专利名称：单克隆抗体、编码该抗体的基因、杂交瘤、药物组合物和诊断试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的对癌症的诊断和治疗有用的单克隆抗体、编码所述
单克隆抗体的DNA、产生所述抗体的杂交瘤以及各包含有所述抗体的药 物组合物和诊断试剂。
背景技术：
在癌症治疗领域，目前一直在研究针对特定种类癌细胞的导向疗法 以治疗实体癌，对于所述实体癌，还没有显示充分效果的治疗剂。在所 述导向治疗中，特异性识别癌细胞的单克隆抗体是有效的。但是，鼠单 克隆抗体的使用还存在一些问题，例如由于免疫应答引起的诸如过敏反 应等副作用而导致难以重复施用(非专利文献1)。
为了克服所述问题，进行了旨在获得副作用降低的单克隆抗体的尝 试。虽然，通过遗传工程产生恒定区被人抗体恒定区置换的嵌合抗体技 术和产生除高变区之外所有其它区域都被人抗体区域置换的人源化抗体 技术是已知的，但是，从降低副作用的观点来看，还是希望获得完全的 人单克隆抗体。作为获得完全的人单克隆抗体的方法有利用获自人的淋 巴细胞的杂交瘤方法(非专利文献2)。虽然有一些关于对癌细胞起作用的 人单克隆抗体的报道(专利文献1)，但是，由于以获得产生所需抗体的人 B细胞为目的而进行被动免疫非常困难，所以制备与癌细胞充分反应的 人单克隆抗体一直仍然是非常困难的，而且还未建立起使产生抗体的细 胞无限增殖的任何有效方法。
即便如此，使用人源化抗体技术等，己经开发了一些通过单独使用 或与抗癌药物合用后显示出对特定癌细胞具有杀伤作用或抗增殖作用的 单克隆抗体。近年来，报道了抗Her2人源化抗体(HERCEPTIN)在乳腺癌 中的应用(非专利文献3)、使用抗EGF(表皮生长因子)受体抗体(非专利 文献4)或抗VEGF(血管内皮生长因子)抗体(非专利文献5)的临床试验 等。但是，迄今还没有开发出任何能够用于包括很多患者患有的非小细 胞肺癌或顽固性癌症如胰腺癌在内的癌症的导向治疗的任何抗体。为了 治疗此类癌症，希望获得副作用低的对癌组织具有高度特异性的单克隆 抗体。
专利文献2公开了对癌症组织具有高特异性的单克隆抗体，如同这 样的抗体，希望能获得更多的抗体。 [专利文献1] JP3236667 [专利文献2] JP2005-040126美国科学院院报(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.，)，第86
巻4220页，1989癌症研究(CancerRes.)，第45巻263页，1985 [非专利文献3]肿瘤学(Oncology)，第63巻增刊1， 25 32页，2002 [非专利文献4]肿瘤学论坛(SeminOncol.)，第29巻第5期增刊14，
18 30页，2002肿瘤学论坛(Semin Oncol.)，第29巻第6期增刊16， 10 14页，2002分子细胞生物学(Mol Cell Biol)，第7巻第11期， 3908 3915页，198
发明内容
本发明的一个目的是提供副作用低的、对癌症，尤其是非小细胞肺 癌、胰腺癌和胃癌的诊断和治疗有用的单克隆抗体。
为了提供能用于癌组织的导向治疗的单克隆抗体，本发明的发明人 进行了广泛的研究。结果，他们制备了产生新的能特异性识别癌细胞如 HLC-1、 PANC-1、 HT29或MKN45的人单克隆抗体的杂交瘤细胞，并且 发现，利用所述抗体可以获得对导向治疗有用的抗癌药物。于是，他们 完成了本发明。
也就是，本发明提供如下
(1) 一种单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体的重链可变区包含SEQ
ID NO: 74、 76和78所示的氨基酸序列。
(2) 如(l)所述的单克隆抗体，其中，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 72所示的氨基酸序列。
(3) 如(l)所述的单克隆抗体，其中，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 104所示的氨基酸序列。
(4) 一种单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体的轻链可变区包含SEQ ID NO: 80、 82和84所示的氨基酸序列。
(5) 如(4)所述的单克隆抗体，其中，所述轻链可变区包含SEQ ID NO: 70所示的氨基酸序列。
(6) 如(4)所述的单克隆抗体，其中，所述轻链可变区包含SEQ ID NO: 106所示的氨基酸序列。
(7) —种单克隆抗体，其中，所述单克隆抗体的重链可变区包含SEQ ID NO: 74、 76和78所示的氨基酸序列，且所述单克隆抗体的轻链可变 区包含SEQIDNO: 80、 82和84所示的氨基酸序列。
(S)如(7)所述的单克隆抗体，其中，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 72所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区包含SEQ ID NO: 70所 示的氨基酸序列。
(9) 如(7)所述的单克隆抗体，其中，所述重链可变区包含SEQ ID NO: 104所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区包含SEQ ID NO: 106 所示的氨基酸序列。
(10) 如(1) (9)任一项所述的单克隆抗体，其中，所述的单克隆抗体 是人抗体。
(11) 一种DNA，该DNA编码(1) (10)任一项所述的单克隆抗体。
(12) 如(ll)所述的DNA，其中，编码所述重链可变区的区域包含SEQ ID NO: 73、 75和77所示的核苷酸序列，且编码所述轻链可变区的区域 包含SEQ ID NO: 79、 81和83所示的核苷酸序列。
(13) 如(11)或(12)所述的DNA，其中，编码所述重链可变区的区域
包含SEQIDNO: 71所示的核苷酸序列，且编码所述轻链可变区的区域 包含SEQIDNO: 69所示的核苷酸序列。
