专利名称：基因重组溶菌酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因重组溶菌酶134和基因重组人溶菌酶及其纯品在保鲜防腐剂中的应用，特别是涉及一种基因重组溶菌酶134和基因重组人溶菌酶及其纯品在食品、饮料保鲜防腐和化妆品防腐中的应用。
背景技术：
食品，尤其是密封包装的现代食品，在长时间贮存或长途运输中，发生霉烂变质是人们最担心的问题。食品腐烂变质后，人们常见到的是产气、变酸、变臭、发黏、拉丝、长毛等等，这些现象都是食品在微生物侵染下产生的。从食品的主要成分糖、蛋白质和脂肪来讲糖的变质称为发酵，致使产气、变酸；蛋白质的变质称为腐败，由于产生了恶臭的硫化物、氮化物，致使食品发臭，产生异味；油脂的变质称为哈变或酸败，由于脂肪酸分解产生了低级的醛、酮，致使散发哈味。从造成食品腐烂变质的微生物来讲，有酵母、细菌和真菌，它们在造成食品腐烂变质的同时，自身得以大量繁殖，大量的细菌存在于水中或发生自溶，可使溶液变黏、拉丝；大量的真菌繁殖，由于菌丝或孢子的颜色不同而长出黑色、绿色、红色等不同颜色的“毛”。为了防止食品的腐烂变质，人们曾经使用过许多方法，比如盐腌、糖渍、干制、加热、真空包装、辐照等等，而最为简便有效的方法就是使用食品防腐剂、抗氧剂。食品在生产和贮藏过程中，受微生物、氧气等作用会发生腐败、霉变，给人们的生活和生产造成很大的损失，而合成的防腐防霉剂又往往给人类健康带来一定的不良影响。因此，天然、生态型保鲜剂，并用于食物的保鲜的研究，日益受到人们的重视。近些年来，由于抗菌药物的广泛使用，细菌耐药性不断加强，而且很多细菌已由单药耐药发展到多重耐药。饲料中添加抗菌药物，实际上等于持续低剂量用药。动物机体长期与药物接触，造成耐药菌不断增多，耐药性也不断增强。抗菌药物残留于动物性食品中，同样使人也长期与药物接触，导致人体内耐药菌的增加。利用鸡溶菌酶作为食品保鲜剂已有很多报道，而鸡溶菌酶的缺点是容易传染禽流感病毒，但未见基因重组人溶菌酶、重组溶菌酶134纯品作为食品保鲜防腐、化妆品防腐中的应用的报道和应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基因重组溶菌酶134和基因重组人溶菌酶及其纯品在保鲜防腐剂中的应用。
实际上，本发明的目的涉及一种基因重组溶菌酶134和基因重组人溶菌酶及其纯品在各种包装食品保鲜防腐中的应用。
本发明的另一目的涉及一种基因重组溶菌酶134和基因重组人溶菌酶及其纯品在各种包装化妆品防腐中的应用。
涉及一种基因重组溶菌酶134和基因重组人溶菌酶及其纯品在各种包装葡萄酒、干红葡萄酒、干白葡萄酒及各种果酒保鲜防腐中的应用。
涉及一种基因重组溶菌酶134和基因重组人溶菌酶及其纯品在各种包装牛奶食品保鲜防腐中的应用。
涉及一种基因重组溶菌酶134和基因重组人溶菌酶及其纯品在各种包装饮料及果汁食品保鲜防腐中的应用。
涉及一种基因重组溶菌酶134和基因重组人溶菌酶及其纯品在各种包装鲜肉和熟肉食品保鲜防腐中的应用。
涉及一种基因重组溶菌酶134和基因重组人溶菌酶及其纯品在各种包装鲜鱼肉和熟鱼肉食品保鲜防腐中的应用。
涉及一种基因重组溶菌酶134和基因重组人溶菌酶及其纯品在各种包装水果食品保鲜防腐中的应用。
涉及一种基因重组溶菌酶134和基因重组人溶菌酶及其纯品在各种包装蔬菜保鲜防腐中的应用。
涉及一种基因重组溶菌酶134和基因重组人溶菌酶及其纯品在各种包装肉类罐头和酱罐头及水果罐头食品保鲜防腐中的应用。
涉及一种基因重组溶菌酶134和基因重组人溶菌酶及其纯品在各种包装奶酪食品保鲜防腐中的应用。
为了更好地理解本发明的实质，下面用基因重组人溶菌酶和重组溶菌酶134纯品的实验及结果来说明其在食品、饮料保鲜防腐、化妆品防腐中的应用。
天然保鲜防腐剂成分的毒性远远低于人工合成保鲜防腐剂成分的毒性，因此，近年来从自然界寻求天然保鲜防腐剂成分的研究以引起各国科学家的重视。溶菌酶是人、动物细胞产生的一种天然抗菌物质，因溶菌酶在动物体内本身即具有，所以使用基因重组人溶菌酶、重组溶菌酶134纯品代替常用的人工合成保鲜防腐剂成分能够避免给人类健康带来一定的不良影响。
基因重组溶菌酶134的材料基因重组溶菌酶134的表达系统特征是采用甲醇营养型酵母菌作为宿主菌“毕赤酵母菌属的菌株”。在甲醇利用的表型上既采用甲醇利用快速型(mut+)，也使用甲醇利用慢速型(muts或must-)。主要采用毕赤酵母的smd1165(his4.prb1)，smd1163(his.pep4.prb1)，smd1168(his4.prb1)Gs115、km71菌株。本发明基因重组溶菌酶134的质粒主要是以pPIC9k系列的质粒整合上述菌株染色体上。
