酰胺的制备工艺的制作方法

专利名称：酰胺的制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的马杜拉放线菌属(Actinomadura)、拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)或红球菌属(Rhodococcus)微生物，以及使用这些微生物或这些微生物的酶提取物制备酰胺的新工艺。
EP-A-0307926公开了通过使用紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)J1微生物将3-氰基吡啶转化成烟酰胺。为了使这些微生物催化希望的转化，必需诱导它们。
该工艺的另一缺陷是紫红红球菌J1是红色的，因此需要对产物进行褪色。此外，这种微生物具有低热稳定性并能被例如底物3-氰基-吡啶所抑制。
EP-A-0362829公开了另一种使用紫红红球菌J1种微生物从3-氰基吡啶开始制备烟酰胺的工艺。为了增加含腈水合酶的微生物的比活性，向培养基中加入脲或脲衍生物作为诱导剂。如上文所述工艺，在这一工艺中也需要对产物进行褪色。
此外，WO 95/17505公开了一种通过紫红红球菌M33种微生物从相应的腈类开始制备芳香族酰胺的工艺。该工艺的缺陷是紫红红球菌M33的红色以及底物3-氰基吡啶的高Km值。
本发明的目的是消除这些缺陷并提供一种制备酰胺的工艺，能高产量和高纯度地分离其中相应的酰胺。
这一目的可通过根据权利要求1和3的新微生物以及根据权利要求6的工艺来达到。
根据本发明，所述工艺是用马杜拉放线菌属、拟无枝酸菌属或红球菌属微生物，使用这些微生物的酶提取物或用纯化了的马杜拉放线菌属或拟无枝酸菌属微生物腈水合酶将腈(作为底物)转化成相应的酰胺。
用于生物转化的腈类如3-氰基吡啶是市场上可买到的化合物。
根据本发明的微生物能将底物腈类转化成相应的酰胺。这些微生物优选具有能依靠腈类或酰胺作为唯一的碳源或氮源的能力。
根据本发明，微生物可从例如土壤样品、污泥或废水中借助于通常的微生物技术进行适当的分离获得。在钴离子的存在下，以腈类或酰胺作为优选的唯一碳源和氮源进行生长而可方便地对微生物进行选择。适用于选择的腈类和酰胺类，特别是在后面的生物转化中也被用作底物的腈类，以及可从中获得的相应的酰胺。适宜的培养基对本领域技术人员来说同样是已知的，例如在表1中描述的培养基就可使用。
通常，即使在实际的生物转化之前，可使用上述培养基以同样的方式培养(生长)微生物。
如本专业所知，腈水合酶只有在培养基中含有钴离子作为辅助因子时才能形成。适宜的“能产生钴离子的钴化合物”是Co2+或Co3+盐。Co2+或Co3+盐的实例为氯化钴、硫酸钴和乙酸钴。
可方便使用的钴化合物是Co2+盐，如CoCl2。然而生长也可在维生素B12与在原位能产生钴离子的金属钴或其他钴化合物共同存在下进行。钴化合物方便用量是1-10mg/L，优选1-3mg/L。
通常生长温度为20-50℃，pH值在pH5和pH8之间，优选温度是30-45℃，优选pH值在pH5.5和pH7.5之间。
可使用马杜拉放线菌属、拟无枝酸菌属微生物，使用这些微生物的酶提取物或使用来自这些微生物的纯化的腈水合酶进行实际的生物转化。可方便地使用复叶马杜拉放线菌进行生物转化，例如复叶马杜拉放线菌E3733、复叶马杜拉放线菌E3736、复叶马杜拉放线菌45A32、复叶马杜拉放线菌4501或复叶马杜拉放线菌C15的分离物。进行生物转化优选使用相应于拟无枝酸菌NE 31和拟无枝酸菌NA40或它们的功能相当的变种或突变种的微生物。特别优选使用与拟无枝酸菌NA40种相应的微生物。根据布达佩斯条约，上述种的微生物已于1997年6月3日以拟无枝酸菌NE 31和拟无枝酸菌NA40的名称保藏在Deutschen Sammlung vonMikroorganisms und Zellkulturen GmbH[German Collection ofMicroorganisms and Cell Cultures GmbH]，Mascheroderweg 1b，D-38124Brunswick，保藏号分别为DSMZ 11616和DSMZ 11617。这两种微生物已经更精确地鉴定，并将被分配至文献尚未公开的拟无枝酸菌属的种中。
