专利名称：：新型二肽分解酶及其制造方法、使用该二肽分解酶对糖化蛋白质等进行测定的方法、以及...的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种作用于二肽的新酶，具体而言，本发明涉及作用于二肽使之分解为氨基酸的二肽分解酶；其制造方法；利用糖化二肽的分解生成糖化氨基酸和氨基酸的方法；糖化蛋白质、糖化肽、糖化二肽的测定方法以及该测定用的试剂组合物。
背景技术：
：近年来，糖尿病患者人数在爆发性地增加，并且在实行糖尿病的诊断、管理的基础上，领U定糖化血红蛋白(GHb)、糖化白蛋白、果糖胺、1,5-脱水山梨醇等血糖控制标记物是非常重要的，因此对于这些血糖控制标记物的测定需求正在增加。特别是血液中的糖化血红蛋白的浓度反映过去约12个月的平均血糖值是众所周知的，并且如果将该血液中浓度维持为7%以下，并发症的发病以及糖尿病进展的危险率就会明显变低，这一点已被近年来的研究所证明，所以所述血液中的糖化血红蛋白的浓度正在成为临床现场必需的指标。已明确糖化血红蛋白是利用美拉德反应(Maillardreaction)将血红蛋白糖化而成的Amadori化合物，并且是血红蛋白多肽的a链和|3链的N末端的缬氨酸或分子内的赖氨酸在s位被糖化的产物。在糖化血红蛋白中，血红蛋白J3链N末端的缬氨酸被糖化后的产物特别是被称为血红蛋白Alc(HbAlc)的稳定的Amadori化合物，因此被用来测定糖化血红蛋白。另外，在HbAlc中不含有在Amadori重排前的希夫碱(ShiffBase)即不稳定型血红蛋白。Amadori化合物是具有由肽或者蛋白质等具有氨基酸基的化合物和葡萄糖等具有醛基的化合物反应而生成的以(一(CO)—CHR—NH—(R表示氢原子或者是羟基))来表示的酮胺结构的化合物。糖化血红蛋白的测定方法，可以例举以往的利用离子交换色谱、亲和层析等色谱的方法，使用电泳的方法，免疫法，利用碱性条件下糖化蛋白质的还原性的方法，使用硫代巴比妥酸(Thiobarbituricacid)的方法，酶法等。利用高效液相色谱的方法、利用亲和层析的方法以及使用电泳的方法必需昂贵的专用装置，而且检测时间长，因此不适合处理多个待测物的临床检查。免疫法由于分析方法比较简单，而且测定能在短时间内完成，因此近年来得到飞速发展，但是在精度方面存在问题。另外，利用还原性的方法以及使用硫代巴比妥酸的方法受到样品中的共存物质的影响，在特异性方面存在问题。与这些方法相比较，酶法在不需要专用装置、测定时间短、精度高、简便、便宜等方面具有优势。酶法已知有一种使用作用于糖化氨基酸的酶，果糖基氨基酸氧化斷fructosylaminoacidoxidase,以下有时会简称为FAO)的糖化氨基酸的测定方法(参考专利文献1专利文献10)。虽然FAO对于糖化氨基酸的作用很强，但是对糖化蛋白质、糖化肽以及糖化二肽没有作用(参考非专利文献1)，所以FAO不能单独测定来自糖化蛋白质、糖化肽以及糖化二肽的糖化氨基酸。因此，有必要在使FAO作用之前，用化学的方法或者酶法使糖化蛋白质和糖化肽成为糖化氮基酸碎片使其游离。在测定糖化血红蛋白时，具体地说，第一阶段是利用各种蛋白酶将糖化血红蛋白碎片化，使糖化肽、糖化氨基酸和氨基酸游离(利用蛋白酶的分解反应)；第二阶段是使FAO作用，利用过氧化物酶显色体系测定生成的过氧化氢(利用FAO的显色反应)。利用蛋白酶的分解反应糖化血红蛋白—糖化肽—糖化二肽—糖化氨基酸+氨基酸利用FAO的显色反应糖化氨基酸—葡糖醛酮(glucosone)+Val+H202专利文献1日本专利公开公报特公平5-33997号专利文献2日本专利公开公报特公平6-65300号专利文献3日本专利公开公报特开平2-195900号专利文献4日本专利公开公报特开平3-155780号专利文献5日本专利公开公报特开平5-192193号专利文献6日本专利公开公报特开平6-46846号专利文献7日本专利公开公报特开平7-289253号专利文献8日本专利公幵公报特开平8-154672号专利文献9日本专利公开公报特开平8-336386号专利文献10日本专利公开公报特开2005-110657号非专利文献1BiotechnologyLetters27:963(2005)
发明内容但是，众所周知对于蛋白酶类肽链越短作用越难，作用于糖化血红蛋白P链二肽的糖化-Val-His(Fru-Val-His、糖化缬氨酸组氨酸)或糖化-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu(Fru-VHLTPE)等，不能分解成为糖化氨基酸，或即使能够分解，生成量也是非常的微量，因此需要使大量的蛋白酶很长时间地反应(参考非专利文献1)。即，蛋白酶虽然能够作用于糖化血红蛋白生成糖化肽和糖化二肽等，但是难以分解为作为FAO的底物的糖化氨基酸的糖化-Val，所以组合蛋白酶和FAO的上述方法在灵敏度方面有缺点。本发明考虑到上述的情况，提供一种作用于二肽使之分解为氨基酸的二肽分解酶，并且提供一种通过使该酶作用于糖化二肽生成糖化氨基酸和氨基酸，可以迅速、简便而且正确地测定用于定量该氮基酸的糖化蛋白质、糖化肽或者糖化二肽的新测定方法。另外，在糖化血红蛋白上使蛋白酶和FAO作用的酶法中，以提高利用二肽分解酶的糖化血红蛋白的测定灵敏度为目的。为了解决上述问题，本发明人等为了探求能够分解糖化-Val-His成为糖化-Val和组氨酸的二肽分解酶，不仅将自然界的各种微生物作为对象，而且也将市场上销售的酶剂里含有的酶作为对象进行了筛选，结果找到了能产生二肽分解酶的菌，从而完成本发明。艮口，本发明涉及一种二肽分解酶，其特征在于，作用于二肽生成氨基酸。在本发明中，在二肽为糖化二肽的情况下，生成糖化氮基酸和氮基酸。另外，在糖化二肽为糖化血红蛋白P链二肽的糖化-Val-His的情况下，生成糖化-Val和组氨酸。在这里，所谓糖化二肽，是指是被糖化的二肽。所谓糖化氨基酸，是指被糖化的氨基酸。另外，糖化-Val-His是指糖化缬氨酸组氨酸(也称为"Fru-Val-HIS")。糖化-Val指是糖化缬氨酸(也称为"Fru-Val")。本发明主要为具有以下的理化性质的二肽分解酶。(1)作用以及底物作用于二肽使之分解为氨基酸。作用于糖化二肽，生成糖化氨基酸和氨基酸。(2)最适pH值6.2，在pH值6.07.0的范围内具有在pH值6.2处活性的80%以上的活性。(3)pH稳定性pH5.0以上稳定。(4)最适温度45°C，在3545r的范围内具有足够的反应性。(5)热稳定性50'C以下稳定。(6)分子量约45kDa(SDS-PAGE)(7)激活剂以及抑制剂利用Mg^、C,或Z,离子可以进行激活，利用EDTA或a，a'-联吡啶(dipyridyl)可抑制活性。本发明涉及一种由智利鞘脂单胞菌(SphingopyxischilensisNO.0522、NITEBP-250)或者该菌株的变异株产生的二肽分解酶。本发明涉及一种具有以序列表的序列号2所示的氮基酸序列的蛋白质。本发明涉及一种编码具有序列表的序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质的基因。另外，本发明涉及一种具有序列表的序列号1所示的碱基序列的DNA。本发明涉及一种二肽分解酶的制造方法，其特征在于，培养鞘脂单胞菌属(Sphingopyxis)的微生物，生成所述二肽分解酶，并且收集该二肽分解酶。