSPS突变体基因已整合进烟草基因组。
实施例3利用CaMV35S启动子和nos终止序列引物进行PCR-ELISA检测转基因番茄我们将变形链球菌表面蛋白PAC(Streptococcus mutans surface protein)的唾液粘附区(Saliva-binding region，SBR)基因及其与霍乱弧菌B亚单位(Cholera toxin B subunit，CTB)组成嵌合基因，共培养转化番茄，获得转基因植株，用PCR-ELISA方法对其进行了转基因检测。
(1)用常规CTAB法提取转基因番茄果实DNA。
(2)合成一对引物，其中一条为CaMV35S启动子引物(第61-70nt，5’端连接生物素)5’-biotin-cagcaggtctcatcaagacg-3’，另一条为另一条为nos终止序列引物(nos终止序列第81-100nt互补序列)5’-gttgaattacgttaagcatg-3’。
(3)按常规方法对样品DNA进行PCR扩增反应，以pROSB质粒DNA(含CaMV35S启动子、SBR-CTB嵌合基因、nos终止序列等)作正对照，以未转基因的番茄DNA作负对照，PCR反应条件是94℃预变性5分钟，反应30循环，每循环包括94℃变性1分钟，54℃退火1分钟，72℃延伸反应3分钟，循环结束后，追加72℃延伸反应5分钟。
(4)PCR扩增产物与固定在微板上的链亲和素(streptavidin)-蛋白A结合，再分别与地高辛探针(CaMV35S启动子第181-200nt，5’-aagatatattt ctcaagatc-3’-Dig)、酶标地高辛抗体进行ELISA反应，用BioRad450酶标仪读取405-410nm的吸光值，样品和正对照可见明显的吸收峰，负对照则没有；PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙啶染色，紫外灯下观察，样品和正对照都有1条大小约2900bp的DNA扩增片段，负对照没有任何扩增片段，结果与设计相符，表明相关序列和SBR-CTB嵌合基因已整合进番茄基因组。
权利要求
1.一种转基因植物及其制品的检测方法，其特征是采用常规方法提取被测样品的DNA，根据T-DNA左右边界序列、CaMV 35S启动子、CaMV 35S polyA、nos启动子和nos终止序列设计合成一对或多对引物，进行PCR，得到相应的DNA扩增产物或扩增产物的信号。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征是具体包括以下步骤(1)合成2条以上引物，其中一条为T-DNA左右边界序列引物，长度18-25nt，其它为CaMV 35S启动子、CaMV 35S polyA、nos启动子和nos终止序列中任意一段或多段序列，长度≥18nt；(2)取T-DNA左右边界序列引物，与一条或多条其它引物配成一对或多对PCR引物，按常规方法对样品DNA进行PCR扩增反应，以pBI121或pCAMBIA1300质粒DNA作正对照，以未转基因植物或制品的DNA作负对照；PCR反应条件是94℃预变性5分钟，反应25-35循环，每循环包括94℃变性1分钟，45-65℃退火1分钟，72℃延伸反应30秒-10分钟，循环结束后，追加72℃延伸反应5分钟；(3)PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙啶染色，紫外灯下观察到大小50-10000bp的DNA扩增片段。
3.按照权利要求2所述的方法，其特征是进行实时定量PCR在步骤(2)的PCR反应管中加入与双链DNA特异结合的SYBR荧光染料，或者特异的TaqMan荧光探针；PCR扩增产物通过荧光扫描仪观测到相应荧光信号，或者按步骤(3)观察结果。
4.按照权利要求2所述的方法，其特征是进行PCR-ELISA在步骤(1)中，用生物素标记合成的引物；PCR扩增产物与固定在微板上的链亲和素-蛋白A结合，再分别与特异性地高辛探针、酶标地高辛抗体进行ELISA反应，用酶标仪读取405-410nm的吸光值，或者按步骤(3)观察结果。
全文摘要
本发明涉及一种转基因植物及其制品的检测方法。用转基因植物中的特征序列:T－DNA左右边界序列、CaMV 35S启动子、CaMV 35S polyA、nos启动子和nos终止序列,设计合成引物进行PCR,得到相应的DNA扩增产物或扩增产物的信号,根据PCR结果,判断被测样品是否为转基因植物及其制品。本发明具有简便易行、经济节时、准确灵敏的优点,特别是只需用一至三对引物既可检测绝大多数转基因植物及其制品。
文档编号C12Q1/68GK1385541SQ0211523
公开日2002年12月18日 申请日期2002年5月17日 优先权日2002年5月17日
发明者叶长明, 蓝崇钰, 魏祥东, 陈东红, 林周 申请人:中山大学