因此，本发明还涉及能将酰胺转化成腈的拟无枝酸菌属或马杜拉放线菌属微生物，特别是名为拟无枝酸菌NA40(DSMZ 11617)和拟无枝酸菌NE31(DSMZ 11616)的微生物。
此外，已发现红球菌属的特殊微生物比公开于EP-A-0362829中的紫红红球菌J1具有更好的将腈类转化成酰胺的性能。这些微生物是红球菌GF674、红球菌GF578、红球菌GF473、红球菌GF270(DSMZ 12211)和红球菌GF376(DSMZ 12175)或它们的功能相当的变种或突变种。根据布达佩斯条约，微生物DSMZ 1275于1998年5月15日、微生物DSMZ 12211于1998年6月8日保藏在Deutschen Sammlung von Mikroorganisms undZellkulturen GmbH[German Collection of Microorganisms and Cell CulturesGmbH]。
红球菌属菌株GF270、GF376、GF473、GF578和GF674已根据鉴定被分配至文献尚未公开的红球菌属的种中。因此，本发明还涉及微生物红球菌GF270、红球菌GF376、红球菌GF473、红球菌GF578和红球菌GF674。
不象马杜拉放线菌属或拟无枝酸菌属微生物，红球菌属微生物可方便地在实际的生物转化前被诱导。适宜的诱导剂是EP-A-0307926中公开的，例如乙酰胺、丁酰胺、甲基丙烯酰胺、丙酰胺、丁烯酰胺和戊酰胺。
“功能相当的变种和突变种”是指来源于上述原始有机体并且实质上与其具有同样的特性和功能的微生物。这种变种和突变种可例如通过UV照射或诱变化合物偶然形成。
拟无枝酸菌NA40的鉴定气生菌丝体的颜色白色基内菌丝体颜色 橙色扩散色素的颜色 -糖谱ARA +GAL +MAD -XYL -GLU trRIB +类型ADAP DL维生素K2类(％)8/4 -9/0 (+)9/2 +9/4 +++9/6 -9/8 -16S rDNA同源性 96.9％磷脂如 未调查PE，OH-PE，lyso PE，metPE，PC，NPG，PI，PIM，PG，DPG，GL脂肪酸iso 16 +++iso 15 +iso 17 (+)anteiso 15 (+)anteiso 17 (+)10-Me 16-10-Me 17+2-OH 15 +2-OH 16 +类型3fMS -拟无枝酸菌NE31的鉴定气生菌丝体的颜色白色基内菌丝体的颜色橙色扩散色素的颜色 -糖谱ARA +GAL +MAD -XYL -GLU trRIB +类型ADAP DL维生素K2类(％)8/4 -9/0 (+)9/2 +9/4 +++9/6 -9/8 -16S rDNA同源性 96.1％磷脂如 未调查PE，OH-PE，lyso PE，metPE，PC，NPG，PI，PIM，PG，DPG，GL脂肪酸iso 16 +++iso 15 +iso 17 (+)anteiso 15 (+)anteiso 17 (+)10-Me 16-10-Me 17+2-OH 15 +2-OH 16 +类型3fMS -鉴定中使用的缩写和解释(+) 1-15％+ 5-15％++ 15-30％+++ ＞30％DAP 二氨基庚二酸ARA 阿拉伯糖GAL 半乳糖MAD 北美放线菌粘糖XYL 木糖GLU 葡萄糖RIB 核糖糖类型根据Lechevalier等，1971。脂肪酸类型根据Kroppenstedt 1985和1982。9/4 MK-9(H4)9/6 MK-9(H6)9/8 MK-9(H8)
MS 霉菌酸PE 磷脂酰乙醇胺OH-PE 羟基-PEmet PE 磷脂酰甲基乙醇胺PC 磷脂酰胆碱NPG 磷脂酰葡萄糖胺PI 磷脂酰肌醇PIM 磷脂酰肌醇甘露糖苷PG 磷脂酰甘油DPG 二磷脂酰甘油GL 糖酯脂肪酸iso-16 异十六烷酸或14-甲基十五烷酸10-Me-18结核硬脂酸2-OH-16 2-羟基棕榈酸GF270、GF376、GF473、GF578和GF674的鉴定鉴定这些菌株是基于五个彼此独立的特征。
1.菌落形态和颜色短分支菌丝，分裂成棒状和孢子状单元。GF270和GF376的菌落是橙红色(RAL 3022)，GF578和GF674的菌落是浅红色(RAL3012)。