(14) 如(11)或(12)所述的DNA，其中，编码所述重链可变区的区域 包含SEQIDNO: 103所示的核苷酸序列，且编码所述轻链可变区的区 域包含SEQIDNO: 105所示的核苷酸序列。
(15) —种重组载体，该载体包含(11) (14)任一项所述的DNA。
(16) —种转化体，该转化体包含(15)所述的重组载体。
(17) —种杂交瘤，该杂交瘤产生(1) (10)任一项所述的单克隆抗体。
(18) —种药物组合物，该药物组合物包含(1) (10)任一项所述的单 克隆抗体。
(19) 如(18)所述的药物组合物，该药物组合物是用于治疗癌症的组 合物。
(20) 如(19)所述的药物组合物，其中，所述用于治疗癌症的组合物 是用于治疗选自由非小细胞肺癌、胰腺癌和胃癌组成的组中的一种或两 种或两种以上的癌症的组合物。
(21) 如(18) (20)任一项所述的药物组合物，其中，所述单克隆抗体 被锚定到其中包封有毒素或抗癌药物的脂质体的表面。
(22) —种诊断试剂，该诊断试剂包含(1) (10)任一项所述的单克隆抗体。
图1是显示020630-18-1抗体对各种组织切片的反应性的图示(照片)。
图2是显示1F8抗体分别与活的肺癌细胞表面和活的正常肺细胞表 面的结合活性图(照片)。
图3是显示1F8抗体分别对培养的癌细胞系HLC-1、 PANC-1和 MKN45的抗-增殖作用图。
图4是显示Y-1F8抗体对经固定癌细胞的表面的结合活性图(照片)。
具体实施例方式
在下文中，将对本发明进行详细描述。 <1>本发明的单克隆抗体
本发明所述的单克隆抗体是特异性地识别癌细胞特异性抗原的单克 隆抗体。
本发明的所述单克隆抗体的具体例子包括其重链可变区包含SEQ ID NO: 74、 76和78所示的氨基酸序列且其轻链可变区包含SEQ ID NO: 80、 82和84所示的氨基酸序列的抗体。在SEQ ID NO: 76所示的氨基 酸序列中，氨基酸位点2可以是Ile或Thr，氨基酸位点16可以是Lys或 Asn。换句话说，所述重链可变区有(2Ile， 16Lys)， (2Ile， 16Asn)， (2Thr， 16Lys)和(2Thr， 16Asn)四种类型的序列。
上述六种序列是重链和轻链的可变区中称为"高变区"的区域的序 列。抗体由重链和轻链构成，并且这些链的每一条由恒定区和可变区组 成。可变区包含高变区，所述高变区决定免疫球蛋白作为抗体的特异性 以及所述抗体与抗原表位的结合亲和力。因此，只要本发明的高变区包 含上述各序列，除高变区以外的区域可以来自任何其它抗体。在这里， 术语"其它抗体"包括获自除人之外的其它生物体的抗体，但对于降低副 作用来说，优选人源抗体。
在本发明中，特别优选的单克隆抗体可以是在其重链可变区中包含 SEQ ID NO: 72所示氨基酸序列且在其轻链可变区中包含SEQ ID NO: 70所示氨基酸序列的单克隆抗体。这里，在序列SEQIDNO: 72，位点 51的氨基酸可以是lie或Thr，位点65的氨基酸可以是Lys或Asn。
本发明的抗体可在SEQIDNO:72(重链)和70(轻链)的序列中具有一 个或数个氨基酸的替换、缺失或增加，只要所述抗体具有能特异性地识 别癌细胞特异性抗原的特异性。在此处，术语"数个"意思是优选2 5个，更优选2 3个，特别优选2个。这样的替换、缺失或增加可以引 入高变区，但优选为引入在除可变区中高变区之外的区域。
在本发明中，术语"单克隆抗体"是指包括单克隆抗体和其片段、 F(ab')2抗体、F(ab')抗体、短链抗体(scFv)、双抗体和微型抗体的任意抗体。
当单克隆抗体含有恒定区时，其重链和轻链的恒定区的氨基酸序列优选为以下文献中描述的恒定区的氨基酸序列之一核酸研究(Nucleic Acids Research)第14巻1779页，1986;生物化学杂志(The Journal of Biological Chemistry)第257巻1516页，1982;和细胞(Cell)第22巻i97页，1980。 包含恒定区和可变区的本发明抗体可以是，例如，包含SEQIDNO:104(重 链)所示氨基酸序列和SEQ ID NO: 106(轻链)所示氨基酸的抗体。
本发明的单克隆抗体可以通过在培养基中培养产生本发明所述抗体 的杂交瘤而获得，所述培养基如含胎牛血清的RPMI1640培养基。选择 性地，所述单克隆抗体可以通过以下方式获得通过PCR方法或化学合 成方法制备基因(例如含有SEQ ID NO: 103(重链)或SEQ ID NO: 105(轻 链)的基因)，在该基因中，编码重链或轻链的恒定区的DNA与编码各可 变区的DNA(例如含SEQIDNO: 71或69的DNA)相连接；将获得的基 因插入到常规使用的能够表达所述基因的表达载体(例如 pcDNA3.1(Invitrogen))中；在宿主细胞如CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞) 或大肠杆菌Escherichea coli)中表达所述基因以产生所述抗体；使用蛋白 A柱等从培养基中纯化所获得的抗体。
<2>本发明的DNA
本发明的DNA是编码本发明所述单克隆抗体的DNA。其例子包括 包含编码重链可变区(含有SEQ ID NO: 74、 76和78所示的氨基酸序列) 的区域和编码轻链可变区(含有SEQIDNO: 80、 82和84所示的氨基酸 序列)的区域的DNA。优选地，所述DNA包含编码重链可变区的区域(含 有SEQ ID NO: 73、 75和77所示的核苷酸序列)；和编码轻链可变区的 区域(含有SEQIDNO: 79、 81和83所示的核苷酸序列)。这里，在SEQ ID NO: 75序列中，在位点5的核苷酸可以是"t"或"c"，在位点48的核 苷酸可以是"g"或"t"。
由这些DNA序列编码的高变区是确定所述抗体的特异性的区域，因 此编码其它区域的序列可以是获自其它抗体的序列。这里，术语"其它抗 体"包括获自除人之外的其它生物体的抗体，但对于降低副作用来说，优 选人源抗体。