本发明涉及一种使用上述二肽分解酶或上述蛋白质作用于含有糖化二肽的待测物，生成糖化氨基酸和氨基酸的方法。另外，本发明涉及一种使用蛋白酶和上述二肽分解酶或上述蛋白质作用于含有糖化蛋白质或糖化二肽的待测物，生成糖化氨基酸和氨基酸的方法。本发明涉及一种对利用上述生成方法生成的氨基酸添加分解该氨基酸的物质进行分解和定量的糖化蛋白质、糖化多肽或者是糖化二肽的测定方法。另外，本发明涉及一种使用氧化酶定量利用上述生成方法生成的糖化氨基酸来测定糖化蛋白质、糖化多肽或者是糖化二肽的测定方法。本发明涉及一种为了实施上述测定方法而使用的试剂组合物。本发明的二肽分解酶能够在短时间内简便而且精度良好地测定糖化血红蛋白等糖化蛋白质、糖化多肽或者糖化二肽，因此对糖尿病症状的诊断或症状管理有益处。另外，本发明的二肽分解酶在使蛋白酶和FAO作用于糖化血红蛋白的酶法的方面，能够提高糖化血红蛋白的测定灵敏度，因此对以往利用酶法的糖尿病症状的诊断或症状管理有益处。图1是表示二肽分解酶的最佳pH的图。图2是表示二肽分解酶的pH稳定性的图。图3是表示二肽分解酶的最佳温度的图。图4是表示二肽分解酶的热稳定性的图。图5是表示二肽分解酶的SDS-PAGE电泳图谱的图。图6是智利鞘脂单胞菌NO.0522的染色体DNA上二肽分解酶基因周边的限制酶图。图7是表示糖化二肽(Fru-Val-His)的测定结果的图。图8是Fru-Val-His和Fru-Val-Leu的反应曲线。具体实施例方式本发明的二肽分解酶将作用于二肽生成氨基酸的反应催化。另外，在二肽是糖化二肽的情况下，将分解糖化二肽生成糖化氨基酸和氨基酸的反应催化。这种酶的底物特异性是现有的蛋白酶内没有的特性。因此，二肽分解酶可以用于糖化蛋白质或者糖化肽的新测定方法，即，在蛋白酶作用于糖化蛋白质或者糖化肽并使其成为碎片的肽中，对作用于糖化二肽而生成的氨基酸进行定量。另外，由于对不能成为FAO的测定对象的糖化二肽发生作用，提供FAO的底物，所以可以提高利用FAO的酶法的测定灵敏度。因此，二肽分解酶是适合通过组合蛋白酶和氨基酸氧化酶等，或者组合蛋白酶和FAO，来测定糖化血红蛋白的有用性高的酶。以下对二肽为糖化二肽的情况进行说明。另外，二肽分解酶作用的二肽为糖化二肽的情况下，二肽分解酶也可以被特别称为糖化二肽分解酶。二肽分解酶的供给源可以从自然界广泛求得，但是作为一个例子，可以考虑微生物，优选来自鞘脂单胞菌属(Sphingopyxis)的酶蛋白质，更优选来自智利鞘脂单胞菌N0.0522的酶蛋白质。智利鞘脂单胞菌NO.0522是本发明人等从土壤中分离的新微生物，根据《有关专利程序的微生物保藏的国际承认之布达佩斯条约》，在下述国际保藏局(国际保藏机关)内进行了国际保藏，可以容易获得。国际保藏机构独立行政法人产品评价技术研究所专利微生物保藏中心(NPMD)住址〒292-0818日本千叶县木更津市上综镰足2-5-8，http:〃www.nbrc.nite.go.jp/npmd/保藏日2006年7月19曰保藏编号NITEBP-250二肽分解酶的制造方法为首先培养具有二肽分解酶生产能力的微生物(培养步骤)。例如，微生物可以使用上述智利鞘脂单胞菌N0.0522。只要能够生产目标酶，培养方法以及培养条件没有特别的限定。即，将生产该酶作为条件，可以适当设定适用于使用的微生物培养的方法或培养条件。以下举例说明培养条件。只要能够培育微生物，任何培养基都可以。只要适当含有碳源、氮源、无机物以及其它养分即可，不论合成培养基或天然培养基都可以使用。作为碳源的例子，可以使用葡萄糖、果糖、木糖和甘油等。作为氮源的例子，可以适当使用蛋白胨、酪蛋白消化物或者酵母提取物等含氮有机物。作为无机物的例子，可以使用钠、钾、钙、锰、镁、铁、钴和锌等的盐类。为了促进微生物的生长，可以往培养基内加入维他命、氨基酸等。培养基的pH，例如调整为约3-8，优选约6.5-7.0的范围，培养温度通常为10-50°C，优选为约28-3(TC范围，时间为20-48小时，优选为32-40小时范围，好氧条件下进行培养。培养方法可以利用振荡培养法、利用发酵罐(jarfermenter)的好氧深度培养法、厌氧的培养法或者固体培养法。培养步骤后，从培养的菌体中回收二肽分解酶(回收步骤)。由于二肽分解酶积累在菌体内，所以酶的回收可以通过自溶、冷冻、超声波粉粹、加压等破碎菌体，并且组合利用硫酸铵等的盐析，利用乙醇等有机溶剂的沉淀，或离子交换色谱、疏水层析、凝胶过滤色谱、亲和层析等各种色谱等一般方法来进行。更具体地来说，将培养后的培养液离心分离，并且收集菌体，将其洗净后，在0.1M的3-(N-吗啡啉)丙磺酸(3-Morpholinopr叩anesulfonicacid，MOPS)的缓冲溶液(pH7.0)里悬浊，再利用超声波破碎菌体。接着，可以通过硫酸铵盐析、阴离子交换树脂色谱、凝胶过滤色谱来处理将该菌体的破碎液离心分离得到的上清液(无细胞的提取液)，而获得二肽分解酶的纯化酶蛋白质。使用纯化的二肽分解酶，该酶的氨基酸序列以及基因序列可以用公知的方法测定，还可以制备编码该二肽分解酶的基因。可以使用基因工程技术和细胞培养技术等公知技术，例如，处理质粒、DNA、各种酶、大肠菌、培养细胞等的技术，可以依据CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.Ausubel等编、(1994)，JohnWiley&Sons,Inc.以及CultureofAnimalCells;AManualofBasicTechnique,R.Freshney编，第2版(1987)，Wiley-Liss内记载的方法来进行。例如，依据埃德曼(Edman)分解等常规方法，确定氨基酸末端侧的氨基酸序列，再以肽链内切酶(Lysylendopeptidase)等蛋白酶消化纯化酶后，可以使用HPLC分离的二肽片断来确定蛋白质内部的氨基酸序列。以按照这样的方式确定的氨基酸序列为依据来制作合成DNA，如果以此作为引物或探针来克隆编码二肽分解酶的基因，即可获得目的基因。在本发明中，二肽分解酶的氨基酸序列只要是具有该酶活性的序列即可，不仅包括上述方式所确定的氨基酸序列，也包括该氨基酸序列的一个或者多个氨基酸残基经过缺失、取代或添加而得到的氨基酸序列。在本发明中，编码二肽分解酶的基因如果为编码具有该酶活性的蛋白质的DNA即可，不仅包括以上述方式确定的基因，也包括该基因的一个或者多个碱基经过缺失、取代或添加而得到的、编码具有该酶活性的蛋白质的基因。另外，包括由具有所定的碱基序列的DNA组成的基因，该基因的一个或者多个碱基经过缺失、取代或添加的、编码具有该酶活性的蛋白质的基因，以及由该基因的DNA与在严格条件下杂交并且编码具有该酶活性的蛋白质的DNA组成的基因。这里所谓的严格条件是指以下条件(a)以DIGEASYHyb(RocheDiagnostics株式会社制造)内在24。C下杂交16个小时；(b)以含有0.1。/。SDS的2xSSC在室温下清洗5分钟，重复2次；(c)再使用含有0.1%SDS的O.lxSSC在68。C下清洗5分钟。使用DNA序列仪确定由克隆得到的用于编码二肽分解酶的基因的全碱基序列，以该基因信息为依据可以推定二肽分解酶的氨基酸的一级序列。