2.酞聚糖的二氨基酸内消旋二氨基庚二酸3.霉菌酸红球菌属霉菌酸用高温气相色谱进行长链霉菌酸的测定。GF270和GF376的霉菌酸的洗脱曲线与GF473、GF578和GF674相同。GF270和GF376的霉菌酸长度为C38-C46，而GF473、GF578和GF674是C40-C48。与红球菌属菌株的霉菌酸构型比较。GF270被鉴定为以非常低的相关系数(0.086)属于紫红红球菌；不可能用这种方法鉴定GF376。鉴定其他三种GF473、GF578和GF674的分离物也以非常低的相关系数属于赤红球菌(Rhodococcus ruber)。
4.脂肪酸构型无支链的、饱和的和不饱和的脂肪酸包括结核硬脂酸。脂肪酸构型是所有红球菌属属的特征并与分支杆菌属(Mycobacterium)，土壤丝菌属(Nocardia)，迪茨氏菌属(Dietzia)，冢村氏菌属(Tsukamurella)和一些棒状杆菌(Corynebacteria)密切相关。通过GF270、GF3 76、GF473、GF578和GF674与红球菌种的脂肪酸构型的定性和定量差别可在种水平上进行鉴定。
5.尽管GF270和GF376与红球菌属菌株的比较表明与最密切相关的紫红红球菌的相似度为99.1％，GF270和GF376的16S rDNA序列相同(100％)。GF473和GF578的16S rDNA序列也相同(100％)。GF674与GF578的500个碱基对中只有一对不同(99.8％)。三个分离物都表示与嗜粪红球菌属(Rhodococcus coprophilus)关系较远(98.4％)。
根据趋化性和分子生物学结果，可以断定一方面的GF270和GF376，另一方面的GF473、GF578和GF674是两种新的红球菌属菌株。GF270和GF376的16S rDNA与紫红红球菌的关系密切(99.1％)，而GF473、GF578和GF674与嗜粪红球菌属只有较远的关系(98.4％)。
可通过本专业常规方法破碎微生物获得酶提取物，例如通过超声波破碎、French press method或溶菌酶法。这种酶提取物和当然还有完整的微生物细胞可固定在适宜的支持物上，通常是嵌入聚合物以进行本发明工艺，或吸附在适宜的支持物上。
根据本发明具有腈水合酶活性的酶可从拟无枝酸菌属微生物中获得，并能将腈转化成酰胺，特别是它们可从拟无枝酸菌NA40(DSMZ 11617)中获得。
这些酶特别具有下列性能a)最适pH为pH6.5±1.0b)当pH7.0时最适温度是35-40℃c)底物3-氰基吡啶的Km值为41.7mM±7.7mM(20℃，45mM磷酸缓冲液，pH7.0)特别是酶具有d)106KDa分子量，例如，通过SDS-PAGE测定。
腈类通常用作生物转化的底物。方便使用或者含有1-10个碳原子的，可任选被羟基、氨基、卤素或羧基取代的脂肪腈，或者在芳环系统中有4-10个碳原子的取代或未取代的芳腈。可使用的含有1-10个碳原子的脂肪腈是二腈类、羟基腈类、氨基腈类，例如正辛腈、氰基乙酸、异乙腈、正戊腈、己二腈、戊二腈、丁二腈、癸二腈、丙腈、丁烯腈、丙烯腈、甲基丙烯腈、正丁腈或壬二腈(azelanitrile)。可使用的含有4-10个碳原子的芳腈是下面式代表的腈类 或 其中R1和R2是氢原子、卤素原子或C1-4烷基。卤素原子可使用F、Cl、Br或I。C1-4烷基可使用甲基、乙基、丙基、异丙基、叔丙基、丁基、异丁基或叔丁基。通式I或II的芳腈的适宜代表是2-、3-或4-氰基吡啶，苄腈、氟-、氯-或溴-苄腈，例如，邻-、间-或对-氯苄腈或2-氯-3-氰基吡啶。含有4-10个碳原子的芳腈优选使用3-氰基吡啶。
一次性或连续加入底物使底物浓度不超过40％(重量)，优选30％有利于生物转化的进行。
用静息(不生长)细胞有利于本工艺的实施。
适用于生物转化的介质是本专业领域常用的，例如低分子量磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、根据表1至3的介质或它们的修改型，例如实施例8(1)中所述的或TRIS/HCl缓冲液。
进行生物转化的有利温度是0-50℃，有利pH值是pH4.5-pH10，优选温度是20-40℃，优选pH值是pH4.5-pH10.0。
在特别优选的实施方案中，可在C1-4-醇的存在下进行生物转化。使用的C1-4-醇可以是甲醇、乙醇、丙醇或丁醇。优选使用甲醇。
反应后，相应的酰胺可用常规的加工方法，如结晶作用来进行分离。