在本发明中，特别优选的DNA可以是包含编码重链可变区中的SEQ ID NO: 72所示氨基酸序列的序列和编码轻链可变区中的SEQ ID NO: 70所示氨基酸序列的DNA。在这些DNA中，特别优选的DNA是包含 编码重链可变区的SEQ ID NO: 71所示核苷酸序列和编码轻链可变区的 SEQ ID NO: 69所示核苷酸序列的DNA。这里，在SEQ ID NO: 71序 列中，位点152的核苷酸可以是"t"或"c",并且位点195的核苷酸可以是 "g"或"t"。
另外，只要本发明的DNA编码特异性地识别癌细胞特异性抗原的单 克隆抗体，其可以是在严格条件下能够与含有SEQIDNO: 71的核苷酸 序列和SEQIDNO: 69的核苷酸序列的DNA杂交的DNA。此处的严格 条件包括在相当于6(tc、 lxSSC和0.i^SDS，优选0.1xSSC和0.P/qSDS 的盐浓度下进行杂交的条件；该条件相当于Southern杂交中的洗涤条件。
本发明的DNA可以是编码重链和轻链的所有恒定区和可变区的 DNA。可选择地，所述DNA可以是只编码重链和轻链的可变区的DNA。 当所述DNA编码所有恒定区和可变区时，重链和轻链的恒定区的核苷酸 序列优选为以下文献中描述的核苷酸序列核酸研究(NucIeic Adds Research),第14巻1779页，1986;生物化学杂志(The Journal of Biological Chemistry),第257巻1516页，1982;和细胞(Cell),第22巻197页，1980。 本发明的编码恒定区和可变区的DNA包括含有SEQ ID NO: i03(重链) 所示的核苷酸序列和SEQ ID NO: 105(轻链)所示的核苷酸序列的DNA。
本发明的DNA可以通过下述方法获得。首先，利用市售RNA提取 试剂盒由本发明的细胞(如杂交瘤细胞)制备总RNA,然后利用随机引物 等通过反转录酶由总RNA合成cDNA。随后，利用分别具有在人抗体重 链或轻链可变区中保守的序列的寡聚核苷酸作为引物，通过PCR方法扩 增编码所述抗体的cDNA。编码恒定区的序列可以通过PCR方法扩增已 知序列来获得。将所述DNA插入测序用的质粒后，可以通过传统方法测 定所述DNA的核苷酸序列。编码本发明的单克隆抗体的DNA也可以通 过化学合成可变区序列或其部分，并将其连接至含有所述恒定区的序列 而获得。
另外，本发明还提供含有本发明DNA的重组载体和含有所述重组载 体的转化体。所述重组载体可以是能够用于在原核细胞如大肠杆菌中进 行基因表达的载体(例如pBR322、 pUC119或其衍生物)，优选能够用于在 真核细胞中进行基因表达的载体，和更优选能够用于在获自哺乳动物的 细胞中进行基因表达的载体。能够用于在获自哺乳动物的细胞中进行基 因表达的载体的例子包括质粒载体如pcDNA3.1(由Invitrogen有限公司生 产)和病毒载体如pDON-AI DNA(由TAKARA BIO INC.生产)。欲导入本 发明的重组载体的转化体可以是原核细胞如大肠杆菌，但优选真核细胞， 更优选获自哺乳动物的细胞。获自哺乳动物的细胞的例子包括中国仓鼠 卵巢细胞(CHO细胞)。
<3>本发明的杂交瘤
本发明的杂交瘤是产生如上所述的单克隆抗体的杂交瘤。本发明的 杂交瘤的例子包括将在下文中描述的实施例中进行解释的杂交瘤株 020630-18-1和020630-18-l-lF8-l。本发明的杂交瘤可以通过以下方法获 得。首先，基于A. Imam等人的方法(癌症研究(Cancer Research),第45 巻263页，1985)，从经诊断患有胃癌的患者取下的肿瘤组织中分离出肿 瘤浸润淋巴细胞，然后利用聚乙二醇将包含淋巴细胞的细胞与小鼠骨髓 瘤细胞融合以获得杂交瘤细胞。随后，使用所获得的杂交瘤的上清液进 行酶免疫测定，然后将产生与以多聚甲醛固定的各种癌细胞系呈阳性反 应的抗体的杂交瘤细胞选择出来，进一步通过有限稀释来克隆所获得的 杂交瘤。
<4>本发明的药物组合物
本发明的药物组合物包含本发明的单克隆抗体和药学上可接受的载 体。所述药学上可接受的载体的例子包括可溶性载体如已知的生理上可 接受的缓沖液(例如磷酸盐缓冲液)或固态的载体如乳胶珠。
本发明的药物组合物适合用作癌症，尤其是非小细胞肺癌、胰腺癌 和胃癌的治疗剂。另外，本发明的药物组合物可以是利用所述单克隆抗 体本身的细胞杀伤作用和抗增殖作用的组合物；或是用于通过将诸如阿 霉素等抗癌药物与本发明的单克隆抗体结合从而将所述药物耙向到癌组
织的组合物。
在本发明中，特别适宜的药物组合物是将本发明的抗体锚定到含有 毒素或抗癌药物等的脂质体上的组合物。用作锚定所述抗体的脂质体可 以由脂双层组成。选择性地，使用的脂质体可由脂多层或脂单层组成。 所述脂质体的组分的例子包括磷脂酰胆碱、胆固醇和磷脂酰乙醇胺，并 进一步包括用作使所述脂质体带电的物质的磷脂酸。所述组分的比例是，
例如，在每摩尔(mol)的磷脂酰胆碱中胆固醇为0.3mol lmo1，优选为 0.4 mo1 0.6 mol;磷脂酰乙醇胺为0.01 mo1 0.2 mol，优选为0.02 mo1 0.1 mol;磷脂酸为0 0.4mol，优选为0 0.15 mol。
生产脂质体的方法可以是任何传统方法。例如，脂质体可以通过以 下方法(BiochimicaetBiophysica Acta第812巻55页，1985)生产:使用 匀浆器等使去除了溶剂的脂质的混合物乳化；然后进行冻融，以获得多 层脂质体；再利用超声作用、高速匀浆、或通过具统一孔径的膜加压过 滤来适当调整所述脂质体的孔径。优选地，所述脂质体的粒径为30nm 200 nm。
包封在脂质体中的药剂的例子包括制癌剂如阿霉素、道诺霉素、
丝裂霉素、顺铂、长春新碱、表柔比星、氨甲喋呤、5-Fu(5-氟尿喷啶)和
阿克拉霉素；毒素如蓖麻蛋白A和白喉毒素；以及反义RNA。可以通过
将所述脂质与所述药剂水溶液经水合作用，将所述药剂包封入脂质体中。
另外，对于阿霉素、道诺霉素和表柔比星，可以利用pH梯度采用远距离 装载法(remote-loading method)(癌症研究(Cancer Res.)，第49巻5922页， 1989)将其封入所述脂质体中。