此外，确定的氨基酸序列的一个或者多个氨基酸残基经过缺失、取代或者添加的编码具有二肽分解酶活性的氨基酸序列的基因的获得方法可以使用各种各样的公知方法。例如，可以利用使基因点产生变异或者缺失变异部位的特定变异诱导法，或者选择性地断开基因，缺失、取代或者添加选择的核苷酸后，再重新连接基因的寡核苷酸变异诱导法等公知的方法。用插入了含以上述方式得到的编码二肽分解酶的基因的DNA片断的重组载体，来转化或转导微生物，通过上述方式获得具有二肽分解酶生产能力的转化体或转导体，这些可以用来生产二肽分解酶。转化或者转导的宿主，没有特别限定，例如可以使用大肠杆菌、属于埃希氏菌属(Escherichia)的菌株或者属于假单胞菌属(Pseudomonas)的菌株。转化体等的培养可以适当使用液体培养法。作为培养转化体等的培养基，只要适当含有碳源、氮源、无机物以及其它的营养，就没有任何限定，可以使用合成培养基、天然培养基中任何一种的培养基。作为碳源的例子，可以使用葡萄糖、果糖、木糖和甘油等；作为氮源，可以使用蛋白胨、酪蛋白消化物或者酵母提取物等含氮有机物。作为无机物，可以使用钠、钾、钙、锰、镁、铁、钴等的盐类。如果是转化体等进行生长，并且生产二肽分解酶的条件，任何一种条件都可以进行培养，可以设定为培养基pH7.09.0，培养温度通常为2542'C、最佳为3037"C范围，培养时间为848小时、最佳为1630小时范围。可以利用适当组合公知的技术，从培养后的转化体回收并纯化二肽分解酶。例如，培养转化体等后，利用过滤或者离心分离等操作从培养液中回收菌体，并破碎该菌体。菌体的破碎可以使用机械的方式或利用溶剂的自溶、冷冻，超声波粉粹、加压、使用溶菌酶等细胞溶解酶溶解菌体细胞壁的方法、使用曲拉通X-100(TritonX-100)等表面活性剂等的方法。可以通过适当组合硫酸铵盐析、利用乙醇等有机溶剂的沉淀、离子交换色谱、疏水层析、凝胶过滤色谱、亲和层析等各种色谱、电泳等，从该菌体破碎物中纯化二肽分解酶。二肽分解酶可以用于糖化蛋白质、糖化肽或者糖化二肽的测定。成为测定对象的待测物只要是糖化蛋白质、糖化肽或者糖化二肽，任何一种均可，但是优选血液成分，例如可列举全血、血细胞、红细胞、溶血溶液、血清、血浆或尿等。糖化蛋白质、糖化肽或者糖化二肽的测定方法由以下的试剂构成。试剂A:含具有将糖化蛋白质或糖化肽分解为糖化二肽的蛋白酶活性的试剂。由于二肽分解酶仅对二肽起作用，所以如果测定对象是糖化蛋白质或糖化肽，就会将测定对象分解为糖化二肽。可以使用蛋白酶来分解测定对象。蛋白酶可以使用从蛋白质的多肽链的内侧开始分解的内肽酶和从蛋白质的多肽链的外侧开始分解的外肽酶中的任何一种，前者可以列举胰蛋白酶(Trypsin)、a-糜蛋白酶((x-chymotrypsin)、枯草杆菌蛋白酶(Subtilisin)、蛋白酶K、木瓜蛋白酶(Papain)、组织蛋白酶B(Cathepsin)、胃蛋白酶(Pepsin)、嗜热菌蛋白酶(Thermolysin)、蛋白酶、蛋白酶XVII、蛋白酶XXI、肽链内切酶(Lysylend叩eptidase)等，后者可以列举氨基肽酶(Aminopeptidase)、羧基肽酶(Carboxypeptidase)等，只要是具有蛋白酶活性的任何酶都可以。蛋白酶的活性，只要为分解糖化蛋白质或糖化肽活性即可，可以使用0.110000u/mL，优选11000u/mL，更优选为10500u/mL。试剂A的pH可以考虑酶的稳定性和反应效率等进行调整，可以调整为pH4.08.0，优选pH5.07.0，更优选为pH5.56.5。试剂B:含有用于消去利用蛋白酶分解糖化蛋白质或糖化肽而生成的氨基酸的作用的物质的试剂。只要能够消去氨基酸，任何系统都可以，例如，含有0.011000u/mL、优选为0.1500u/mL、更优选为1100u/mL的氨基酸氧化酶，0.011000u/mL、优选为0.1100u/mL、更优选为110u/mL的过氧化氢酶，以及4-氨基安替比林(4-AA)。试剂B的pH可以考虑酶的稳定性和反应效率等进行调整，可以调整为pH5.59.0，优选pH6.58.5，更优选pH7.08.0。除了上述氧化酶之外，氨基酸消去物质也可以为脱氢酶。另外，在消去氨基酸生成过氧化氢时，为了分解上述过氧化氢，可以在试剂B内加入过氧化氢酶。试剂C:含有二肽分解酶和用于分解、定量利用该二肽分解酶分解糖化二肽生成的氨基酸或者糖化氨基酸的物质的试剂。使用脱氢酶作为氨基酸分解酶时，可以直接或者间接测定辅酶的变化量。具体来说，在使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)作为辅酶时，可以在还原性NAD的最大吸收波长(340nm)处用比色计直接，或者使用硫辛酰胺脱氢酶(di叩horase)或PMS等电子载体和各种四氮唑盐等还原性显色试剂间接或直接定量还原性NAD。在使用氧化酶作为作用于氨基酸的酶时，测定氧的消耗量或者反应生成物。例如，在使用氨基酸氧化酶时，可以用公知的方法直接或者间接的测定反应生成的过氧化氢、氨或者2-酮酸。另外，在使用FAO作为分解糖化氨基酸的酶时，也可以测定生成的过氧化氢。测定过氧化氢的方法有以下的几种1.显色法使用在过氧化物酶(POD)存在的情况下，通过4-氨基安替比林(4-AA)或3-甲基-2-苯噻酮(MBTH)等偶合齐U(coupler)与苯酚等色原体的氧化缩合反应生成Trinder试剂(Trinder'sReagent)，或使用直接氧化显色的Leuco型试剂的方法。2.荧光法使用因氧化会发出荧光的化合物，例如，高香草酸(HomovanillicAcid)、4-羟基苯基乙酸(4-HydroxyphenylaceticAcid)、酪胺(Tyramine)、对位甲酚(Paracresol)、或联乙酰荧光(Diacetylfluorescence)衍生物的方法。3.化学发光法使用催化剂努米诺(Luminol)、光泽精(Lucigenin)、异氨基苯二酰肼(Isoluminol)、邻苯三酚等的方法。试剂C的优选实施例为含有0.11000u/mL，优选0.5100u/mL，更优选110u/mL的二肽分解酶；0.11000u/mL，优选为1100u/mL的氧化游离氨基酸的L-氨基酸氧化酶；0.11000u/mL，优选1100u/mL，更优选550u/mL的过氧化物酶；1\1-乙基^-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS);以及0.050.5。/。的叠氮化钠(NaN3)。所述浓度的叠氮化钠具有使试剂B中所含的过氧化氢酶失活的作用。试剂C的pH可以考虑酶的稳定性和反应效率等进行调整，可以调整为pH5.09.0，优选pH6.08.0，更优选为pH6.57.5。所述各试剂A、B、C，也可以含有表面活性剂、非离子表面活性剂、两性离子表面活性剂中任意一种以上，也可以用0.0005%10%的浓度添加所述各试剂。在所述的试剂组合物中，必须将用于下述目的的物质分开作为不同的试剂来构成，即，用于将试剂C的二肽分解酶和利用所述二肽分解酶分解糖化二肽而生成的氨基酸或者糖化氨基酸进行分解定量的试剂分开构成。(l)糖化蛋白质或糖化肽的测定以下列举使用所述的试剂A、B、C来测定糖化蛋白质或糖化肽的实施例。第一反应向0.001-1.0mL的含有糖化蛋白质或糖化肽的样品中添加试剂A，使糖化蛋白质或糖化肽分解为糖化二肽(式(l))。