图1表示通过TSK凝胶G3000 SW色谱法测定分子量图2表示用SDS-PAGE法测定分子量图3表示纯化酶的吸收谱。观察到在300-400nm有宽吸收。
图4表示细胞在各种温度下培养30分钟并在标准反应条件下测试的活性。
图5表示静息细胞的最适温度。
图6表示静息细胞的最适pH和pH稳定性。
图7表示酶的最适pH和pH稳定性。
图8表示酶的最适pH和pH稳定性。
图9表示酶的最适pH和pH稳定性。
实施例实施例1马杜拉放线菌属或拟无枝酸菌属微生物的生长a)用各种腈类或酰胺类作为根据表1的富集培养基的碳源和氮源接种入各种土壤样品中并在37℃或45℃培养7-10天。将培养物转移至相同的培养基中，再在37℃培养7-10天。整个过程重复三次。然后将培养物稀释并铺板以获得单个菌落。将平板在37℃培养5天。然后测试不同的菌落是否具有需要的活性。
以这种方式分离到拟无枝酸菌NA40(DSMZ 11617)和拟无枝酸菌NE31(DSMZ 11616)，然后在最适培养基(表3)上37℃下振摇培养90-100小时。
己二腈作为拟无枝酸菌NE31(DSMZ 11616)、复叶马杜拉放线菌E3733和复叶马杜拉放线菌E3736的碳和氮源，壬二腈作为拟无枝酸菌NA40(DSMZ 11617)、复叶马杜拉放线菌45A32的碳和氮源，正辛腈作为复叶马杜拉放线菌4501的碳和氮源以及氰基乙酸作为复叶马杜拉放线菌C15的碳和氮源。
b)在表3的培养基中培养拟无枝酸菌NA40。在37℃有氧条件下在次培养基(4ml/管)和“主要培养基”(500ml/瓶)中培养2或3-4天。用浊度计在610nm测量细胞生长并以下面的方法计算细胞干重干细胞重mg/ml＝OD610×0.277。
表1富集培养基腈 2.0gKH2PO47.0gMgSO4.7H2O 0.1g维生素混合物 1.0mlCoCl2.6H2O 2.0mgFeSO4.7H2O 2.0mg加水至1L(pH 6.7-7.3)表2基础培养基麦芽糖 2.0gNaNO31.0gK2HPO40.1gMgSO4.7H2O 0.05g加水至100ml(pH7.0)表3最适培养基D-葡萄糖 4.5g肉浸膏0.5gK2HPO40.1gMgSO4.7H2O 0.05gCoCl2.6H2O 1.0mg加水至100ml(pH7.0)实施例2马杜拉放线菌属或拟无枝酸菌属微生物的生物转化(1)为了测定腈水合酶的活性，将含有3-氰基吡啶(1.0M，1.0ml)、磷酸钾缓冲液(pH7.0，0.1M，0.5ml)和0.5ml细胞悬浮液的反应混合物(2ml)在20℃搅拌培养30分钟。加入0.2ml 3N HCl使反应中止。经过短暂离心后，用HPLC(使用C18柱(Develosil ODS-HG-5，4.6×250cm)的Shimadzu SPD 6A系统；洗脱液10mM KH2PO4/H3PO4(pH2.8)/乙腈9∶1(v/v)；流速1ml/min；在230nm测定吸收)测定形成的烟酰胺。具体活性用形成的烟酰胺的μmol/ml/min/OD610nm表示。
在富集培养基(表1)中脂肪腈与分离出的细菌的反应速率概括于表5，基础培养基(表2)中诱导物和辅助因子的影响概括于表4，在基础培养基(表2)中拟无枝酸菌属与红球菌属的活性比较概括于表6。表4的结果表明拟无枝酸菌NA40的腈水合酶是持续表达的，但辅助因子钴是活性所必需的。
(2)温度对NA40生长的影响次代培养物于37℃下在表3的培养基中培养2天，然后转移至含有20ml表3培养基的摇瓶中。在37℃、40℃、45℃、50℃和55℃振摇培养3-4天。测量细胞的生长并在20℃测定腈水合酶的活性。表7表示温度对腈水合酶活性和细胞生长的影响。
表4基础培养基中诱导物和辅助因子对具体活性的影响诱导物生长 总活性 比活性(OD610nm) (μmol/ml/min) (μmol/ml/min/OD)- 1.26 20.916.6ε-己内酰胺 0.66 9.5214.5丁烯酰胺 3.41 22.96.72甲基丙烯酰胺 3.33 2.460.74丁酰胺2.19 0.190.88丙酰胺1.91 0.920.48脲1.72 2.971.73辅助因子 生长 总活性 比活性(OD610nm) (μmol/ml/min) (μmol/ml/min/OD)- 7.97 0.100.01FeSO4.7H2O 8.32 3.360.40CoCl2.6H2O 8.41 