将所述单克隆抗体锚定于脂质体表面上的方法的例子包括以下方 法通过将纯化抗体与疏水物质相偶联而将抗体锚定于脂质体上的方法、 和利用戊二醛使抗体与磷脂酰乙醇胺交联的方法。更优选的方法是以下
方法制备含有己导入有马来酰亚胺基团的脂质的脂质体，和将抗癌剂
或毒素包封在该脂质体中；随后通过使上述脂质体与硫醇化的抗体反应 而将所述抗体锚定于所述脂质体的表面上。另外，可以优选使用具有与 氨基的反应位点和巯基或固有的巯基部分的水溶性高分子衍生物(JP
11-152234A)。另一方面，脂质体表面可以通过使剩余马来酰亚胺基团与 硫醇化的聚亚烷基二醇部分反应而进行修饰。
将巯基引入抗体的方法的例子包括采用N-琥珀酰亚胺-3-(2-吡啶二 硫基)丙酸盐(SPDP)或化合物如亚氨硫醇(iminothiolane)和巯基烷基pfe 亚胺盐(mercaptoalkylimidate，经常用于蛋白的巯基化)将巯基引入到所述 抗体的氨基上的方法；或将所述抗体固有的二巯基还原为巯基的方法。 从保持所述抗体的活性的角度来看，优选为采用固有巯基的方法。而且， 所述抗体可以用酶如胃蛋白酶处理以形成F(ab')2，然后用二硫苏糖醇 (DTT)等将其还原以形成F(ab')，该F(ab')可提供用于与脂质体结合的l 3个巯基。所述巯基化的抗体与含有马来酰亚氨基团的脂质体的结合可通 过使它们在pH为6.5 7.5的中性缓冲液中反应2 16小时来完成。
可以釆用任意传统方法来制备用于治疗癌症的本发明的药物，所述 方法如脱水法(JP02-502348A)、加入稳定剂以获得液体制剂的方法 (JP64-9331A)和冻干法(JP64-9931A)。本发明的用于治疗癌症的药物，可 以通过血管内施用以及腹膜内等局部给药法进行施用。可以对包封在脂 质体内的各药物的剂量进行优化。当所述药物为阿霉素时，阿霉素的剂 量可为50 mg/kg或更少，优选10 mg/kg或更少，更优选5 mg/kg或更少。
<5>本发明的诊断试剂
本发明的诊断试剂的例子包括利用本发明的抗体对癌细胞的特异性 的那些诊断试剂，尤其是含有本发明的抗体、二抗、检测底物和其它组 分的癌症诊断试剂。
实施例
在下文中，将参考实施例对本发明进行更详细地描述。但是，在不 脱离本发明范围内本发明并不限于这些实施例。
(1)通过将获自癌症患者的局部淋巴结癌的淋巴细胞和小鼠骨髓瘤 进行细胞融合来制备杂交瘤
(l)-l:淋巴细胞的制备
在用培养基B(加入10。/。胎牛血清(FCS)的培养基A(RPMI1640或 e-RDF + 50吗/ml硫酸庆大霉素))充满的板上，将从胃癌患者切除的局部
淋巴结癌中分离的淋巴细胞分散在金属网上。将细胞悬浮液在3,000 rpm 离心5分钟，获得约4.8xl(^个获得自局部淋巴结癌的淋巴细胞。
(1) -2:细胞融合
按照标准方法(癌症研究(CancerResearch),第45巻263页，1985)， 用聚乙二醇1500(Rodie Diagnostics)将所述获得自局部淋巴结癌的淋巴细 胞与小鼠骨髓瘤细胞(其数目约等于所述淋巴细胞的数目)融合。将所述融 合细胞悬浮在培养基B中，使得细胞密度变为5><105细胞/毫升。将所述 悬浮液分装到96孔板上，每孔100jal，并于37'C培养在C02培养箱中。 第二天，将添加有10 pM次黄嘌呤、0.04 pM氨基喋呤和1.6 jliM胸昔的 培养基B(添加有HAT的培养基B)加到所述各孔中，每孔100pl，培养到 杂交瘤集落出现为止。结果，在23个孔中出现杂交瘤集落。
(2) 人单克隆抗体与癌细胞系的反应性的评价 (2)-h癌细胞系及其保持
使用所获得的杂交瘤的培养物上清液，检测其与经固定的胃癌细胞 系MKNM(日本癌症和化学疗法杂志(Japanese Journal of Cancer and Chemotherapy)第5巻89页，1978;由IBL有限公司提供)的反应性，以 选择目的杂交瘤。于37"C在5XC02的条件下，将所述癌细胞系保持在 培养基D中并进行生长，所述培养基D是通过在培养基C(D-MEM/F12 + 50 pg/ml硫酸庆大霉素)中添加5%的FCS而制得的。
(2)-2:对癌细胞系的反应性的测定
在96孔板中，培养上述癌细胞系3天 4天，直到变成单细胞层。 去掉上清液后，用10mM磷酸盐缓冲液(pH7.4， 0.15 MNaCl)(PBS)洗板 一次，用2%多聚甲醛在室温固定细胞20分钟。经PBS洗涤5次后，将 所述板用含5XBSA(牛血清白蛋白)的PBS溶液封闭，每孔150 pl。然后， 用PBS洗板5次，并添加50 jil的杂交瘤培养物上清液，在37i:反应 1.5小时。接着，用PBS洗板5次，然后，加入50 pl的抗人抗体的辣根 过氧化物酶偶联的羊抗体(CAPPEL;稀释l，OOO倍)，在37'C反应1小时。 随后，用含0.05%吐温20的PBS(PBS-T)洗板，然后加入含有邻苯二胺 二盐酸盐(5.2%)和压02(过氧化氢，0.015%)的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液，
每孔50 ^d。反应在室温下进行，直到观察到显色，再用显微光度计(Nihon Intermed)在490nm测定吸光度。将获自检测有反应性的板孔的细胞通过 有限稀释而对杂交瘤细胞进行克隆,据此获得杂交瘤细胞系020630-18-1 。 在下文中，由该细胞系获得的单克隆抗体称为020630-18-1抗体。此外， 重复杂交瘤的克隆，据此得到杂交瘤细胞系020630-18-l-lF8-l。在下文 中，由该细胞系获得的单克隆抗体称为1F8抗体。
(3) 020630-18-1和1F8单克隆抗体的纯化和标记
(3)-1 : 杂交瘤020630-18-1和020630-18-1-1F8-1的培养和 020630-18-1和1F8单克隆抗体的纯化