反应温度只要是蛋白酶可以将样品中存在的糖化蛋白质或糖化肽分解的温度即可，任何温度都可以，可以设定为2045。C，优选约304(TC。反应时间也一样，可以设定为0.160分钟，优选约110分钟。第二反应向第一反应的反应液中添加试剂B，消去第一反应中生成的游离氨基酸(式(2))。第三反应向第二反应所获得的样品中添加试剂C，利用二肽分解酶从糖化二肽游离出糖化氨基酸和氨基酸，接着，利用L-氨基酸氧化酶氧化游离氨基酸，利用生成的过氧化氢与过氧化氢酶将4-AA与TOOS氧化縮合，定量地生成在555nm处有吸光度的醌色素。测定并定量所述醌色素的555nm处的吸光度的变化(式(3))。式(l》糖化蛋白质(糖化肽)—糖化二肽+游离氨基酸式(2):游离氨基酸+02+1120—a-酮酸+氨+过氧化氢式(3):糖化-Val-His—糖化-Val+L-HisL-His+02+H20—a-酮酸+氨+过氧化氢2过氧化氢+4-AA+TOOS—醌色素+4H20(2)糖化二肽的测定以下列举使用所述的试剂B、C来测定糖化二肽的实施例。第一反应向0.001-1.0mL的含糖化二肽的样品中添加试剂B，使其反应(所述式(2))。反应温度只要是可以将样品中存在的游离氨基酸消去的温度即可，任何温度都可以，可以设定为2045'C，优选约3040。C。反应时间也一样，可以设定为0.160分钟，优选约110分钟。另外，如果样品中不存在游离氨基酸，也可以不进行试剂B的处理。第二反应向第一反应所获得的样品中添加试剂C，利用二肽分解酶从糖化二肽游离出糖化氨基酸和氨基酸，接着，利用L-氨基酸氧化酶氧化游离氨基酸，利用生成的过氧化氢和过氧化物酶将4-AA和TOOS氧化缩合，定量地生成在555nm处有吸光度的醌色素。测定并定量所述醌色素在555nm处的吸光度变化(式(3))。如上所述，试剂A、B、C可以用作定量糖化蛋白质、糖化肽、糖化二肽的试剂组合物，例如，可以提供为液体产品以及液体产品的冷冻产品或者冷冻干燥产品。也可以进一步向用于定量糖化蛋白质、糖化肽、糖化二肽的试剂组合物中，适当添加表面活性剂、盐类、缓冲剂、pH调整剂或防腐剂等。二肽分解酶也可以有效用于使用FAO的糖化蛋白质、糖化肽、糖化二肽的测定方法中。二肽分解酶可以分解蛋白酶不能分解或分解非常弱的糖化二肽，因此可以充分提供作为FAO底物的糖化氨基酸。因此，在使用蛋白酶和FAO测定糖化氨基酸的方法中，能改善以往成为问题的测量精度。实施例下面依据实施例具体地说明本发明，本发明不受这些实施例的限制。实施例1(二肽分解酶的筛选)(1)自微生物中筛选将从土壤中纯化的各种菌株，在1000mL(pH7.0)含有10g(1.0。/。)的Ehlrich鲣鱼提取物、10g(1.0。/。)的多聚蛋白胨(Polypeptone)、3g(0.3。/。)的酵母提取液和5g(0，/。)的NaCl的培养基中，在3(TC培养24小时。离心分离获得的培养液来分离培养上清液和菌体。菌体清洗后悬浊在0.1MMOPS缓冲溶液(pH7.0)里，利用超声波破碎，将离心分离后获得的上清液作为无细胞提取液。按照实施例3的方法调查获得的培养液和无细胞提取液的二肽分解活性。(2)从市场上销售的酶试剂中筛选使用显示活性调整为1Ku/mL的市场上销售的含有蛋白酶的溶液(在不溶解的情况下，尽可能调整为高浓度)，按照实施例3的方法来调查二肽分解活性。其结果为市场上销售的蛋白酶中不存在具有二肽分解活性的蛋白酶。实施例2(二肽分解酶生产菌的鉴定)按照下述方法鉴定由实施例1的筛选获得的二肽分解酶生产菌。生长温度试验以外的培养温度采用30°C。生长状态使用胰蛋白胨大豆琼脂(TrypticSoyAgar)(荣研化学株式会社、以下简称荣研)平板培养3天。形态使用胰蛋白胨大豆琼脂(荣研)平板培养1天。革兰氏染色使用Fav(wG套件S(日水制药株式会社、以下简称日水制药)试剂染色。厌氧生长使用胰蛋白胨大豆琼脂(荣研)平板培养3天。用GasPakanaerobicsystem(BBL)保持厌氧状态。细胞色素氧化酶使用细胞色素氧化酶测试纸(日水制药)。过氧化氢酶检测出在3%H202中会产生气泡。O-F测试在OF基础培养基(OFBasalMedium)(Difco)内添加过滤灭菌的葡萄糖至1%。将液体石蜡多层化在厌氧状态下连续培养7天。硝酸盐的还原性营养液(Nutrientbroth)(Difco)内添加0.1%的KN03培养10天。柠檬酸盐的利用使用Simmons柠檬酸钠培养基(荣研)培养14天。尿毒酶使用Christensen尿素培养基(荣研)平板培养14天。卵磷脂酶在lOOOmL含有10g的细菌蛋白胨、lg的葡萄糖、10g的NaCl、5g的酵母提取液(Difco)、15g的琼脂、50mL的卵黄的培养基内培养5天。ONPG试验(P-半乳糖苷酶)使用ONPGdisks(日水制药)培养1天。由糖类生成的酸向1000mL(pH7.2)含lg的(NH4)HPO4、0.2g的KC1、0.2g的MgSO4'7H2O、0.2g的酵母提取液(Difco)、15g的琼脂noble(Difco)、20mL的0.2%B.C.P的培养基中加入另外灭菌过的糖至1%之后培养24天。苯丙氨酸脱氨酶使用lOOOmL含2g的DL-苯丙氨酸、3g的酵母提取液(Difco)、lg的(NH4)HP04、5g的NaCl、15g的琼脂的培养基培养10天。精氨酸水合酶使用lOOOmL含10g的细菌蛋白胨(Difco)、5g的NaCl、0.3g的K2HP04、10g的L-精氨酸盐酸盐、3g的琼脂、20mL的0.2%苯酚红的培养基培养7天。另外，将液体石蜡多层化形成厌氧状态。酪蛋白的分解使用加入脱脂牛奶(Difco)5M的营养琼脂(荣研)培养基培养14天。明胶的分解:使用加入明胶12%的营养琼脂(荣研)培养基培养14天。DNA的分解使用DNA琼脂培养剂(日水制药)培养14天。Tween80的分解使用1000mL(pH7.4)含10g的细菌蛋白胨(Difco)、5g的NaCl、0.1g的CaCV7H20、15g的琼脂、10g的Tween80的培养基培养7天。酪氨酸的分解使用加入酪氨酸0.5%的营养琼脂(荣研)培养基培养14天。七叶苷的分解使用1000mL含10g的细菌蛋白胨(Difco)、0.5g的柠檬酸铁、lg的七叶苷的培养基培养2天。淀粉的分解使用加入可溶性明胶0.2%的营养琼脂(荣研)培养基培养14天。熊果素的分解在向1000mL含5g的熊果素(Albutin)、5g的酵母提取液(Difco)、15g的琼脂的培养基中每皿(20mL)添加3滴1%的柠檬酸铁铵的培养基内培养2天。麦康凯琼脂(MacConkeyagar)上的生长使用麦康凯琼脂培养基(荣研)培养14天。十六垸三甲基溴化铵琼脂(cetrimideagar)上的生长使用十六垸三甲基溴化铵琼脂培养基(日本制药)培养14天。生长温度使用胰蛋白胨大豆琼脂(荣研)的斜面培养基培养2天。另外，在10。C、37°C、42"C下培养7天。3-酮乳糖的生成使用1000mL含lg的酵母提取液(Difco)、10g的乳糖、15g的琼脂的培养基培养14天。吲哚的生成使用lOOOmL含lOg的胰化蛋白胨(Difco)的培养基培养14天。API20NE试验参照制造商的方法。前培养在胰蛋白胨大豆琼脂(荣研)30'C培养2天。