47.85.68表5使用分离细菌的脂肪腈的转化率菌株 底物 生长 总活性 比活性(OD610nm) (μmol/ml/min)(μmol/ml/min/OD)拟无枝酸菌属 NE31 己二腈 2.68 0.377 0.141(DSMZ11616)马杜拉放线菌 E3733 己二腈 1.62 0.347 0.214复叶马杜拉放线菌″ E3736 己二腈 1.36 3.002.21″ 45A32 壬二腈 5.81 18.83.23″ 4501 正辛腈 7.24 32.24.45″ C15 氰基乙酸 2.04 7.013.43拟无枝酸菌属 NA40 壬二腈 5.92 33.05.57(DSMZ11617)表6拟无枝酸菌属与紫红红球菌J1活性比较微生物微生物拟无枝酸菌属 NA40 紫红红球菌J1(DSMZ 11617)(μmol/ml/min)3-氰基吡啶的活性 303 314来自NA40的纯化酶 来自J1的纯化酶(μmol/min/mg蛋白)(μmol/min/mg蛋白)3-氰基吡啶的活性 1110 371(3)为了测定NA40相对于许多底物的活性，将干重0.0388mg的细胞在上述缓冲液中培养。加入适当的底物起动反应并在20℃振摇培养10分钟。加入0.2ml 2N HCl中止反应并将反应混合物进行短暂离心。用HPLC或气相色谱分析上清液。表8表示底物特异性的试验条件。表9表示静息NA40细胞对各种底物的底物特异性。
各试验条件概括于表8，结果概括于表9。表7生长温度对腈水合酶活性和细胞生长的影响温度生长 总活性活性 相对活性(mg/ml)(μmol/ml/min) (μmol/ml/min/mg)(％)37℃6.16 4.69 0.761 10040℃5.79 9.89 1.7122545℃6.56 4.83 0.736 9750℃5.96 1.16 0.195 26表8底物特异性的试验条件底物 底物(mM) 分析方法 形成的酰胺3-氰基吡啶 1.0 HPLC 烟酰胺2-氰基吡啶 0.25 HPLC 吡啶酰胺4-氰基吡啶 0.25 HPLC 吡啶-4-羧酰胺丁烯腈 0.4 HPLC 丁烯酰胺苄腈 0.03 HPLC 苯甲酰胺丙烯腈 0.4 HPLC 丙烯酰胺邻-氯苄腈 0.15 HPLC 邻-氯苯甲酰胺间-氯苄腈 0.15 HPLC 间-氯苯甲酰胺对-氯苄腈 0.15 HPLC 对-氯苯甲酰胺2-氯-3-氰基吡啶0.15 HPLC 2-氯-3-烟酰胺乙腈 0.4 GC 酰胺丙腈 0.4 GC 丙酰胺甲基丙烯腈 0.4 GC 甲基丙烯酰胺正丁腈 0.4 GC 正丁酰胺将邻-、间-、对-氯苄腈和2-氯-3-氰基吡啶加入到溶解在甲醇中的反应混合物中。
表9NA40腈水合酶的底物特异性

(4)静息细胞的最适温度和热稳定性在标准反应混合物中进行10分钟反应。最适温度是35-40℃(图5)。然后将细胞在各种温度下培养30分钟并在标准反应条件下测试活性。从图4中可看出，热稳定性是40℃。
(5)静息细胞的最适pH和pH稳定性为了这一目的，在用各种0.1M缓冲液代替了磷酸钾缓冲液的标准反应混合物中进行10分钟反应。从图6中可看出，最适pH是4.5-10。在20℃时各种pH下培养细胞悬浮液30分钟，将细胞离心。然后清洗细胞并重新悬浮于0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)中。在标准条件下加入3-氰基吡啶进行10分钟反应。酶在pH4.5-10.0间是稳定的(图7)。
(6)通过NA40从3-氰基吡啶积累烟酰胺在包含500mM 3-氰基吡啶、40mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)和静息细胞(ganzhong 2.3mg)的反应混合物(30ml)中进行反应。在反应中，只要被消耗，就加入3-氰基吡啶(500mM)，共加7次。以这种方式，在15小时的反应过程中加入4.0M 3-氰基吡啶并形成3.89M(475g/L)烟酰胺，相对的产率是97.3％。没有形成烟酸。
实施例3拟无枝酸菌属微生物的鉴定下列5个化学分类标志保证了鉴定1.特征酞聚糖氨基酸内消旋二氨基庚二酸2.特征糖阿拉伯糖和半乳糖
3.霉菌酸霉菌酸缺乏4.维生素K2类MK-9(H4)5.脂肪酸构型异/反异分支的和2-羟基脂肪酸，检测到少量10-甲基-分支的脂肪酸。拟无枝酸菌属的所有代表中均发现了这种脂肪酸构型(脂肪酸构型3f)。