1、基因来源用化学合成法合成重组溶菌酶134基因。(由上海博亚生物有限公司合成)再通过DNA重组技术，将基因克隆于pUC19质粒载体中，克隆株通过核苷酸DNA序列分析，证实为重组溶菌酶134基因。
2、重组溶菌酶134基因的制备重组溶菌酶134基因设计并用化学合成法合成寡聚核苷酸引物(p1-5’-CCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAGGTCTTTGAAAGGTG-3’P2-5’-GGAATTCTTACACTCCACAACCTTG-3’，由上海博亚生物有限公司合成)采用PCR方法(反应体系RT产物10μl，10×PCR缓冲液5μl，10mmol/L dNTP 1μl，15Pmol/L P1引物1μl，15Pmol/L P2引物1μl，Taq酶1μl(5u)，重蒸水31μl，总体积50μl；反应条件94℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟，35个循环)。用DNA胶回收试剂盒(上海华舜生物技术有限公司产品)纯化PCR产物约420bp的DNA片段。用EcoRI和SalI双酶切纯化的PCR产物DNA，并克隆到pUC19质粒中(转化方法为CaCl2法，宿主菌为大肠杆菌JM109)，得到重组质粒pUC19-LZ/JM109转化子，转化子经酶切和核苷酸序列分析证实为人溶菌酶基因并再N端多四个氨基酸A E A E。
3、表达载体的构建以1中所得到的重组溶菌酶134基因重组质粒pUC19-LZ为模板，通过PCR和DNA重组技术，将重组溶菌酶134基因插入到毕赤氏酵母(Pichia pastoris)分泌型表达载体pPIC9K中，得到重组溶菌酶134表达载体pPIC9K-LZ如
图1所示。
4、人溶菌酶基因表达载体构建步骤以1所得人溶菌酶基因并再N端多四个氨基酸A E A E。重组质粒pUC19-hLZ为模板，用引物(p1-5’-CCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTAAGGTCTTTGAAAGGTG-3’P2-5’-GGAATTCTTACACTCCACAACCTTG-3’，由上海博亚生物有限公司合成)，采用PCR方法扩增出重组溶菌酶134基因与α因子信号肽阅读框相应的XhoI与EcoRI酶切位点和TAA终止密码。(反应体系为pUC19-hLZ DNA 1μl(50ng)，10XPCR缓冲液5μl，10mmol/L dNTP 1μl，15Pmol/L P3引物1μl，15Pmol/L P4引物1μl，pfu taq酶1μl(5u上海博彩生物有限公司产品)，重蒸水40μl，总体积50μl)；94℃30秒，58℃30秒，72℃1分钟30个循环后，72℃10分钟，4℃2分钟。再用XhoI与EcoRI酶切纯化的PCR目的DNA片段并克隆到分泌型毕赤酵母表达载体pPIC9上，得到重组子质粒pPIC9-hLZ。将所得2910个转化子，分别点种于2mg/ml G418 YEPD培养皿中，30℃培养2天后，筛选到抗2mg/ml G418的转化子82个，再按上法，从MMD菌种取出相应的82个转化子点种3mg/ml G418 YEPD培养基平皿，30℃培养2天后，筛到26个抗3mg/ml转化子，抗4mg/ml G418转化子13个最后筛选到抗4mg/ml G41867个转化子。
5、重组溶菌酶134的制备过程步骤；1、摇瓶种子制备以配制200毫升培养基为基准，用H3PO4(磷酸)4-8毫升、MgSO4(硫酸镁)1-5克，K2SO4(硫酸钾)2-6克，KOH(氢氧化钾)1-3克，CaSO42H2O(硫酸钙)1-3.5克，加蒸馏水至200毫升，高压灭菌后接种甘油管种子，摇床转数为每分钟250转，培养温度为20-35℃，在恒温床上培养36-48小时。2、种子罐培养以种子罐最大体积1升为基准，配制培养基用H3PO4(磷酸)25-19毫升，MgSO4(硫酸镁)13-17克，CaSO42H2O(硫酸钙)0.4-0.8克，K2SO4(硫酸钾)16-20克，KOH(氢氧化钾)2.12-6.12克，加蒸馏水至500毫升，高压灭菌后接种摇床种子；发酵反应器操作参数温度为20-32℃，PH值为2.0-8.0；溶解氧浓度为10-60％，当培养液中的细胞密度提高至OD200左右，种子培养结束。3、生产罐培养以10升为生产罐配制培养基，用H3PO4(磷酸)93-97毫升，MgSO4(硫酸镁)51-55克，CaSO42H2O(硫酸钙)19-23克，K2SO4(硫酸钾)61-65克，KOH(氢氧化钾)13-17克加蒸馏水至7升，高压灭菌后接种种子罐种子，发酵反应器操作参数温度控制在25-32℃，PH值为4.0-8.0，溶解氧浓度为10-60％；当培养液中细胞达到一定密度后，向培养液中流加甲醇诱导，此阶段的持续时间50-60小时，然后放罐培养结束。