16SrDNA的碱基序列分析在胰蛋白胨大豆琼脂(荣研)3(TC的条件下培养2天后，使用DNeasyTissuekit(QIAGEN株式会社)制备DNA。使用MicroSeqFullGene16SrDNAKit(AppliedBiosystems株式会社)，进行16SrDNA的PCR以及序列反应，用多重对齐、邻接法制成系统树。鉴定结果如下所示。1.形态的性质本菌体的形状为0.4xl.20.5x3.2pm的杆状菌，有运动性。2.培养的性质本菌体如果在胰蛋白胨大豆琼脂培养基上生长，菌落的形态为凸状的全部边缘为光滑的圆形，所述菌落的颜色为淡黄色。未确认到麦康凯(MacConkey)琼脂培养基和十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基的生长。3.生理学的性质如表1所示。4.遗传学的性质依据16SrDNA的系统树形成智利鞘脂单胞菌等和簇(cluster)。表1.糖化二肽分解酶生产菌的生理学性质评价项目结果评价项目结果革兰氏染色性阴性苯丙氨酸脱氨酶阴性厌氧生长阴性精氨酸水合酶阴性细胞色素氧化酶阳性酪蛋白分解阴性过氧化氢酶阳性明胶分解阴性0~F测试好氧生成弱酸DNA分解阴性硝酸盐的还原性阴性Tween80分解阳性拧檬酸盐的利用阴性酪氨酸分解阴性丙二酸盐的利用阴性七叶苷分解阳性尿毒酶阴性淀粉分解阳性卵磷脂酶阴性熊果素分解阳性e-半乳糖苷酶阳性生长的温度范围10-37t;吲哚的产生阴性3-酮乳糖的生成阴性葡萄糖酸性化阴性吲哚的生成阴性酸的生成同化性(assimulating)阿东糖醇阴性葡萄糖阳性阿拉伯糖阳性L-阿拉伯糖阴性纤维二糖阳性D-甘露糖阳性己六醇(dulcite)阴性D-甘露醇阴性甘油阴性N-乙酰-D-氨基葡萄糖阴性肌醇阳性麦芽糖阳性乳糖弱阳性葡萄糖酸钾阴性麦芽糖阳性正辛酸(n-caprili■cacid)阴性甘露醇阴性己二酸阴性棉籽糖弱阳性dl-苹果酸阳性鼠李糖阴性柠檬酸阴性核糖阴性醋酸苯阴性水扬酸弱阳性山梨(糖)醇阴性蔗糖阳性海藻糖阳性木糖阴性已经判明由上述筛选得到的二肽分解酶的生产菌为智利鞘脂单胞菌NO.0522。实施例3(二肽分解活性的测定)二肽分解酶的活性通过定量由Fru-Val-His的分解生成的Fm-Val或组氨酸来测定。在这里说明组氨酸的定量方法。酶活性1单位(U)定义为1分钟内分解lpmol的Fru-Val-His的酶量。配制用于活性测定的以下试剂(l)、(2)、(3)以及底物溶液。试剂(l):PIPESpH6.2(株式会社同仁化学)lOOmMCoCl2(和光纯药工业株式会社)2mMTritonX-1OO(Sigma-AldrichJapanK.K.)0.1%试剂(2):MOPSpH7.5(株式会社同仁化学)300mM斗-AA(和光纯药工业株式会社)2mMEDTA(株式会社同仁化学)5mMTritonX陽1OO(Sigma)0.1%NaN3(和光纯药工业株式会社)0.1%L-氨基酸氧化酶(和光纯药工业株式会社)10U/mL过氧化物酶(PO-3，AmanoEnzymeInc.)14.3U/mL试剂(3):将试剂(2)和20mM苯酚以7:1的比例混合后，避光保存。底物溶液Fru-Val-His(株式会社肽研究所)在100mMMOPS缓冲溶液(pH7.0)中溶解，配制40mM的底物溶液。正确地分别注入0.02mL的1.40mM底物溶液与0.16mL的试齐U(l)，并进行混合，在37。C下预热5分钟。然后，正确地添加0.02mL的酶样品溶液并进行混合，再在37'C下使之反应。盲检时用0.02mL试剂(l)代替酶样品溶液。IO分钟后，正确地添加0.8mL的试剂(3)，并进行混合，使其在37r下反应。15分钟后，测定在505nm处的吸光度，用下述公式计算二肽分解活性。但是，为了使AABS二(As-Ab)^0.50Abs，将使用试剂(l)适度稀释后的酶样品溶液作为测定样品。下述公式的记号及数值如下As:样品溶液的吸光度Ab:盲检液的吸光度△ABS:As-Ab12.88:有色醌色素(QuinoneDye)在505nm处的毫摩尔吸光率(mmol/L/cm)10:反应时间(min)2:根据2分子H202生成1分子有色醌色素得到的系数1:光路长(cm)1.0:反应总液量(mL)0.02:提供给反应的酶样品溶液量(mL)n:酶样品溶液稀释倍率公式厶ABS/10X21.0活性(U/mL)=-X1X-Xn12.880.02实施例4(粗酶溶液的配制)将智利鞘脂单胞菌NO.0522,在1000mL(pH7.0)含有10g(1.0。/。)的Ehlrich鲣鱼提取物、10g(1.0n/。)的多聚蛋白胨、3g(0.3。/。)的酵母提取液和5g(0.5y。)的NaCl的培养基中，在28。C下培养36小时。二肽分解酶是菌体内的酶，因此离心分离该培养液并回收菌体。将获得的菌体清洗后，在0.1MMOPS缓冲溶液(pH7.0)里悬浊，利用超声波破碎，将离心分离后获得的上清液作为无细胞提取液。实施例5(部分精制酶溶液的配制)用30%50%的饱和硫酸铵对上述的无细胞提取液进行盐析处理，通过离心分离获得盐析沉淀物。该盐析沉淀物溶解于30mMMOPS缓冲溶液(pH7.0)后，用超滤膜(商品名称MICROZA，分离分子量3000，旭化成株式会社，下述相同)进行脱盐浓縮。将该浓縮液在用30mMMOPS缓冲溶液(pH7.0)平衡后的阴离子交换树脂柱(商品名DEAE-SepharoseCL-6B、GEHealthcareBio-SciencesK.K.)中，使二肽分解酶吸附，用同样的缓冲溶液清洗。接着，使用30mMMOPS缓冲溶液(pH7.0)以及含有0.2MNaCl的30mMMOPS缓冲溶液(pH7.0)，利用NaCl浓度00.2M的直线浓度梯度法洗脱二肽分解酶，获得部分精制酶。实施例6(单一酶的获得)用超滤膜浓缩上述部分精制酶溶液，向用含有0.2MNaCl的30mMMOPS缓冲溶液(pH7.0)平衡后的凝胶过滤色谱(商品名HiLoad16/60Superdex200pg、GEHealthcareBio-SciencesK.K.)柱充电，以0.5mL/min的流速进行分划，回收活性分划组分。对获得的精制酶溶液实行Native-PAGE，静置于含有酶活性测定试剂的琼脂糖凝胶上，并且进行作为二肽分解活性指标的活性染色。接着，切下显示活性的条带，并提取酶。用SDS-PAGE确认该提取液的纯度的结果为在45kDa附近检测到单一条带(图5)，获得二肽分解酶的精制酶。实施例7(二肽分解酶的理化性质)使用上述获得的二肽分解酶的精制酶，研究其理化性质。1.最适pH以及pH稳定性的研究最适pH用各种缓冲溶液(pH4-6:0.1M醋酸缓冲溶液、pH6-7.5:0.1MPIPES缓冲溶液、pH7.5-8:0.1MTES缓冲溶液、pH8-9:O.IMTris缓冲溶液)来替换实施例3中记载的试剂(l)的pH，在调整为pH5-9以外，按照实施例3的方法进行研究。pH稳定性，将二肽分解酶在各种缓冲溶液(pH4-6:O.IM醋酸缓冲溶液、pH6-6.5:0.1MMES缓冲溶液、pH6.5-7.5:O.IMMOPS缓冲溶液、pH7.5-8.0:O.IMTES缓冲溶液、pH8.0-9.0:Tris缓冲溶液)中37t:培养l小时后，按照实施例3的方法(37'C、pH6.2)测定活性。