这些化学特征的组合是拟无枝酸菌属所有种类的特征。
借助于主要成分分析使用脂肪酸数据库中的记录比较两种培养物的脂肪酸数据。使用这种方法，可能将NE31和NA40都分配至拟无枝酸菌属，然而，由于相关系数太低，不可能鉴定种类。然而，两种菌株的脂肪酸构型的比较表明它们是两种不同类型的菌株。
这一结果被16S rDNA序列分析的结果证实。这时也将其划分至拟无枝酸菌属，但没有具体到已描述的任何拟无枝酸菌属种。在这一方法中，通过PCR-放大的16S rDNA基因的直接定序测定16S rDNA的序列。将16SrDNA序列的特征部分与拟无枝酸菌属和相关分类群的典型种的序列进行比较。结果表明该菌株属于拟无枝酸菌属。发现与嗜甲基拟无枝酸菌的一致性最高，是96.9％(NA40)和96.1％(NE31)。其中，两个分离物的序列一致性为99.0％。我们对拟无枝酸菌属的代表的调查表明，对于良好的种鉴定来说，相关系数必需高于99.5％。由于96.9％明显低于99.5％，可以假定这两种分离物都不是已知的拟无枝酸菌属种的代表。
根据本结论，不可能将分离物分配至任何已知的拟无枝酸菌属种中。据此我们假定NA40和NE31是两种新的、以前未公开的拟无枝酸菌属的种类的菌株。
拟无枝酸菌属微生物的鉴定特征气生菌丝的颜色基内菌丝的颜色扩散色素的颜色糖谱ARA+GAL+MAD-XYL -GLU vRIB +类型 ADAP DL维生素K2类(％)8/4 -9/0 (+)9/2 +9/4 +++9/6 -9/8 -16S rDNA同源性＞99.5％磷脂PE+OH-PE +lyso PE -met PE-PC-NPG -PI+PIM vPG+DPG +GL-类型 II+OH-PE脂肪酸iso 16+++iso 15+iso 17(+)
anteiso 15+anteiso 17(+)10-Me 16 (+)10-Me 17 +2-OH 15 +2-OH 16 +类型 3fMS-实施例4微生物菌株NA40的腈水合酶的纯化将菌株在表3的培养基中37℃培养3天。通过离心收获2L培养物细胞，然后重新悬浮于0.85％NaCl溶液中。然后将细胞转移至含有44mM正丁酸的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)中并用超声波处理。将细胞提取物离心并除去细胞碎片。这一提取物用于酶纯化。
在整个纯化过程中，使用含有44mM正丁酸的磷酸钾缓冲液(pH7.0)。从表10中可看出，用三步纯化酶至同质。
表10NA40腈水合酶的纯化总活性 总蛋白 比活性 浓缩(单位) (mg)(U/mg)无细胞提取物 73300 102071.91DEAE-Sephacel68000 110 620 8.62苯基-TOYOPEARL 64800 61.4110515.41单位在20℃催化形成1μmol烟酰胺/min的酶量。
实施例5腈水合酶的特性(1)测定分子量、亚单元结构和钴离子含量使用含有0.2M KCl和44mM正丁酸的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.0)在TSK凝胶柱G3000 SW(0.75×60cm)上色谱法测定分子量为106KDa。确定了酶是有两种不同的亚单元α和β组成，各自的分子量是30000和26000。
图1表示通过TSK凝胶G3000 SW色谱法测定分子量图2表示用SDS-PAGE法测定分子量图3表示纯化酶的吸收谱。观察到在300-400nm有宽吸收。
(2)纯化酶的底物特异性底物特异性的测定类似于实施例2(1)。结果概括于表11。
表11纯化的NA40腈水合酶的底物活性底物 (M) 总活性 相对活性(％)(μmol/ml/min)酶反应与静息细胞的反应3-氰基吡啶 1.0 17.7 100 1002-氰基吡啶 0.25 39.1 221 1284-氰基吡啶 0.25 31.6 179 168丁烯腈 0.4 11.9 6752苄腈 0.03 11.3 6451丙烯腈 0.4 16.6 94115邻-氯苄腈 0.15 22.4 127 96间-氯苄腈 0.15 15.9 9075对-氯苄腈 0.15 2.30 13162-氯-3-氰基吡啶0.15 16.0 90126乙腈 0.4 -- -丙腈 0.4 39.3 222 105甲基丙烯腈 0.4 22.1 125 130正丁腈 0.4 17.9 101 194向反应混合物(2.0ml)中加入1.7单位酶。反应混合物含有在45mM磷酸盐缓冲液(PH7.0)中的各底物。