纯化工艺将含有基因工程表达的人溶菌酶的毕赤酵母菌培养液用10-50万截流分子量膜超滤，收集滤液；用5000截流分子量超滤，收集浓液；浓液上羧甲基纤维素，洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱液，过G-50柱除盐，冰冻干燥，测定蛋白量、纯度和溶菌酶活性。
本发明的重组人溶菌酶、重组溶菌酶134纯品按如下份数比一般添加0.0001-0.05％加入食品饮料中；将3％NaCl、12.5ppmNaNO2、30～1000ppm重组人溶菌酶或重组溶菌酶134纯品混合用水稀释制成液体加入食品饮料中；重组人溶菌酶、重组溶菌酶134纯品300U～150000U％加入食品饮料中。家禽屠宰清洗后，浸入这种液体的冰水浴中，浸泡1小时以上。取出后即可包装，保鲜时间在20天以上。
一、重组溶菌酶134的体内杀菌实验(一)、材料1.菌株金黄色葡萄球菌、2.动物BALB/c小鼠(二)、方法金黄色葡萄球菌、感染BALB/c小鼠实验 将105～109CFU(菌落形成单位)的对数生长期的金黄色葡萄球菌、分别经腹腔接种于6周龄的BALB/c小鼠，观察结果，计算死亡率。
重组溶菌酶134保护活性的鉴定 将1×109对数生长期的金黄色葡萄球菌、腹腔接种于6周龄的BALB/c小鼠作为感染对照，溶菌酶保护组在接种细菌同时，注入不同剂量的重组溶菌酶134，观察7天结果，计算保护力，保护率％＝[(实验组成活率-对照组成活率)/对照组死亡率]×100％。
(三)、结果金黄色葡萄球菌、感染BALB/c小鼠的致死实验 用105～109CFU金黄色葡萄球菌、感染BALB/c小鼠，结果从106～109CFU感染BALB/c均可造成死亡，而且死亡多发生在3天之内，4天以后基本稳定，不再死亡。其中108CFU金黄色葡萄球菌、感染BALB/c小鼠死亡较为规律，109CFU金黄色葡萄球菌、感染BALB/c小鼠3天内全部死亡。我们采用109CFU金黄色葡萄球菌、进行溶菌酶抗金黄色葡萄球菌、感染BALB/c小鼠被动保护实验。
用四个不同剂量重组溶菌酶134对BALB/c小鼠进行金黄色葡萄球菌、感染的保护鉴定，连续观察7天，结果对照组BALB/c小鼠2天内全部死亡，保护组死亡时间略有推迟，在2-3天。3天不死亡的BALB/c小鼠在7天内不再死亡。四个不同剂量重组溶菌酶134均具有被动保护抵抗金黄色葡萄球菌、感染的活性，其中30万单位/公斤时保护率达80％。
表2.抗金黄色葡萄球菌单克隆抗体免疫保护实验结果Tab2.protertion of lysozyme against StaphylococcusDose(u/kg)NO.testNo.death Protective rate(％)30×10420 4 8015×10420 5 757.5×10420 7 653.75×10420 11 450 15 15 0二、重组人溶菌酶的体内杀菌实验(一)、材料1.菌株金黄色葡萄球菌、2.动物BALB/c小鼠(二)、方法金黄色葡萄球菌、感染BALB/c小鼠实验 将105～109CFU(菌落形成单位)的对数生长期的金黄色葡萄球菌、分别经腹腔接种于6周龄的BALB/c小鼠，观察结果，计算死亡率。
重组人溶菌酶保护活性的鉴定 将1×109对数生长期的金黄色葡萄球菌、腹腔接种于6周龄的BALB/c小鼠作为感染对照，溶菌酶保护组在接种细菌同时，注入不同剂量的重组溶菌酶134，观察7天结果，计算保护力，保护率％＝[(实验组成活率-对照组成活率)/对照组死亡率]×100％。
(三)、结果金黄色葡萄球菌、感染BALB/c小鼠的致死实验 用105～109CFU金黄色葡萄球菌、感染BALB/c小鼠，结果从106～109CFU感染BALB/c均可造成死亡，而且死亡多发生在3天之内，4天以后基本稳定，不再死亡。其中108CFU金黄色葡萄球菌、感染BALB/c小鼠死亡较为规律，109CFU金黄色葡萄球菌、感染BALB/c小鼠3天内全部死亡。我们采用109CFU金黄色葡萄球菌、进行溶菌酶抗金黄色葡萄球菌、感染BALB/c小鼠被动保护实验。
用四个不同剂量重组人溶菌酶对BALB/c小鼠进行金黄色葡萄球菌、感染的保护鉴定，连续观察7天，结果对照组BALB/c小鼠2天内全部死亡，保护组死亡时间略有推迟，在2-3天。3天不死亡的BALB/c小鼠在7天内不再死亡。四个不同剂量重组人溶菌酶均具有被动保护抵抗金黄色葡萄球菌、感染的活性，其中30万单位/公斤时保护率达80％。