二肽分解酶的最适pH是6.2，在pH值6.07.0的范围内显示出在pH值6.2处具有80%以上的活性(图1)，并且显示出酶在pH5.0以上是稳定的(图2)。2.最适温度以及温度稳定性的研究在将实施例3中第一反应的温度变为205(TC以外，按照实施例3的方法研究最适温度。温度稳定性通过在O.IMMOPS缓冲溶液(pH7.0)中溶解二肽分解酶，在2050。C下培养1小时后，通过按实施例3的方法测定酶活性来研究。其结果是二肽分解酶的最适温度为45°C，显示出在3545'C的范围内可充分地进行反应。另外，由于酶在50"C以下可以稳定地维持活性，所以显示出具有高温稳定性(图4)。3.分子量(SDS-PAGE)使用PhastGel梯度10-15(GEHealthcareBio陽SciencesK.K.)，按照PhastSyste全自动电泳装置(GEHealthcareBio-SciencesK.K.)的手册进行SDS-PAGE。将LMWMarkerKit(GEHealthcareBio-SciencesK.K.)作为标准蛋白质，做同样的电泳，求得分子量。分子量约为45kDa。4.金属离子等对酶活性的影响将实施例3中的试剂(1)用指定浓度的各种金属等(表2)来替代，以及使用含有0.1%TritonX-100的lOOmMPIPES缓冲溶液pH6.2，其余按照实施例3的方法测定酶活性，针对金属离子等对酶活性的影响进行研究。活性可以被Mg2、0)2+或2112+离子激活，被EDTA或(x，a'-联吡啶抑制。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>实施例8(精制酶的N末端以及内部氨基酸序列的确定)向株式会社岛津制作所蛋白酶解析中心委托对上述获得的二肽分解酶的精制酶N末端以及内部氨基酸序列进行解析，获得显示为序列号3、4、5三部分的氨基酸序列。实施例9(寡核苷酸引物的设计)以自序列号3和4的氨基酸序列推定的碱基序列为基础，设计用于聚合酶链式反应(PCR)的引物6、7。各引物的碱基序列分别用序列号6、7来表示。实施例10(染色体DNA的配制)将智利鞘脂单胞菌NO.0522在1000mL(pH7.0)含有10g(1.0。/。)的Ehlrich鲣鱼提取物、10g(1.0。/。)的多聚蛋白胨、3g(0.3n/。)的酵母提取液和5g(0.5。/。)的NaCl的培养基中，在30'C下培养16小时后，通过离心分离进行菌体回收。该菌体悬浊在含150mMNaCl的100mMEDTApH8.0中，添力卩Lysozyme(RocheDiagnosticsK.K.)至!j4mg/mL以及RnaseA(Sigma-AldrichJapanK.K,)到20吗/mL，在37。C培养1小时。再添加含3倍量的1%SDS的100mMTris-盐酸缓冲溶液pH9.0，混合均匀。向其中加入等量的TE饱和苯酚进行离心，回收离心上清液。在该离心上清液中添加0.6倍量的异丙醇，在-2(TC下放置2小时。离心后丢弃上清液，用70%的乙醇清洗沉淀，并进行真空干燥，从而获得智利鞘脂单胞菌NO.0522的染色体DNA。实施例11(利用PCR的探针的配制)使用引物6、7和上述的染色体DNA进行PCR。将配制为lmg/mL的染色体DNA用TE缓冲溶液稀释10倍，在lpL该稀释液中添加以下溶液。LATaq(5U4iL)(TakaraBio株式会社制造)0.5pLGC缓冲溶液I(TakaraBio株式会社制造)25pLdNTPmix8jiL引物6l|iL引物7lnL灭菌水13.5)dL混合上述溶液后，将由在96。C下30秒、在6(TC下30秒、在72°C下1分钟所组成的一系列处理进行30个循环后，在72'C下处理5分钟，进行PCR反应。接着，进行琼脂糖电泳，可确认约500bp的碎片通过PCR得到扩增。实施例12(PCR碎片的亚克隆)从琼脂糖凝胶上切下利用上述PCR扩增的约500bp的碎片，使用TaKaRaEasyTrapKit(TakaraBio株式会社)进行精制。用W激酶磷酸化该碎片，并且使用pGEMTEasyvectorSystem(PromegaK.K.)进行TA克隆。使用370DNA测序系统(AppliedBiosystemsInc.)确定插入PCR碎片的该质粒的碱基序歹U(序列号8)。在该碱基序列的基础上设计引物9、10(序列号9、10),使用所述染色体DNA进行PCR。用TE缓冲溶液将lmg/mL的染色体DNA溶液稀释10倍，向lpL该稀释液中添加以下溶液。LATaq(5U/pL)(TakaraBio株式会社.社制造)0.5(aLGC缓冲溶液I(TakaraBio株式会社.社制造)25dNTPmix8|iL引物9*L引物10l(iL灭菌水13.5|iL上述溶液混合后，将由在96。C下30秒、在60。C下30秒、在72°C下1分钟所组成的一系列处理过程进行30个循环后，在72'C下处理5分钟，进行PCR反应。接着，进行琼脂糖电泳，从琼脂糖凝胶上切下约500bp的碎片，使用TaKaRaEasyTrapKit(TakaraBio株式会社.)进行精制。对获得的PCR碎片，使用DIG-HighPrime(RocheDiagnosticsK.K.)进行地高辛(Digoxigenin)标记。实施例13(Southern杂交)使用上述制作的探针(序列号8)进行Southern杂交。染色体DNA用HindIII、Sphl、Pstl、Xbal、Bamffl、Smal、Kpnl、Sacl、EcoRI以及Sail完全消化的物质、这些限制酶以及EcoRV组合后完全消化的物质，用0.8。/。琼脂糖电泳进行分离，且这些在0.4MNaOH条件下转录为Zetaprobemembrane(Bio-Rad株式会社)，制作Southern杂交的膜。Southern杂交是，以DIGEASYHyb(RocheDiagnosticsK.K.)在42。C下进行16个小时杂交，然后，用含0.1。/。SDS的2xSSC在室温下清洗5分钟，重复两次，再使用含0.1%SDS的O.lxSSC在68。C下清洗5分钟。使用碱性磷酸酶标记的地高辛(Digoxigenin)抗体对其进行检测，从结果制作出目的基因周边的限制酶图(图6)。根据限制酶图，通过用BamHI和EcoRI完全消化的2.4Kbp的碎片中含有目的基因，将用BamHI和EcoRI完全消化染色体DNA后的物质用0.8%琼脂糖电泳后，利用琼脂糖回收2.4Kbp附近的碎片，且插入到pUC18(TakaraBio株式会社)质粒的BamHI、EcoRI位点。制作1000株用该重组质粒转基因的大肠杆菌(E.coli)JM109(TakaraBio株式会社)。获得的转基因的菌落转录为尼龙膜(NylonMembrane)(RocheDiagnosticsK.K.)后，在含1.5MNaCl的0.5MNaOH条件下进行碱性固定，制作菌落杂交的膜。接着，用DIGEASYHyb(RocheDiagnosticsK.K.)在42。C下进行16个小时杂交，接着用含0.1MSDS的2xSSC在室温下清洗5分钟，重复两次，再使用含0.1%SDS的O.lxSSC在68。C进行清洗。使用碱性磷酸酶标记的地高辛(Digoxigenin)抗体对其迸行检测，结果获得数株阳性克隆。从该克隆中回收质粒，且使用370DNA测序系统(AppliedBiosystemsInc.)确定碱基序列。