首先，使胎牛血清通过蛋白A-玻璃珠柱(PROSEP-A)(bio PROCESSING)以制备从中去除了能结合到PROSEP-A的物质的血清。将 添加有4% 10%的这种血清的培养基A用于培养杂交瘤020630-18-1或 020630-18-l-lF8-l。接着，将其中已培养有所述杂交瘤020630-18-1或杂 交瘤020630-18-1-1F8-1的培养基装载到PROSEP-A上以由此吸附 PROSEP-A-吸附的多肽，然后将该多肽洗脱以纯化PROSEP-A吸附的多 肽。在随后的程序中，将所述PROSEP-A吸附的多肽用作020630-18-1 抗体或1F8抗体。据信在培养中使用上述血清，可以提供纯化的 020630-18-1抗体或纯化的1F8抗体，而没有能结合到PROSEP-A的物质 (包括来自血清的抗体)的污染。所述020630-18-1抗体和1F8抗体通过十 二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确认为纯的IgG(数据未 显示)。
(3) -2: 020630-18-1抗体或1F8抗体的生物素化 按照生产商的说明书，用生物素化试剂(Amersham Pharmacia Biotech)
对经PROSEP-A纯化的020630-18-1抗体或1F8抗体进行生物素化后， 通过凝胶过滤方法将标记抗体与游离的生物素分开。
(4) 与各种组织切片的反应性的分析 (4)-h各种组织切片的制备
在培养基D中于37'C在5°/。的C02条件下，分别培养各种癌细胞系 (肺癌细胞系HLC-l(癌症(Cancer))第67巻第4期，第483 492页，1976;
由庆应义塾大学医学系(the Medical Department of the Keio University)的 铃木博士提供)、A549、 PC-3和PC-9(均获得自IBLCo.,Ltd.);胰腺癌细 胞系SUIT2(由国立九州医院癌症中心(National Hospital Kyushu Cancer Center)的井口博士提供)、HPAC(ATCC No. CRL-2119)、PANC-1(ATCC No. CRL-1469)和PK8(获得自东北大学发育、衰老和癌症研究所生物医学研 究细胞资源中心(Cell Resource Center for Biomedical Research; the Institute of Development, Aging and Cancer of the Tohoku University));胃癌细胞系 MKN45、MKN74和HSC-3(全部来自IBL有限公司)；以及结肠癌细胞系.-HT29(ATCC No. HTB38)、 DLD-l(ATCC No. CCL221)、 LoVo(ATCC No. CCL229)和CoLo205(ATCCNo. CCL222)，并将约&106个 ^107个细胞 皮下移植到裸鼠(CLEA Japan, Inc.)中以形成肿瘤。通过以下方法制备各肿 瘤组织切片根据标准方法提取形成的肿瘤，用福尔马林溶液固定所述 肿瘤，并用石蜡包埋所述肿瘤。
(4) -2:与各种组织切片的反应性的检测
按照标准方法对制备的各种组织切片进行脱蜡和封闭处理后，将所 获得组织切片与实施例(3)-2中所述的生物素化的020630-18-1抗体反应， 通过DAKO催化的信号放大(CSA)系统(DAKO)进行检测，用二氨基联苯 胺染色，染成微红棕色即为检测到反应性。对于免疫染色的组织切片， 将该组织的细胞核用苏木精染成蓝色以获得组织图片。
所述020630-18-1抗体的各种癌症组织切片的染色图片在图1中显 示。发现020630-18-1抗体与每种肿瘤组织切片中的肿瘤细胞表现出强反 应性。具体而言，癌细胞核被强染色。另一方面，没有观察到对来自所 述裸鼠的组织切片中的非癌细胞的反应性。
此外，虽然未在图1中显示，但是使用下述抗体作为对照采用与上 述相同的过程进行染色，其中所述对照为以纯化020630-18-1抗体相同 的方式用PROSEP-A柱从人血清中纯化出的人抗体。所述对照抗体未对 每一种组织切片显示出特异反应性。
(5) 1F8抗体与活的癌细胞的表面的结合活性
用剃刀锋口精细地切割通过手术切除自肺癌患者的新鲜肺癌组织和
非癌肺组织的每个结节，将其悬浮在培养基D中，流过网格，由此制备
了来自于所述组织的活细胞。这些活细胞悬浮在人血清(含有0.05%叠氮 化钠)中，然后向所述细胞溶液加入在实施例(3)-2中描述的经生物素化的 1F8抗体使得所述抗体的浓度变为50 pg/ml，调节总体积为 100 )il(细胞 数105 106)。所述细胞悬浮液在冰冷却条件下反应60分钟。该细胞悬 浮液经过离心(2，000 rpm， 5分钟)并移除为含有所述抗体的溶液的上清 液。此后，加入20 nM QdotTM565链霉抗生物素蛋白标记的溶液(由 QuantmDot公司制造)(含有0.05。Z叠氮化钠)并在室温下反应30分钟。去 除所述溶液后，加入PBS(含有0.05X叠氮化钠)，并用共聚焦荧光显微镜 (CSUIO，由YokogawaElectric公司制造)观察细胞。1F8抗体与各活细胞 的表面的结合活性在图2中显示。所述1F8抗体表现出与来自于肺癌组 织的活细胞的表面的结合活性(图2-A)，但没有与来自非癌性肺组织的活 细胞的结合活性(图2-B)。用作对照的人抗体对所有细胞均未表现出结合 活性(数据没有显示在图2中)。
(6)对癌细胞系作用的分析
(6)-1:癌细胞系和血管内皮细胞及其保持
使用肺癌细胞系HLC-1、胃癌细胞系MKN45和胰腺癌细胞系 PANC-1作为人癌细胞系。在37'C于5Q/。的C02下，将这些癌细胞系保持 并生长在培养基D中。
(6)-2:对癌细胞系的抗增殖作用的分析
用含有10%人血清的培养基C分别稀释肺癌细胞系HLC-1、胃癌细 胞系MKN45和胰腺癌细胞系PANC-l,使得每孔中的细胞数目变为 1.5><103细胞/100 pl/孔，1F8抗体的浓度从100 pg/ml系列稀释。这些癌细 胞系在37'C在5%的C02下培养；隔天更换培养物上清液一次以使其为 上述相同的条件，总共更换3次；在第六天，通过MTT(噻唑蓝)测定法(免 疫方法杂志(J. Immunol. Methods),第70巻257页，1984)比较活的癌细 胞的数目。
结果在图3中显示。通过将未加抗体的对照条件下的细胞数目定义 为100%来显示抗增殖作用。通过加入1F8抗体在所有癌细胞系中观察到