表2.抗金黄色葡萄球菌单克隆抗体免疫保护实验结果Tab2.protertion of lysozyme against StaphylococcusDose(u/kg) NO.testNo.deathProtective rate(％)30×10420 4 8015×10420 5 757.5×10420 7 653.75×10420 11 450 15 15 0三、重组溶菌酶134及纯品的保护杜洛克猪的抗感染实验(一)、材料1.菌株沙门氏菌、2.动物杜洛克猪(二)、方法用重组溶菌酶134及纯品灌胃喂养杜洛克猪，正常饲料喂养作对照组。将1×109对数生长期的沙门氏菌灌胃分别接种于保护组和对照组杜洛克猪。观察结果，计算保护力。免疫保护率％＝[(实验组成活率-对照组成活率)/对照组死亡率]×100％
(三)、结果重组溶菌酶134及纯品保护杜洛克猪的抗感染保护实验结果表明用沙门氏菌感染杜洛克猪后，用重组溶菌酶134及纯品灌胃喂养杜洛克猪组保护率可达65％。正常饲料喂养的对照组全部死亡。
四、重组人溶菌酶的保护杜洛克猪的抗感染实验(一)、材料1.菌株沙门氏菌、2.动物杜洛克猪(二)、方法用重组人溶菌酶灌胃喂养杜洛克猪，正常饲料喂养作对照组。将1×109对数生长期的沙门氏菌灌胃分别接种于保护组和对照组杜洛克猪。观察结果，计算保护力。免疫保护率％＝[(实验组成活率-对照组成活率)/对照组死亡率]×100％(三)、结果重组人溶菌酶保护杜洛克猪的抗感染保护实验结果表明用沙门氏菌感染杜洛克猪后，用重组人溶菌酶灌胃喂养杜洛克猪组保护率可达65％。正常饲料喂养的对照组全部死亡。
五、重组溶菌酶134与抗生素的协同抗菌作用(一)、材料1.菌株临床分离株400余株，由成都抗生素工业研究所提供。
2.缓冲液 pH7.2 10mMTris-Cl缓冲液3.LB培养基4.克拉霉素，罗红霉素(二)、方法重组溶菌酶134与克拉霉素、罗红霉素分别(1∶1)联合使用，方法一(试管法)用pH7.2 10mM Tris-Cl缓冲液将金黄色葡萄球菌(或大肠杆菌)配成107-108CFU/mL左右浓度的菌液分别加入到不同华试管中，每管2mL。不同华试管中分别加入不同剂量的人溶菌酶(100μg-1mg)37℃过夜，首先在每管取20μL以10倍稀释法稀释，取100μL涂于LB培养基，肉眼观察浊度变化或用分光度计，37℃培养过夜；再将每管加入100μL 10％SDS(终浓度0.5％)摇匀，进行比浊(640)，观察结果，并计算原始管中细菌总数。溶菌酶134溶菌效果＝(对照管中细菌总数-实验管中细菌总数)/对照管中细菌总数×100％。
方法二(平板法)用pH7.2 10mM Tris-Cl缓冲液配制1％的琼脂糖高压灭菌后，冷却至40℃，加入细菌至106倾倒平板，用打孔器在平板上打孔，在孔中加入不同浓度的溶菌酶溶液(0-100mg/ml)，37℃孵箱孵育4-6小时，LB营养琼脂高压灭菌后，冷却至40℃，覆盖于上述琼脂糖平板上，将该平板至于紫外灯下照射20分钟。(LB营养琼脂覆盖于含菌的琼脂糖平板过程中，琼脂糖表面的游离细菌会混入营养琼脂中，其中冲到营养琼脂表面的细菌，由于氧气的作用，生长速度非常快，形成菌膜，影响琼脂糖与营养琼脂层之间细菌生长情况的观察，故用紫外灯照射杀死营养琼脂表面的细菌)。37℃孵箱培养过夜观察琼脂糖与营养琼脂层之间细菌生长情况，测量不同浓度溶菌酶形成的抑菌圈的直径，抑菌圈的直径》加样孔直径4mm者为最低有效杀菌浓度。(对于有鞭毛，运动活跃的细菌，会影响抑菌圈的形成，可考虑加入0.01％石炭酸抑制其运动。)
(三)、结果重组溶菌酶134与克拉霉素、罗红霉素分别(1∶1)联合使用，可使克拉霉素、罗红霉素对其抗菌活性增效2-16倍以上，个别菌株增效倍数在1000倍。
本研究所用的临床分离耐药株共30株，分别为金黄色葡萄球菌8株、绿脓假单胞杆菌3株、大肠杆菌7株、鲍鳗杆菌1株、粘质沙雷氏菌1株、变形杆菌3株、甲型链球菌1株。抑菌实验结果表明本研究所用的动物30株动物耐药菌，均对基因工程表达的重组溶菌酶134敏感，基因工程表达的重组溶菌酶134对实验菌株的最低抑菌浓度针对不同菌存在差异，有效抑菌浓度范围在50μg-1mg/ml之间。同时发现基因工程表达的重组溶菌酶134对不同菌的最低抑菌浓度之间的差异主要存在于相同菌的不同菌株之间，而对不同菌之间以及革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌之间，由于实验菌株数量较少，未发现存在明显差异。
六、重组人溶菌酶及纯品与抗生素的协同抗菌作用(一)、材料1.菌株临床分离株400余株，由成都抗生素工业研究所提供。