确定的二肽分解酶基因的碱基序列号表示为序列号1，另外从该DNA序列翻译的多肽的氨基酸序列表示为序列号2。该基因有1374bp的编码领域，编码了457个氨基酸残基。另外，自碱基序列预测的氨基酸序列含有实施例8所确定的精制酶的N末端以及内部氨基酸序列。由此可知，获得的重组质粒中含有编码二肽分解酶的基因。在上述本实施例里明确的二肽分解酶基因的碱基序列的基础上，构建引物ll、12(序列号11、12)，使用实施例10记载的染色体DNA进行PCR。用TE缓冲溶液将配制为lmg/mL的染色体DNA稀释10倍，向lpL该稀释液中添加以下溶液。LATaq(5UL)(TakaraBio株式会社制造)0.5pLGC缓冲溶液I(TakaraBio株式会社制造)25pLdNTPmix8fiL引物lllpL引物12lpL灭菌水13.5pL混合上述溶液后，将由在96'C下30秒、在6(TC下30秒、在72°C下1分钟组成的一系列处理过程进行30个循环后，在72"C下处理5分钟，进行PCR反应。接着，进行琼脂糖电泳，从琼脂糖凝胶上切下约1400bp的碎片，使用TaKaRaEasyTrapKit(TakaraBio株式会社.)进行精制。用Pagl和Sail对获得的基因碎片进行限制酶处理，且与用Ncol和Sail限制酶处理后的pTrc99a(GEHealthcareBio-SciencesK.K.)连接，将该质粒命名为pTPRGA。使用pTPRGA获得大肠杆菌JM109的转基因后的转基因体大肠杆菌JM109(pTPRGA)。实施例14(利用转基因体生产酶，活性确认以及酶的部分精制)在lOOmL含有100昭/mL氨苄西林以及0.2mM异丙基-卩-D(-)硫代半乳糖苷(IPTG)的LB培养基(1。/。细菌用胰蛋白胨(Bacto-tryptone),0.5。/。酵母提取物(bactoyeastextract),1%氯化钠，pH7.0)中，在37。C下对大肠杆菌JM109(pTPRGA)振荡培养20小时。培养后，回收离心分离获得的菌体，悬浊在10mL的100mMMOPS缓冲溶液(pH7.0)中，用超声波处理破碎菌体，将离心分离后获得的上清液作为无细胞提取液。该提取液的二肽分解活性为约0.05U/mL。由于可确认由大肠杆菌JM109(pTPRGA)的培养液制备的无细胞提取液中存在二肽分解酶活性，所以可以明确pTPRGA中插入的碎片为二肽分解酶基因。用30y。50n/。的饱和硫酸铵盐析大肠杆菌JM109(pTPRGA)的无细胞提取液，回收盐析沉淀物。该盐析沉淀物溶解于30mMMOPS缓冲溶液(pH7.0)后，用超滤膜进行脱盐浓縮。在用30mMMOPS缓冲溶液(pH7.0)平衡后的阴离子交换树脂柱(商品名DEAE-SepharoseCL-6B、GEHealthcareBio-SciencesK.K.)中吸附所述脱盐浓縮液中含有的二肽分解酶，并且用同样的缓冲溶液进行清洗。接着，使用含有NaCl的30mMMOPS缓冲溶液(pH7.0)，利用NaCl浓度00.2M的直线浓度梯度法洗脱二肽分解酶。通过上述方法获得重组二肽分解酶的部分精制酶。实施例15(使用二肽分解酶测定糖化二肽)使用糖化血红蛋白卩链二肽的Fru-Val-His(株式会社肽研究所)测定糖化二肽。制备含有以下组成的试剂B、C，进行本研究。另外，待测物为糖化二肽，不需要蛋白酶，因此虽然制备并使用由试剂A去除蛋白酶的试剂E，但是也可以不使用试剂E，仅用试剂B、C定量糖化二肽。另外，二肽分解酶使用实施例6获得的精制酶。试剂E:MESpH6.0(株式会社同仁化学)100mMCaCl2'6H202mMTritonX-1OO(Sigma-AldrichJapanK.K.)0.1%NaN3(和光纯药工业株式会社)0.02%试剂B:MOPSpH7.5(株式会社同仁化学)100mMTritonX-100(Sigma-AldrichJapanK.K.)0.1%NaN3(和光纯药工业株式会社)0.02%4-AA(和光纯药工业株式会社)1.05mML-氨基酸氧化酶(和光纯药工业株式会社)50U/mL过氧化氢酶(AmanoEnzymeInc.)5U/mL试剂C:PIPESpH7.0(株式会社同仁化学)300mMTritonX-1OO(Sigma-AldrichJapanK.K.)0.1%NaN3(和光纯药工业株式会社)0.1%二肽分解酶(精制品)2.4U/mLCoCl2(和光纯药工业株式会社)2mMTOOS(株式会社同仁化学)5.835mM过氧化物酶(PO-3，AmanoEnzymeInc.)16.5U/mLEDTA(株式会社同仁化学)5mM制备40mM浓度的Fm-Val-His，用lOOmMMOPS缓冲溶液pH7.0进行稀释，制备浓度为O.l、0.2、0.4、0.6、0.8mM的Fru-Val-His溶液。向O.OlmL该稀释溶液中添加0.04mL的试剂E，在37"C下反应5分钟。该反应溶液中添加0.1mL试剂B，在37。C下反应IO分钟。接着，在该反应液中添加0.9mL试剂C，在37i:下进行反应，测定555nm处的吸光度，反应5分钟后，求得吸光度的增加量(AOD)。各种浓度的Fm-Val-His的测定结果如图7所示。由图7可知，溶液中的Fru-Val-His的浓度与吸光度的增加量之间呈直线相关。由上述可知，二肽分解酶可以分解为Fru-Val-His为Fru-Val和L-组氨酸，以及通过本方法可以短时间且高精度地测定溶液中的Fru-Val-His。可以使用糖化血红蛋白P链的肽的Fru-VHLTPE测定糖化肽。在此情况下，制备含有以下组成的试剂A、B、C，用试剂A分解Fru-VHLTPE，可以用试剂B、C测定生成的Fm-Val-His。试剂A:MESpH6.0(株式会社同仁化学)100mMCaCl2'6H202mMTritonX-100(Sigma-AldrichJapanK.K.)0.1%NaN3(和光纯药工业株式会社)0.02%蛋白酶(嗜热菌蛋白酶(thermolysin)、大和化成株式会社)250U/mL试剂B:MOPSPH7.5(株式会社同仁化学)lOOmMTritonX-1OO(Sigma-AldrichJapanK.K,)0.1%NaN3(和光纯药工业株式会社)0.02%4-AA(和光纯药工业株式会社)l.OSmML-氨基酸氧化酶(和光纯药工业株式会社)50U/mL过氧化氢酶(AmanoEnzymeInc.)5U/mL试剂C:PIPESpH7.0(株式会社同仁化学)300mMTritonX-100(Sigma扁AldrichJapanK.K.)0.1%NaN3(和光纯药工业株式会社)0.1%二肽分解酶(精制品)2.4U/mLCoCl2(和光纯药工业株式会社)2mMTOOS(株式会社同仁化学)5.83SmM过氧化物酶(PO-3，AmanoEnzymeInc.)16.5U/mLEDTA(株式会社同仁化学)5mM实施例16(关于二肽分解酶底物特异性的研究)将测定实施例3中的二肽分解活性时的底物，从糖化血红蛋白卩链的二肽Fru-Val-His变更为糖化血红蛋白a链的二肽Fru-Val-Leu(糖化缬氨酸亮氨酸)，以此来确认二肽分解酶对底物特异性的反应性。其结果，在使用Fru-Val-Leu作底物的情况下，二肽分解酶的活性值只有在使用Fru-Val-His的情况下的4.9。/。。