(3)KM值的测定用Lineweaver-Burk图表测定对3-氰基吡啶的KM值是41.7mM，对丙烯腈的KM值是3.7mM。与紫红红球菌J1比较，其相对于3-氰基吡啶的KM值是200mM，而NA40的明显要低。这是NA40的主要优点之一。
(4)热稳定性的最适温度将纯化的酶在pH7.0、不同温度下培养30分钟，然后在20℃测定1分钟的3-氰基吡啶转化烟酰胺。当温度高于40℃，酶失去活性。在静息细胞中热稳定性是约40℃，最适温度是35-40℃(图5)。
(5)最适pH和pH稳定性为了这一目的，20℃下在含有各种缓冲液(42.5mM)、1.71单位纯化的酶和500mM3-氰基吡啶的反应混合物(2.0ml)中进行3-氰基吡啶向烟酰胺的转化。最适pH是约pH6.5±1.0(图8)。
为了测定pH稳定性，将4.2单位的纯化酶在20℃于各种缓冲液(45mM)中培养1小时。向标准反应混合物(蚕茧，实施例2(1))中加入部分培养溶液和1.71单位酶。测定残余活性。酶在pH5-9时稳定。结果示于图9。
(6)抑制物测定各种抑制物的影响。结果概括于表12。
表12各种抑制物对纯化的酶的影响抑制物 mM 相对活性(％)- 100N-乙基马来酰亚胺 1 97碘乙酸 1 394-氯亚汞苯甲酸 0.1 69叠氮化钠 1 59羟胺 1 37苯肼 1 8氨基脲 1 82Tiron(4，5-二羟基-1，3-苯-二磺酸二钠盐) 1 110菲咯啉 1 89联吡啶 1 1008-羟基喹啉 1 110EDTA(乙二胺四乙酸) 1 115二乙基二硫代氨基甲酸酯 1 89
实施例6甲醇对NA40静息细胞的影响根据表13，在0-20％(v/v)甲醇的存在下进行10分钟反应。如表14所示，加入5-15％的甲醇使活性增加。
表13与静息细胞的反应方法① ②③ ④ ⑤1.0M 3-氰基吡啶 1.0ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml 1.0ml0.1M KPB*(pH7.0) 0.9ml 0.8ml 0.7ml 0.6ml 0.5ml甲醇- 0.1ml 0.2ml 0.3ml 0.4ml细胞悬浮液 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml(0.388mg/ml)总体积 2.0ml 2.0ml 2.0ml 2.0ml 2.0ml*KPB＝磷酸钾缓冲液表14甲醇对拟无枝酸菌NA40的影响方法 甲醇[％(v/v)]相对活性[％]①0 100②5 123③10 128④15 130⑤20 105实施例7红球菌属微生物的富集向各种土壤样品中加入氰基乙酸作为根据表1的富集培养基的碳源和氮源并根据实施例1分离微生物红球菌GF270、GF578、GF473和GF376。
实施例8使用红球菌属微生物的生物转化(1)与紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)J1相比，红球菌GF674、红球菌GF578、红球菌GF270和红球菌GF376的热稳定性为了测定热稳定性，将上述微生物培养于下列培养基中。
紫红红球菌J1在EP-A0307926公开的培养基中培养72小时。红球菌属GF674、GF578、GF270和GF376在下列培养基中pH7.0时培养至96小时红球菌属GF674所在培养基含有酵母膏1.0g/l、果糖5.0g/l、麦芽膏10.0g/l、乙酰胺5.0g/l、KH2PO42.0g/l、MgSO4.7H2O 0.5g/l和CoCl2.6H2O10.0mg。红球菌属GF578所在培养基含有酵母膏1.0g/l、果糖15.0g/l、麦芽膏10.0g/l、乙酰胺25.0g/l、KH2PO42.0g/l、MgSO4.7H2O 0.5g/l和CoCl2.6H2O 5.0mg。红球菌GF270所在培养基含有酵母膏12.5g/l、柠檬酸钠5.0g/l、甲基丙烯酰胺7.5g/l、KH2PO42.0g/l、MgSO4.7H2O 0.5g/l和CoCl2.6H2O 30.0mg。红球菌GF376所在培养基含有酵母膏1.0g/l、柠檬酸钠10.0g/l、麦芽膏15.0g/l、丁酰胺7.5g/l、KH2PO42.0g/l、MgSO4.7H2O 0.5g/l和CoCl2.6H2O 15.0mg。