浓度依赖性方式的抗增殖作用。具体而言，所述抗体显示出对所述肺癌
细胞系HLC-1的强抗增殖活性。而且，当使用人抗体作为对照时，通过 加入相同浓度的抗体，没有观察到对癌细胞系的抗增殖作用(未显示)。 (7)编码人单克隆抗体1F8的基因的获得及其核苷酸序列的测定 用RNeasy Protect Mini试剂盒(QIAGEN)从产生1F8抗体的杂交瘤中 制备总RNA。用ThermoScript RT-PCR系统(Invitrogen Corporation)和随 机的六聚物(hexamer)作为引物进行反转录反应以合成cDNA。
根据已知的抗体序列(分子生物学杂志(JMol Biol.)，第222巻581 597， 1991)，为了扩增重链可变区，将包括分别对应于人抗体重链可变区 的框架1中保守的N末端氨基酸序列(SEQ ID NO: 2、 4、 6、 8、 10和 12)的VHl(SEQIDNO: 1)、 VH2(SEQ ID NO: 3)、 VH3(SEQ IDNO: 5)、 VH4(SEQIDNO: 7)、 VH5(SEQ ID NO: 9)和VH6(SEQ ID NO: ll)的 PCR引物(5'端引物)的等量混合物，以及将包括分别对应于人抗体重链可 变区的框架4中保守的C末端氨基酸序列(SEQ ID NO: 14、 16、 18和 20)的JHl(SEQIDNO: 13)、 JH2(SEQ ID NO: 15)、 JH3(SEQ ID NO: 17) 和JH4(SEQ ID NO: 19)的PCR引物(3'端引物)的等量混合物用作PCR扩 增的引物。
将包括分别对应于人抗体k链可变区的框架1中保守的N末端氨基 酸序列(SEQIDNO: 22、 24、 26、 28、 30和32)的VKl(SEQIDNO: 21)、 VK2(SEQIDNO: 23)、 VK3(SEQIDNO: 25)、 VK4(SEQ IDNO: 27)、 VK5(SEQIDNO: 29)和VK6(SEQ ID NO: 31)的PCR引物(5'端引物)的 等量混合物，以及将包括分别对应于人抗体k链可变区的框架4中保守 的C末端氨基酸序列(SEQIDNO: 34、 36、 38、 40和42)的JK1(SEQ ID NO: 33)、 JK2(SEQIDNO: 35)、 JK3(SEQ ID NO.. 37)、 JK4(SEQIDNO: 39)和JK5(SEQ ID NO: 41)的PCR引物(3'端引物)的等量混合物用作扩增
k链可变区的引物。
将包括分别对应于人抗体^链可变区的框架1中保守的N末端氨基 酸序列(SEQIDNO: 44、 46、 48、 50、 52、 54和56)的VL1(SEQ ID NO: 43)、 VL2(SEQIDNO: 45)、 VL3(SEQIDNO: 47)、 VL4(SEQ ID NO:
49)、 VL5(SEQIDN0: 51)、 VL6(SEQIDNO: 53)和VL7(SEQIDNO:
55)的PCR引物(5'端引物)的等量混合物，以及将包括分别对应于人抗体X 链可变区的框架4中保守的C末端氨基酸序列(SEQ ID NO: 58、 60和 62)的JLl(SEQIDNO: 57)、 JL2(SEQIDNO: 59)和JL3(SEQ IDNO: 61) 的PCR引物(3'端引物)的等量混合物用作扩增X链可变区的引物。
按照制造商的说明书，用Perkin Elmer Gene Amp PCR系统2400和 ThermoScript RT-PCR系统(Invitrogen公司)进行PCR。结果，用U连引物 进行PCR扩增，轻链得到扩增；但是，用K链引物进行PCR扩增，轻链 没有得到扩增。因此，这就揭示了杂交瘤所产生的抗体的轻链是X链。
用Min正lute PCR纯化试剂盒(QIAGEN)对扩增的编码重链或轻链可 变区的各DNA片段进行纯化。接着，用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen 公司)将经纯化的PCR产物连接到pCR2.1-TOPO，并进行大肠杆菌的转 化。挑取出现的菌落，用QIAGENPlasmidmini试剂盒(QIAGEN)纯化质 粒，然后，用EcoRI在37'C酶切消化30分钟，并进行2%的琼脂糖电泳， 以鉴定目的DNA片段的插入情况。
用M13引物通过CEQ 2000 DNA分析系统(Beckman)分析数个菌落 中的DNA插入片段的核苷酸序列。结果，从重链的分析中鉴定出包括 F8-H-A(SEQIDNO: 63)、 1F8-H-B(SEQ ID NO: 65)和1F8-H-C(SEQ ID NO: 67)在内的3条序列。从人链的分析中鉴定出1F8-L(SEQIDNO: 69) 的序列。通过比较这些核苷酸序列和相应的氨基酸序列(重链SEQ ID NO: 64、 66和68; X链SEQ ID NO: 70)，确定了每条重链和轻链的 可变区的核苷酸序列(重链SEQ ID NO: 71;轻链SEQ ID NO: 69)和 氨基酸序列(重链SEQ ID NO: 72;轻链SEQ ID NO: 70)。
参考Kabat等人的文献(免疫学感兴趣的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest),第五版，国家健康研究所，Bethesda， MD， 1991)，确定了高变区(CDR)和框架之间的边界。结果，重链高变区 被确定为HCDRl(核苷酸序列SEQ ED NO: 73;氨基酸序列SEQ ID NO: 74)、 HCDR2(核苷酸序列SEQ ID NO: 75;氨基酸序列SEQ ID NO: 76)和HCDR3(核苷酸序列SEQ ID NO: 77;氨基酸序列SEQ ID NO:
78)。轻链高变区被确定为LCDR1(核苷酸序列SEQ ID NO: 79;氨基 酸序列SEQIDNO: 80)、 LCDR2(核苷酸序列SEQ ID NO: 81;氨基酸 序列SEQ ID NO: 82)和LCDR3(核苷酸序列SEQ ID NO: 83;氨基酸 序列SEQ ID NO: 84)。