2.缓冲液 pH7.2 10mMTris-Cl缓冲液3.LB培养基4.克拉霉素，罗红霉素(二)、方法重组人溶菌酶与克拉霉素、罗红霉素分别(1∶1)联合使用，方法一(试管法)用pH7.2 10mM Tris-Cl缓冲液将金黄色葡萄球菌(或大肠杆菌)配成107-108CFU/mL左右浓度的菌液分别加入到不同华试管中，每管2mL。不同华试管中分别加入不同剂量的人溶菌酶(100μg-1mg)37℃过夜，首先在每管取20μL以10倍稀释法稀释，取100μL涂于LB培养基，肉眼观察浊度变化或用分光度计，37℃培养过夜；再将每管加入100μL 10％SDS(终浓度0.5％)摇匀，进行比浊(640)，观察结果，并计算原始管中细菌总数。人溶菌酶溶菌效果＝(对照管中细菌总数-实验管中细菌总数)/对照管中细菌总数×100％。
方法二(平板法)用pH7.2 10mM Tris-Cl缓冲液配制1％的琼脂糖高压灭菌后，冷却至40℃，加入细菌至106倾倒平板，用打孔器在平板上打孔，在孔中加入不同浓度的溶菌酶溶液(0-100mg/ml)，37℃孵箱孵育4-6小时，LB营养琼脂高压灭菌后，冷却至40℃，覆盖于上述琼脂糖平板上，将该平板至于紫外灯下照射20分钟。(LB营养琼脂覆盖于含菌的琼脂糖平板过程中，琼脂糖表面的游离细菌会混入营养琼脂中，其中冲到营养琼脂表面的细菌，由于氧气的作用，生长速度非常快，形成菌膜，影响琼脂糖与营养琼脂层之间细菌生长情况的观察，故用紫外灯照射杀死营养琼脂表面的细菌)。37℃孵箱培养过夜观察琼脂糖与营养琼脂层之间细菌生长情况，测量不同浓度溶菌酶形成的抑菌圈的直径，抑菌圈的直径》加样孔直径4mm者为最低有效杀菌浓度。(对于有鞭毛，运动活跃的细菌，会影响抑菌圈的形成，可考虑加入0.01％石炭酸抑制其运动。)(三)、结果重组人溶菌酶与克拉霉素、罗红霉素分别(1∶1)联合使用，可使克拉霉素、罗红霉素对其抗菌活性增效2-16倍以上，个别菌株增效倍数在1000倍。本研究所用的临床分离耐药株共30株，分别为金黄色葡萄球菌8株、绿脓假单胞杆菌3株、大肠杆菌7株、鲍鳗杆菌1株、粘质沙雷氏菌1株、变形杆菌3株、甲型链球菌1株。抑菌实验结果表明本研究所用的动物30株动物耐药菌，均对基因工程表达的重组人溶菌酶敏感，基因工程表达的重组人溶菌酶对实验菌株的最低抑菌浓度针对不同菌存在差异，有效抑菌浓度范围在50μg-1mg/ml之间。同时发现基因工程表达的重组人溶菌酶对不同菌的最低抑菌浓度之间的差异主要存在于相同菌的不同菌株之间，而对不同菌之间以及革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌之间，由于实验菌株数量较少，未发现存在明显差异。
七、重组溶菌酶134的体内杀菌实验(一)(一)、材料1、菌株大肠杆菌2、动物BALB/c小鼠(二)、方法大肠杆菌感染BALB/c小鼠实验 将105～109CFU(菌落形成单位)的对数生长期的大肠杆菌分别经腹腔接种于6周龄的BALB/c小鼠，观察结果，计算死亡率。
重组溶菌酶134保护活性的鉴定 将1×109对数生长期的大肠杆菌腹腔接种于6周龄的BALB/c小鼠作为感染对照，重组溶菌酶134保护组在接种细菌同时，注入不同剂量的重组溶菌酶134，观察7天结果，计算保护力，保护率％＝[(实验组成活率-对照组成活率)/对照组死亡率]×100％。
(三)、结果大肠杆菌感染BALB/c小鼠的致死实验 用105～109CFU大肠杆菌感染BALB/c小鼠，结果从106～109CFU感染BALB/c均可造成死亡，而且死亡多发生在3天之内，4天以后基本稳定，不再死亡。其中108CFU大肠杆菌感染BALB/c小鼠死亡较为规律，109CFU大肠杆菌感染BALB/c小鼠3天内全部死亡。我们采用109CFU大肠杆菌进行重组溶菌酶134抗大肠杆菌感染BALB/c小鼠被动保护实验。
用四个不同剂量重组溶菌酶134对BALB/c小鼠进行大肠杆菌感染的保护鉴定，连续观察7天，结果对照组BALB/c小鼠2天内全部死亡，保护组死亡时间略有推迟，在2-3天。3天不死亡的BALB/c小鼠在7天内不再死亡。四个不同剂量重组溶菌酶134均具有被动保护抵抗大肠杆菌感染的活性，其中30万单位/公斤时保护率达80％。
表1.抗大肠杆菌单克隆抗体免疫保护实验结果Tab2.protertion of lysozyme against V.E.coliDose(u/kg) NO.test No.death Protective rate(％)30×10420 4 8015×10420 5 757.5×10420 7 653.75×10420 11 450 15 15 0八、重组人溶菌酶的体内杀菌实验(一)(一)、材料1、菌株大肠杆菌2、动物BALB/c小鼠(二)、方法大肠杆菌感染BALB/c小鼠实验 将105～109CFU(菌落形成单位)的对数生长期的大肠杆菌分别经腹腔接种于6周龄的BALB/c小鼠，观察结果，计算死亡率。