然后将静息细胞在各种温度下培养15分钟，并在根据实施例2(1)的标准反应条件下测定剩余活性。
在这一过程中发现红球菌GF674在50℃的相对活性接近100％并且在60℃仍有大约10％的活性。红球菌GF578同样在50℃有100％的相对活性并且在60℃有20％的相对活性。红球菌GF376在直至50℃有100％的相对活性，在60℃有70％的相对活性并在70℃仍有接近5％的相对活性。红球菌GF270在直至60℃有100％的相对活性并同样在70℃仍有5％的相对活性。与此相比较，紫红红球菌J1在直至50℃有100％的相对活性，60℃有80％并且70℃不再有任何活性。
总之，因此可以强调说红球菌GF270和GF376的热稳定性比J1好且GF270的热稳定性最好。
(2)红球菌属菌株的最适pH
pH对红球菌属菌株GF674、GF578、GF270和GF376的腈水合酶的影响是如实施例2(5)中所述进行测定。
红球菌GF674的最适pH是pH7.5-9.5，GF578的最适pH是pH8-8.5，GF270的最适pH是pH6-7.0和GF376的最适pH是pH6-8。
(3)红球菌属菌株的底物特异性底物特异性以相对活性表示概括于表15。
(4)红球菌属菌株的烟酰胺累积类似于实施例2(6)，用3-氰基吡啶(约500mM)培养红球菌属菌株GF674、GF578、GF270和GF376。在这一过程中，红球菌GF674在25小时内形成6M烟酰胺，GF578于10小时内形成5.5M烟酰胺，GF270于20小时内形成8.5M烟酰胺，GF376于20小时内形成7.5M烟酰胺。
(5)3-氰基吡啶对红球菌属菌株活性的耐受性为了测试3-氰基吡啶的耐受性，将静息细胞在20℃下在3-氰基吡啶的浓度为1-10％(w/v)时培养15分钟，然后离心移去细胞。用0.85％的NaCl清洗细胞后，测定剩余活性。
在各种底物浓度下测试3-氰基吡啶作为底物的耐受性。发现当底物浓度为2％(w/v)时，紫红红球菌J1的腈水合酶活性降低1.4倍，红球菌GF674的腈水合酶活性在4％(w/v)底物浓度时降低1.4倍，红球菌GF578的腈水合酶的活性几乎保持恒定直至底物浓度为8％，红球菌GF270的腈水合酶活性当底物浓度为4％(w/v)时降低1.17倍，红球菌GF376的腈水合酶活性当底物浓度为10％(w/v)时降低1.25倍。
与其他红球菌属菌株相比，紫红红球菌J1对3-氰基吡啶的耐受性最差。
表15

权利要求
1.以保藏号DSM 11617保藏的拟无枝酸菌NA40及其功能相当的变种和突变种，以及它们的酶提取物，其特征在于所述微生物能将腈转化成酰胺。
2.从根据权利要求1的微生物提取的具有腈水合酶活性的酶。
3.根据权利要求2所述的酶，其特征在于a)最适pH为pH6.5±1.0，b) pH7.0时的最适温度为35-40℃，c)对底物3-氰基吡啶的KM值为41.7mM±7.7mM。
4.制备酰胺的工艺，其特征在于，用根据权利要求1的微生物，使用这些微生物的酶提取物，或用根据权利要求2的酶将底物腈转化成相应的酰胺。
5.根据权利要求4的工艺，其特征在于所用的腈是含有1-10个碳原子的可任选取代的脂肪腈。
6.根据权利要求4的工艺，其特征在于所用的腈是在芳环体系中含有4-10个碳原子的可任选取代的芳腈。
7.根据权利要求6的工艺，其特征在于所述芳腈选自通式 或 的化合物，其中R1和R2是氢原子、卤素原子或C1-4烷基。
8.根据权利要求4-7中任一项的工艺，其特征在于所述反应是在0-50℃和pH4.5-10的条件下进行。
9.根据权利要求4-8中任一项的工艺，其特征在于所述反应是使用名为NA40(DSMZ 11617)的拟无枝酸菌属微生物或使用其功能相当的变种和突变种来进行的。
全文摘要
公开了一种新的从酰胺开始制备腈的生物技术工艺。该工艺使用拟无枝酸菌属、马杜拉放线菌属或红球菌属微生物。
文档编号C12R1/03GK1450167SQ0312011
公开日2003年10月22日 申请日期1998年7月22日 优先权日1997年7月22日
发明者卡伦·特雷丝·罗宾, 长泽透 申请人:隆萨股份公司