(8) Y-1F8(重组1F8抗体)的制备
(8-1) cDNA的制备和1F8可变区片段的获得
按照生产商说明书，使用Perkin Elmer Gene Amp PCR系统2400和 ThermoScript RT-PCR系统，高保真(High Fidelity)(Invitrogen),由总 RNA(在实施例(7)中描述)进行cDNA的制备和PCR反应。以在试剂盒中 提供的随机六聚体作为引物来制备重链的cDNA。
为了扩增重链和X链的可变区，使用带有用于连接到表达质粒中的 限制性酶切位点的引物。为了扩增重链可变区，使用在5'末端含有AflII 位点的Pl(SEQ ID NO: 89)和在3'末端含有Nhel位点的P2(SEQ ID NO: 卯)。为了扩增X链可变区，使用在5'末端含有BsrGI位点的P3(SEQ ID NO: 91、 92、 93、 94、 95、 96和97的等量混合物)和在3'末端含AvrII 位点的P4(SEQ ID NO: 98、 99和100的等量混合物)。
用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)对所扩增的各重链和人链的 可变区的DNA片段进行纯化。接着，为了将所述DNA片段连接到表达 载体中，用限制性酶对所述DNA片段进行酶切消化。使用AflII和Nhel， 在37"酶切消化重链的DNA片段2小时。使用BsrGI和AvrII，在37°C 酶切消化X链的DNA片段2小时。使用QIAquick凝胶提取试剂盒 (QIAGEN)对酶切消化的DNA片段进行1.5%琼脂糖电泳以纯化目的 DNA片段。
(8-2)表达质粒的酶切消化和质粒片段的获得
为了表达1F8的人IgGl-型重组抗体，将含有重链恒定区序列和dhfr 基因序列的pEX-Gl-sig-dhfr"用作表达重链的质粒，将含有X链恒定区序 列的pEX-Lsig用作表达X链的质粒。在37°C，用AflII和Spel对 pEX-Gl-sig-dhfr"酶切消化2小时。用BsrGI和AvrII对pEX-X-sig酶切消 化2小时。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)，将酶切消化的片
段进行0.8%琼脂糖电泳，以纯化目的片段。
(8-3)将1F8可变区连接到表达质粒中
按照生产商说明书，使用连接试剂盒Ver. 2.1(TAKARA),将通过上 述方法获得的含1F8的重链可变区的DNA片段连接到经切割的表达质粒 pEX-Gl-sig-dhfr"中，并按照生产商说明书，用获得的质粒转化大肠杆菌 DH5a-Tl(Invitrogen公司)。挑取出现的菌落并用QIAprep Spin Miniprep 试剂盒(QIAGEN)纯化所述质粒。在37"C，用HindIII和Ndel对含有重 链核苷酸序列的质粒进行1.5小时的酶切消化，并进行1%琼脂糖电泳， 据此获得所需质粒pEX-lF8-H。使用5'末端的P5(SEQIDNO: IOI)和3' 末端的P6(SEQIDNO: 102)确认所获得的质粒的核苷酸序列。1F8重组 抗体的重链结构基因的核苷酸序列在SEQIDNO: 103中显示。
另一方面，按照生产商说明书，使用连接试剂盒Ver.2.1(TAKARA)， 将含1F8的入链可变区的DNA片段连接到经切割的表达质粒pKS-"ig 中，并用获得的质粒转化大肠杆菌DH5a-Tl(Invitrogen)。挑取出现的菌 落，并用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN)纯化所述质粒。在37°C ， 用BsrGI和AwII对含有所述人链核苷酸序列的质粒进行2小时的酶切消 化，并进行1。Z琼脂糖电泳，据此获得所需的质粒pEX-lF8-L。使用5' 末端的引物P5对所获得的质粒的核苷酸序列进行确认。1F8重组抗体的 X链结构基因的核苷酸序列在SEQIDNO: 105中显示。
(8-3)将1F8重链连接到含有1F8的X链的质粒中
为了将1F8的重链和X链连接到一个质粒上，用限制性酶对上述获 得的质粒进行酶切消化。用Nhel在37"C对pEX-lF8-H进行1.5小时的 酶切消化；用Nhel和Spel在37。C对pEX-lF8-L进行1.5小时的酶切消 化。用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化所得到的片段。按照生 产商说明书，用连接试剂盒Ver. 2.1(TAKARA)将所述片段相互连接，并 用得到的质粒转化大肠杆菌DH5a-Tl(Invitrogen)。挑取出现的菌落，并 用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN)纯化所述质粒。在37。C，用 Nhel对所获得的质粒进行1小时的酶切消化，并进行1.5%琼脂糖电泳， 据此选择具有所需大小的质粒。此外，在37'C，用Hindin对其进行1小 时的酶切消化并进行1%琼脂糖电泳进行核查，据此获得所需的质粒
pEX-lF8-HL。
(8-4)产生Y-1F8的重组体的制备
以可培养在无血清培养基中的CHO(DG325)细胞系作为用于制备产 生Y-1F8的重组体的细胞系。在CHO-S-SFMII(GIBCO)中将CHO(DG325) 稀释为lxl()S个细胞/毫升。其后，按照生产商说明书，将2吗的质粒 pEX-lF8-HL DNA与6 ^il的FuGENE 6(Roche)进行混合以转染 CHO(DG325)。转染后5.5小时，加入EX-CELL325-PF(Nichirei)。经过 2天的培养，向培养基中加入400 jig/ml的G418(Promega)和0或25 nM 的氨甲喋呤(Sigma)作为选择试剂并进行培养，随后进行克隆，据此获得 产生丫-lF8的细胞系。
(8-5)采用ELISA测定法进行产生抗体的细胞系的筛选