重组人溶菌酶保护活性的鉴定 将1×109对数生长期的大肠杆菌腹腔接种于6周龄的BALB/c小鼠作为感染对照，重组人溶菌酶保护组在接种细菌同时，注入不同剂量的重组人溶菌酶，观察7天结果，计算保护力，保护率％＝[(实验组成活率-对照组成活率)/对照组死亡率]×100％。
(三)、结果大肠杆菌感染BALB/c小鼠的致死实验 用105～109CFU大肠杆菌感染BALB/c小鼠，结果从106～109CFU感染BALB/c均可造成死亡，而且死亡多发生在3天之内，4天以后基本稳定，不再死亡。其中108CFU大肠杆菌感染BALB/c小鼠死亡较为规律，109CFU大肠杆菌感染BALB/c小鼠3天内全部死亡。我们采用109CFU大肠杆菌进行重组人溶菌酶抗大肠杆菌感染BALB/c小鼠被动保护实验。
用四个不同剂量重组人溶菌酶对BALB/c小鼠进行大肠杆菌感染的保护鉴定，连续观察7天，结果对照组BALB/c小鼠2天内全部死亡，保护组死亡时间略有推迟，在2-3天。3天不死亡的BALB/c小鼠在7天内不再死亡。四个不同剂量重组人溶菌酶均具有被动保护抵抗大肠杆菌感染的活性，其中30万单位/公斤时保护率达80％。
表1.抗大肠杆菌单克隆抗体免疫保护实验结果Tab2.protertion of lysozyme against V.E.coliDose(u/kg) NO.test No.death Protective rate(％)30×104204 8015×104205 757.5×104207 65
3.75×1042011450 15150九、重组溶菌酶134的体内杀菌实验(二)(一)、材料1.菌株链球菌2.动物BALB/c小鼠(二)、方法链球菌感染BALB/c小鼠实验 将105～109CFU(菌落形成单位)的对数生长期的溶藻弧菌分别经腹腔接种于6周龄的BALB/c小鼠，观察结果，计算死亡率。
重组溶菌酶134保护活性的鉴定 将2×108对数生长期的链球菌腹腔接种于6周龄的BALB/c小鼠作为感染对照，重组溶菌酶134保护组在接种链球菌同时，注入不同剂量的重组溶菌酶134，观察7天结果，计算保护力，保护率％＝[(实验组成活率-对照组成活率)/对照组死亡率]×100％。
(三)、结果链球菌感染BALB/c小鼠的致死实验 用105～109CFU链球菌感染BALB/c小鼠，结果从106～109CFU感染BALB/c均可造成死亡，而且死亡多发生在3天之内，4天以后基本稳定，不再死亡。其中5×107～5×108CFU链球菌感染BALB/c小鼠死亡较为规律，109CFU链球菌感染BALB/c小鼠3天内全部死亡。我们采用2×108CFU链球菌进行重组溶菌酶134抗链球菌感染BALB/c小鼠被动保护实验。
用四个不同剂量重组溶菌酶134对BALB/c小鼠进行链球菌感染的保护鉴定，连续观察7天，结果对照组BALB/c小鼠3天内全部死亡，保护组死亡时间略有推迟，在3-5天。5天不死亡的BALB/c小鼠在7天内不再死亡。四个不同剂量重组溶菌酶134均具有被动保护抵抗链球菌感染的活性，其中30万单位/公斤时保护率达85％。
表2.抗链球菌单克隆抗体免疫保护实验结果Tab2.protertion of lysozyme against StreptococcusDose(u/kg) NO.test No.death Protective rate(％)30×104203 8515×104205 757.5×1042010503.75×1042011450 15150十、重组人溶菌酶及其纯品的体内杀菌实验(二)(一)、材料1.菌株链球菌2.动物BALB/c小鼠(二)、方法链球菌感染BALB/c小鼠实验 将105～109CFU(菌落形成单位)的对数生长期的溶藻弧菌分别经腹腔接种于6周龄的BALB/c小鼠，观察结果，计算死亡率。
重组人溶菌酶保护活性的鉴定 将2×108对数生长期的链球菌腹腔接种于6周龄的BALB/c小鼠作为感染对照，重组人溶菌酶保护组在接种链球菌同时，注入不同剂量的重组溶菌酶134，观察7天结果，计算保护力，保护率％＝[(实验组成活率-对照组成活率)/对照组死亡率]×100％。
(三)、结果链球菌感染BALB/c小鼠的致死实验 用105～109CFU链球菌感染BALB/c小鼠，结果从106～109CFU感染BALB/c均可造成死亡，而且死亡多发生在3天之内，4天以后基本稳定，不再死亡。其中5×107～5×108CFU链球菌感染BALB/c小鼠死亡较为规律，109CFU链球菌感染BALB/c小鼠3天内全部死亡。我们采用2×108CFU链球菌进行重组人溶菌酶抗链球菌感染BALB/c小鼠被动保护实验。