接着，针对实际测定体系的反应性，使用实施例15的二肽分解酶测定糖化二肽的方法中，将0.8mMFru-Val-His以及0.8mMFru-Val-Leu用作底物来进行确认。结果如图8所示。从图8可知，使用图7将使用Fru-Val-Leu情况下的吸光度变化量换算为Fru-Val-His浓度时，为0.14mM，相对于所使用的底物浓度0.8mM，结果显示有18%的反应性，这点暗示二肽分解酶对糖化血红蛋白a链的二肽Fm-Val-Leu的反应性低。因此，使用本发明的二肽分解酶测定糖化血红蛋白被认为是对糖化血红蛋白P链蛋白质的特异性高，除此之外还可以高精度地进行测定。另外，图8中，Fm-VH是Fru-Val-His，Fru-VL是Fru-Val"Leu。权利要求1.一种二肽分解酶，其特征在于，所述二肽分解酶作用于二肽，生成氨基酸。2.如权利要求1所述的二肽分解酶，其特征在于，所述二肽为糖化二肽，生成糖化氨基酸和氨基酸。3.如权利要求2所述的二肽分解酶，其特征在于，所述糖化二肽为糖化血红蛋白P链二肽的糖化-Val-His，糖化氨基酸为糖化-Val，氨基酸为组氨酸。4.一种二肽分解酶，其具有以下理化性质(1)作用以及底物作用于二肽，生成氨基酸；作用于糖化二肽，生成糖化氨基酸和氨基酸；(2)最适pH值6.2，pH值6.07.0时在pH值6.2具有80。/。以上的活性；(3)pH稳定性pH5.0以上稳定；(4)最适温度45°C，在3545。C的范围具有充分的反应性；(5)热稳定性在5(TC以下稳定；(6)分子量约45kDa(SDS-PAGE);(7)激活剂以及抑制剂利用Mg^、C(^+或Z,离子进行激活，禾U用EDTA或a,a'-联吡啶抑制活性。5.如权利要求14中任一项所述的二肽分解酶，其特征在于，所述二肽分解酶来源于鞘脂单胞菌属C^/n'"go;^j^)的微生物。6.如权利要求5所述的二肽分解酶，其特征在于，所述鞘脂单胞菌属的微生物来源于智利鞘脂单胞菌NO.0522GS^/n'"go;^j^NO.0522,NITEBP-250)或者该菌株的变异株。7.—种蛋白质，其为下述(a)或(b):(a)具有序列表的序列号2表示的氨基酸序列的蛋白质；(b)具有序列表的序列号2表示的氨基酸序列中有一个或者两个以上氨基酸残基经过缺失、取代或者添加的氨基酸序列，且有二肽分解活性的蛋白质。8.—种基因，其编码下述(a)或(b)的蛋白质(a)具有序列表的序列号2表示的氨基酸序列的蛋白质；(b)具有序列表的序列号2表示的氨基酸序列中有一个或者两个以上氨基酸残基经过缺失、取代或者添加的氨基酸序列，且有二肽分解活性的蛋白质。9.一种基因，其由下述(a)、(b)或(c)的DNA组成(a)具有序列表的序列号1表示的碱基序列的DNA;(b)具有序列表的序列号1表示的碱基序列中有一个或者两个以上碱基经过缺失、取代或者添加的碱基序列，且编码具有二肽分解活性的蛋白质的DNA;(c)与具有序列表的序列号1表示的碱基序列的DNA在严格条件下进行杂交，并且编码具有二肽分解活性的蛋白质的DNA。10.—种重组质粒，其特征在于，其含有权利要求8或9所述的基因。11.一种转化体或转导体，其特征在于，其是采用权利要求10所述的重组质粒对宿主细胞进行转化而得到的。12.如权利要求11所述的转化体或转导体，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌或者假单胞菌属(P"w&mo"w)的微生物。13.—种二肽分解酶的制造方法，其特征在于，培养鞘脂单胞菌属的微生物，生成权利要求14中任一项所述的二肽分解酶，收集该二肽分解酶。14.如权利要求13所述的二肽分解酶的制造方法，其特征在于，所述鞘脂单胞菌属的微生物为智利鞘脂单胞菌NO.0522(NITEBP-250)或者该菌株的变异株。15.—种智利鞘脂单胞菌NO.0522(NITEBP-250)，其特征在于，其为生产权利要求14中任一项所述的二肽分解酶的微生物。16.—种糖化氨基酸和氨基酸的生成方法，其特征在于，使权利要求14中任一项所述的二肽分解酶或者权利要求7所述的蛋白质作用于含有糖化二肽的待测物。17.如权利要求16所述的糖化氨基酸和氨基酸的生成方法，其特征在于，所述糖化二肽为糖化血红蛋白(3链二肽的糖化-Val-His。18.—种糖化氨基酸和氨基酸的生成方法，其特征在于，使蛋白酶以及权利要求14中任一项所述的二肽分解酶或者权利要求7所述的蛋白质作用于含有糖化蛋白质或者糖化肽的待测物。19.如权利要求18所述的糖化氨基酸和氨基酸的生成方法，其特征在于，所述糖化蛋白质为糖化血红蛋白(3链蛋白质，所述糖化肽为糖化血红蛋白(3链蛋白质的分解物。20.—种糖化蛋白质、糖化肽或者糖化二肽的测定方法，其特征在于，对于利用权利要求1619中任一项所述的生成方法生成的氨基酸，添加分解该氨基酸的物质进行分解定量。21.如权利要求20所述的糖化蛋白质、糖化肽或者糖化二肽的测定方法，其特征在于，所述分解氨基酸的物质为脱氢酶或者氧化酶。22.如权利要求21所述的糖化蛋白质、糖化肽或者糖化二肽的测定方法，其特征在于，所述的氧化酶为氨基酸氧化酶。23.—种糖化蛋白质、糖化肽或者糖化二肽的测定方法，其特征在于，使用氧化酶对利用权利要求1619中任一项所述的生成方法生成的糖化氨基酸进行定量。24.如权利要求23所述的糖化蛋白质、糖化肽或者糖化二肽的测定方法，其特征在于，所述氧化酶为果糖基氨基酸氧化酶。25.—种试剂组合物，其特征在于，其用于实施权利要求2024中任一项所述的测定方法。26.如权利要求25所述的试剂组合物，其特征在于，在含有具有蛋白酶活性的物质的试剂A、含有用于消去利用上述试剂A的蛋白酶活性所生成的氨基酸的物质的试剂B、以及含有权利要求14中任一项所述的二肽分解酶或权利要求7所述的蛋白质和对利用上述二肽分解酶或上述蛋白质分解得到的糖化氨基酸或氮基酸进行分解的物质的试剂C中，至少具备试剂B和试剂C。27.如权利要求25所述的试剂组合物，其特征在于，在含有具有蛋白酶活性物质的试剂A、含有用于消去利用上述试剂A的蛋白酶活性所生成的氨基酸的物质的试剂B、含有权利要求14中任一项所述的二肽分解酶或者权利要求7所述的蛋白质的试剂C、以及含有对利用上述二肽分解酶或者上述蛋白质分解得到的糖化氨基酸或者氨基酸进行分解的物质的试剂D中，至少具备试剂B、试剂C和试剂D。全文摘要本发明涉及新型二肽分解酶及其制造方法、使用该二肽分解酶对糖化蛋白质等进行测定的方法、以及用于该测定方法的试剂组合物。本发明提供一种作用于二肽使之分解为氨基酸的二肽分解酶，并且提供了一种新的测定方法，所述方法通过使所述酶作用于糖化二肽，生成糖化氨基酸和氨基酸，并可以迅速、简便且正确地测定用于定量所述氨基酸的糖化蛋白质、糖化肽或者糖化二肽。所述二肽可以为糖化二肽，其生成糖化氨基酸和氨基酸。本发明还提供一种糖化氨基酸和氨基酸的生成方法，采用所述方法可以使蛋白酶和二肽分解酶作用于含有糖化蛋白质或者糖化肽的待测物。本发明还提供了一种糖化蛋白质、糖化肽或者糖化二肽的测定方法，其中向利用所述生成方法生成的氨基酸中添加分解所述氨基酸的物质进行分解并定量。文档编号C12N15/00GK101535477SQ20078004231公开日2009年9月16日申请日期2007年11月14日优先权日2006年11月16日发明者中西雄二,田中宪彰,西尾享一申请人:天野酶株式会社