通过夹心ELISA测定法进行产生抗体的细胞的筛选。首先，用PBS 将羊抗人免疫球蛋白抗体(CAPPEL)稀释到50 |Lig/ml，并放入96孔板 (FALCON)中，每孔50pl，在37X:温育2小时。板经PBS洗涤5次后， 加入含有5。/。牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液，每孔150 ^，并进行封闭。 经PBS洗涤5次后，往板中加入50 ^的所述重组体的培养物上清液，在 37'C反应2小时。然后，经PBS洗涤5次后，向板中加入50(al的抗人抗 体的辣根过氧化物酶(HRP)偶联的羊抗体(1,000倍稀释，CAPPEL)，以在 37。C反应1小时。然后，用含有0.05%吐温20的PBS(PBS-T)洗板，然 后加入含有邻苯二胺二盐酸盐(5.2%)和&02(0.015%)的磷酸盐-柠檬酸盐 缓冲液，每孔50W。在室温下进行反应直至观察到显色，之后，通过加 入1NH2S04，每孔50pl，来终止反应。使用显微光度计(Nihonlntermed) 在490 nm进行吸光度测量，选择具有最大产量的细胞系。
(8-6) 1F8的纯化
将以上所获得的产生Y-lF8的细胞系培养在含有4y。用PROSEP-A处 理过并添加有G418(Promega)的血清的培养基A中，由此获得含有，1F8 的培养基。接着，将该培养基装载到PROSEP-A上以使"lF8吸附在其 上。然后洗脱吸附的y-lF8，据此对y-lF8进行纯化。通过SDS-PAGE，
确认，1F8为纯的IgG(未显示)。
C8-7) Y-1F8与癌细胞系的结合活性的确认
在项(8-6)中所描述的纯化Y-1F8与如同在项(2-2)中所描述的相同方 法固定的HLC-1细胞的结合活性得以确认。具有各自浓度的抗体与所述 固定的癌细胞系在37。C反应1小时。用PBS洗涤所述板，将抗人抗体的 HRP-偶联的羊抗体(稀释1,000倍，CAPPEL)加到板上，以在37。C反应 1小时。检测y-lF8的反应性，结果确认，？1F8表现出浓度依赖性方式 的与HLC-1细胞的结合活性(图4)。
工业应用性
通过使用在本发明中获得的单克隆抗体，可以提供选择性攻击癌组 织的抗癌药物，所述癌组织尤其是非小细胞肺癌、胰腺癌或胃癌。而且， 当使用本发明的人单克隆抗体时，可以提供副作用低的能连续给药的抗 癌药物。
权利要求
1. 一种单克隆抗体，其中所述单克隆抗体的重链可变区包含SEQIDNO74、76和78所示的氨基酸序列。
2. 如权利要求1所述的单克隆抗体，其中所述重链可变区包含 SEQ ID NO: 72所示的氨基酸序列。
3. 如权利要求1所述的单克隆抗体，其中所述重链可变区包含 SEQ ID NO: 104所示的氨基酸序列。
4. 一种单克隆抗体，其中所述单克隆抗体的轻链可变区包含SEQ ID NO: 80、 82和84所示的氨基酸序列。
5. 如权利要求4所述的单克隆抗体，其中所述轻链可变区包含 SEQ ID NO: 70所示的氨基酸序列。
6. 如权利要求4所述的单克隆抗体，其中所述轻链可变区包含 SEQ ID NO: 106所示的氨基酸序列。
7. —种单克隆抗体，其中所述单克隆抗体的重链可变区包含SEQ ID NO: 74、 76和78所示的氨基酸序列，且所述单克隆抗体的轻链可变 区包含SEQ ID NO: 80、 82和84所示的氨基酸序列。
8. 如权利要求7所述的单克隆抗体，其中所述重链可变区包含 SEQ ID NO: 72所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区包含SEQ ID NO: 70所示的氨基酸序列。
9. 如权利要求7所述的单克隆抗体，其中所述重链可变区包含 SEQ ID NO: 104所示的氨基酸序列，且所述轻链可变区包含SEQ ID NO: 106所示的氨基酸序列。
10. 如权利要求1 9中任一项所述的单克隆抗体，其中所述单克 隆抗体是人抗体。
11. 一种DNA，该DNA编码权利要求1 10中任一项所述的单克隆抗体。
12. 如权利要求11所述的DNA，其中编码所述重链可变区的区域 包含SEQ ID NO: 73、 75和77所示的核苷酸序列，且编码所述轻链可变区的区域包含SEQ ID NO: 79、 81和83所示的核苷酸序列。
13. 如权利要求11或12所述的DNA，其中编码所述重链可变区的 区域包含SEQ ID NO: 71所示的核苷酸序列，且编码所述轻链可变区的 区域包含SEQ ID NO: 69所示的核苷酸序列。
14. 如权利要求11或12所述的DNA，其中编码所述重链可变区的 区域包含SEQ ID NO: 103所示的核苷酸序列，且编码所述轻链可变区的 区域包含SEQ ID NO: 105所示的核苷酸序列。
15. —种重组载体，该重组载体包含权利要求11 14中任一项所 述的DNA。
16. —种转化体，该转化体包含权利要求15所述的重组载体。
17. —种杂交瘤，该杂交瘤产生权利要求1 10中任一项所述的单 克隆抗体。
18. —种药物组合物，该药物组合物包含权利要求1 10中任一项 所述的单克隆抗体。
19. 如权利要求18所述的药物组合物，该药物组合物是用于癌症 治疗的组合物。
20. 如权利要求19所述的药物组合物，其中所述用于癌症治疗的 组合物是用于治疗选自由非小细胞肺癌、胰腺癌和胃癌组成的组中的一 种或两种或两种以上的癌症的组合物。
21. 如权利要求18 20中任一项所述的药物组合物，其中所述单克隆抗体被锚定到其中包封有毒素或抗癌药物的脂质体的表面。
22. —种诊断试剂，该诊断试剂包含权利要求1 10中任一项所述 的单克隆抗体。
全文摘要
本发明公开了一种单克隆抗体，该单克隆抗体的重链可变区包含SEQ ID NO74、76和78所示的氨基酸序列且轻链可变区包含SEQ IDNO80、82和84所示的氨基酸序列。所述单克隆抗体可用作癌症治疗剂，其选择性地作用于非小细胞肺癌、胰腺癌或胃癌等的癌症组织。
文档编号C12N1/21GK101389756SQ20078000641
公开日2009年3月18日 申请日期2007年2月23日 优先权日2006年2月23日
发明者中村理惠子, 平川容子, 才川义朗, 熊井浩一郎, 福田和正, 细川齐子, 青木真彦 申请人:田边三菱制药株式会社;学校法人庆应义塾