用四个不同剂量重组人溶菌酶及其纯品对BALB/c小鼠进行链球菌感染的保护鉴定，连续观察7天，结果对照组BALB/c小鼠3天内全部死亡，保护组死亡时间略有推迟，在3-5天。5天不死亡的BALB/c小鼠在7天内不再死亡。四个不同剂量重组溶菌酶134均具有被动保护抵抗链球菌感染的活性，其中30万单位/公斤时保护率达85％。
表2.抗链球菌单克隆抗体免疫保护实验结果Tab2.protertion of lysozyme against StreptococcusDose(u/kg) NO.test No.death Protective rate(％)30×104203 8515×104205 757.5×1042010503.75×1042011450 15150十一、重组溶菌酶134的保护新鲜禽、畜、鱼(一)、材料1、菌株金黄色葡萄球菌2、新鲜禽、畜、鱼肉(二)、方法重组溶菌酶134保护新鲜禽、畜、鱼肉抗感染实验 将3％NaCl、12.5ppmNaNO2、30～1000ppm重组人溶菌酶或重组溶菌酶134纯品混合用水稀释制成液体，将新鲜禽、畜、鱼肉禽浸渍中。将1×109对数生长期的金黄色葡萄球菌感染新鲜禽、畜、鱼肉。观察结果，计算保护力。保护率％＝[(实验组-对照组)/对照组感染率]×100％(三)、结果重组溶菌酶134保护新鲜禽、畜、鱼肉抗感染实验结果表明用金黄色葡萄球菌感染新鲜禽、畜、鱼肉，用重组人溶菌酶或重组溶菌酶134纯品混合用水稀释制成液体，将新鲜禽、畜、鱼肉禽浸渍中20天保护率可达95％以上。对照组全部感染。
十二、重组人溶菌酶的保护新鲜禽、畜、鱼(一)、材料1、菌株金黄色葡萄球菌2、新鲜禽、畜、鱼肉(二)、方法将3％NaCl、12.5ppmNaNO2、30～1000ppm重组人溶菌酶或重组溶菌酶134纯品混合用水稀释制成液体，将新鲜禽、畜、鱼肉禽浸渍中。将1×109对数生长期的金黄色葡萄球菌感染新鲜禽、畜、鱼肉。观察结果，计算保护力。保护率％＝[(实验组-对照组)/对照组感染率]×100％(三)、结果重组人溶菌酶保护新鲜禽、畜、鱼肉抗感染实验结果表明用金黄色葡萄球菌感染新鲜禽、畜、鱼肉，用重组人溶菌酶或重组溶菌酶134纯品混合用水稀释制成液体，将新鲜禽、畜、鱼肉禽浸渍中20天保护率可达95％以上。对照组全部感染。
十三、重组人溶菌酶和重组溶菌酶134保护牛奶的抗感染实验(一)、材料1.菌株大肠杆菌2.新鲜牛奶(二)、方法重组溶菌酶134保护新鲜牛奶的抗感染实验 重组人溶菌酶、重组溶菌酶134纯品按如下重量份数比一般添加0.0001-0.05％加入新鲜牛奶，设正常对照组。将5×108对数生长期的大肠杆菌分别接种于保护组和对照组新鲜牛奶。观察结果，计算保护力。免疫保护率％＝[(实验组-对照组)/对照组感染率]×100％(三)、结果重组溶菌酶134保护新鲜牛奶的抗感染实验结果表明用大肠杆菌感染新鲜牛奶，重组人溶菌酶、重组溶菌酶134纯品保护新鲜牛奶40天保护率可达95％，正常对照组全部感染。
十四、重组人溶菌酶和重组溶菌酶134保护果酒的抗感染实验(一)、材料1、菌株大肠杆菌2、葡萄酒、干红葡萄酒、干白葡萄酒(二)、方法重组人溶菌酶和重组溶菌酶134保护果酒的抗感染实验 重组人溶菌酶、重组溶菌酶134纯品按如下重量份数比一般添加0.0001-0.05％加入葡萄酒、干红葡萄酒、干白葡萄酒，设正常对照组。将5×108对数生长期的大肠杆菌分别接种于保护组和对照组葡萄酒、干红葡萄酒、干白葡萄酒。观察结果，计算保护力。免疫保护率％＝[(实验组-对照组)/对照组感染率]×100％(三)、结果重组溶菌酶134保护葡萄酒、干红葡萄酒、干白葡萄酒的抗感染实验结果表明用大肠杆菌感染葡萄酒、干红葡萄酒、干白葡萄酒，重组人溶菌酶、重组溶菌酶134纯品保护葡萄酒、干红葡萄酒、干白葡萄酒40天保护率可达95％，正常对照组全部感染。
十五、重组人溶菌酶和重组溶菌酶134保护新鲜蔬菜水果的抗感染实验(一)、材料1.菌株金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌、2.新鲜蔬菜水果(二)、方法重组人溶菌酶和重组溶菌酶134保护新鲜蔬菜水果的抗感染实验 重组人溶菌酶、重组溶菌酶134及纯品300U～150000U％用喷雾的方式保护新鲜蔬菜水果，设正常对照组。将1×109对数生长期的金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌喷雾的方式分别接种于保护组和对照组新鲜蔬菜水果。观察结果，计算保护力。免疫保护率％＝[(实验组-对照组)/对照组]×100％(三)、结果重组人溶菌酶和重组溶菌酶134保护新鲜蔬菜水果的抗感染实验结果表明用金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌喷雾的方式分别感染新鲜蔬菜水果后，用重组人溶菌酶和重组溶菌酶134喷雾保护新鲜蔬菜水果20天，保护率可达95％以上。正常的对照组全部腐烂。
十六、重组人溶菌酶和重组溶菌酶134保护化妆品防腐实验(一)、材料1、菌株霉菌2、化妆品(二)、方法重组人溶菌酶和重组溶菌酶134保护化妆品防腐实验，重组人溶菌酶、重组溶菌酶134纯品按如下重量份数比一般添加0.0001-0.05％加入化妆品中保护化妆品，设正常对照组。将1×109对数生长期的霉菌分别接种于保护组和对照组化妆品。观察结果，计算保护力。免疫保护率％＝[(实验组-对照组)/对照组]×100％(三)、结果重组人溶菌酶和重组溶菌酶134保护化妆品防腐实验结果表明用霉菌分别感染化妆品后，用重组人溶菌酶和重组溶菌酶134保护化妆品防腐实验结果240天，保护率可达95％以上。正常的对照组全部发霉。
本发明的积极效果在于其原料来源丰富、价廉、无毒副作用；制备工艺简单。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步的描述实施例1将重组人溶菌酶及其纯品按0.0001％的比例加入到包装食品中作为保鲜防腐剂。
实施例2
将重组人溶菌酶及其纯品0.05％加入到包装水果中作为保鲜防腐剂。
实施例3将重组溶菌酶134及其纯品按0.03％的比例加入到蔬菜食品中作为保鲜防腐剂。
实施例4将重组溶菌酶134及其纯品按0.03％的比例加入到葡萄酒、干红葡萄酒、干白葡萄酒及各种果酒作为保鲜防腐剂。
实施例5将3％NaCl、12.5ppmNaNO2、30ppm重组人溶菌酶及其纯品混合用水稀释制成液体加入包装奶酪食品中作为保鲜防腐剂。
实施例6将3％NaCl、12.5ppmNaNO2、1000ppm重组人溶菌酶及其纯品混合用水稀释制成液体加入饮料中作为保鲜防腐剂。
实施例7将3％NaCl、12.5ppmNaNO2、80ppm重组溶菌酶134及其纯品混合用水稀释制成液体加入牛奶中作为保鲜防腐剂。
实施例8将3％NaCl、12.5ppmNaNO2、900ppm重组溶菌酶134及其纯品混合用水稀释制成液体加入果汁饮料作为保鲜防腐剂中。
实施例9
将重组人溶菌酶及其纯品300U用水稀释制成液体，将新鲜禽、畜、鱼屠宰清洗后，浸入这种液体的冰水浴中，浸泡1小时以上，取出后即可包装，保鲜时间在20天以上，保护率可达95％以上。
实施例10将重组人溶菌酶及其纯品150000U用水稀释制成液体，将新鲜禽、畜、鱼屠宰清洗后，浸入这种液体的冰水浴中，浸泡1小时以上，取出后即可包装，保鲜时间在20天以上，保护率可达95％以上。
实施例11将重组溶菌酶134及其纯品按1000U加入到化妆品中作为保鲜防腐剂。
实施例12将重组溶菌酶134及其纯品按120000U加入到包装肉类罐头和酱罐头及水果罐头食品保鲜防腐剂。
权利要求
1.基因重组溶菌酶134和基因重组人溶菌酶及其纯品在各种包装食品保鲜防腐中的应用。
2.基因重组溶菌酶134和基因重组人溶菌酶及其纯品在各种包装化妆品防腐中的应用。
3.基因重组溶菌酶134和基因重组人溶菌酶及其纯品在葡萄酒、干红葡萄酒、干白葡萄酒及各种果酒保鲜防腐中的应用。
4.基因重组溶菌酶134和基因重组人溶菌酶及其纯品在各种包装牛奶、饮料及果汁食品保鲜防腐中的应用。
5.基因重组溶菌酶134和基因重组人溶菌酶及其纯品在各种包装鲜肉和熟肉食品保鲜防腐中的应用。
6.基因重组溶菌酶134和基因重组人溶菌酶及其纯品在各种包装鲜鱼肉和熟鱼肉食品保鲜防腐中的应用。
7.基因重组溶菌酶134和基因重组人溶菌酶及其纯品在各种包装水果、蔬菜食品保鲜防腐中的应用。
8.基因重组溶菌酶134和基因重组人溶菌酶及其纯品在各种包装肉类罐头和酱罐头及水果罐头食品保鲜防腐中的应用。
9.基因重组溶菌酶134和基因重组人溶菌酶及其纯品在各种包装奶酪食品保鲜防腐中的应用。
10.根据权利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、所述的溶菌酶包括基因工程表达的人溶菌酶、基因工程表达人溶菌酶的氨基端带有(谷氨酸—丙氨酸)2或(谷氨酸—丙氨酸)3修饰的人溶菌酶、基因工程表达或化学合成突变体人溶菌酶。
全文摘要
本发明涉及一种基因重组溶菌酶
文档编号A23L3/3571GK1570096SQ20041001084
公开日2005年1月26日 申请日期2004年5月12日 优先权日2004年5月12日
发明者张华 , 安米, 安献禄 申请人:长春奇龙生物技术研究所