专利名称：可溶性人源含硒单链抗体酶的制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种应用基因工程与化学突变相结合的 技术制备谷胱甘肽人源含硒单链抗体酶的方法。
背景技术：
含硒的谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的底物是谷胱甘肽(GSH)，催化基团 是硒代半胱氨酸(SeCys)。在生物体内，GPX同超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化 氢酶(CAT) —起构成了机体抗氧化防御体系。GPX在该体系中发挥着重要的 作用，它以GSH为还原剂，分解体内的过氧化氢和各类氢过氧化物，因而能清 除体内活性氧(ROS)，防止脂质过氧化，治疗由活性氧引起的各种疾病，如紫 外线辐射、心脑血管疾病、白内障、肿瘤等。与其它抗氧化酶不同，GPX除了 能清除ROS夕卜，还能降解脂质过氧化物，防止细胞过氧化损伤，这种独特的保 护细胞的功能使它在抗氧化酶体系中占有特别重要的位置。然而，由于天然GPX 的来源相当有限、稳定性差，致使它的模拟物的研究备受关注。
小分子模拟物主要有PZ51 (ebselen)， AL3823A， BXT系列产品，它们的 弱点是活力低，仅为天然GPX的千分之一左右。80年代中期出现的抗体酶制备 技术为GPX的人工模拟开辟了新途径，根据酶学原理、利用免疫学和化学知识， 设计了一种新的产生抗体酶的技术路线，并成功地制备了数种具有很高GPX活 力的含硒抗体酶(中国专利94102481.4和96112628.0)。这些高活力的含硒抗体 酶氨基酸组成是鼠源的，可作为抗原刺激人体产生人抗鼠抗体，因此限制了该类 药物的使用。为了解决这一问题，制备人源含硒单链抗体酶是一个最好的办法， 噬菌体人抗体库的成功构建为这一设想提供了可能。
中国专利99104234.4公开的人源单链含硒抗体酶的制备方法是半抗原 -GSH衍生物的设计与合成；以GSH的衍生物为靶抗原直接从噬菌体展示人抗体 库中筛选GSH特异的单链抗体；在大肠杆菌中以包涵体形式表达无活性的单链 抗体蛋白；变性、复性、纯化单链抗体蛋白；用化学突变(修饰)法将GPX的催化基团SeCys引入单链抗体可变区，因而在单链抗体可变区既有底物结合部 位又有催化基团，结果产生具有GPX活力的人源含硒抗体酶。该法制备的人源 含硒单链抗体酶的方法有以下缺点(l)制备过程中表达的包涵体蛋白，是一种 无正常空间构象，处于沉淀状态下的无活性蛋白分子，需要经过变性-复性才能 有活性。包涵体蛋白复性是一个困难而复杂的过程，仅复性这一步就会损失大量 的单链抗体蛋白，导致该法制备抗体酶产率下降；(2)制备抗体酶的周期长、操 作繁琐，因包涵体复性是使无活性的蛋白分子在适宜的条件下逐渐恢复活性的缓 慢过程；(3)制备的抗体酶活性低，仅为28.8-256U/txmo1，低于天然酶一个数量 级水平。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，提供一种应用标准的抗体库免疫亲和筛选技 术、基因工程技术、化学突变技术相结合的方法制备谷胱甘肽人源含硒单链抗体 酶的方法，达到提高抗体酶活性、可直接应用于人体、简化步骤、缩短制备周期、 提高抗体酶产率的目的。
本发明的总体思路是，先筛选具有GPX底物结合部位的人源单链抗体，通 过测序确定其氨基酸序列，然后将编码该氨基酸序列的人源单链抗体基因组装到 原核或真核分泌型表达载体上，转化大肠杆菌或酵母细胞，表达可溶性单链抗体 蛋白，再用化学突变法将GPX的催化基团引入到单链抗体的底物结合部位；或 用基因突变技术和营养缺陷型大肠杆菌直接表达在底物结合部位含有GPX催化 基团的可溶性单链抗体蛋白。因而在该单链抗体上既有GPX的底物结合部位， 又有催化基团，结果赋予该单链抗体高的GPX的催化活性，就产生了高活力的 人源含硒单链抗体酶。
具体制备方法是，利用噬菌体抗体展示技术，以谷胱甘肽衍生物为靶抗原， 通过免疫亲和筛选法对重组噬菌体展示人单链抗体库进行筛选。分离并扩增 GSH特异性单链抗体基因。将上述基因组装到分泌型原核或真核表达载体上， 转化大肠杆菌或酵母细胞，在原核或真核中大量表达并纯化单链抗体蛋白。用苯 甲基磺酰氟活化单链抗体中的丝氨酸(Ser)残基上的羟基，再用硒氢化钠处理， 则将Ser突变成SeCys，结果在抗体的底物结合部位引入GPX的催化基团SeCys， 赋予抗体以GPX的催化活性；或用基因突变技术和营养缺陷型大肠杆菌直接表达在底物结合部位含有GPX催化基团的可溶性单链抗体蛋白，赋予抗体以GPX 的催化活性。
本发明以谷胱甘肽衍生物为靶抗原，通过免疫亲和筛选法对重组噬菌体展示 人单链抗体库进行筛选。得到的用于制备人源含硒单链抗体酶的人源单链抗体， 由15个氨基酸组成的短肽连接，氨基酸序列包括免疫球蛋白的轻链和重链可变 区；具体的单链抗体B3和单链抗体D8的氨基酸序列分别是，
B3的氨基酸序列
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GS200SSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGHPSVFGGGTKLTVLG245;
D8的氨基酸序列
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制备可溶性人源含硒单链抗体酶的第一种方法分离扩增单链抗体基因，组 装到原核分泌型表达载体上，转化大肠杆菌，表达可溶性单链抗体蛋白，再用化 学突变法将GPX的催化基团引入到单链抗体的底物结合部位。具体过程如下。
一种可溶性人源含硒单链抗体酶的制备方法，有人单链抗体的筛选，可溶性 单链抗体的表达与纯化、催化基团的引入的过程，
所述的人单链抗体的筛选，是按照已有技术(见专利96112628.0和 99104234.4)的方法合成系列半抗原-S-二硝基苯取代的谷胱甘肽二酯。以合成的 半抗原为靶抗原，通过标准的免疫亲和筛选法对重组噬菌体展示人单链抗体库进 行筛选，得到能与GSH及其衍生物结合的人源单链抗体B3或D8。
所述的可溶性单链抗体的表达与纯化，是在保持氨基酸序列不变的前提下， 根据筛选的单链抗体B3或D8的基因序列设计引物，以含有单链抗体基因的噬菌体单链DNA为模板，用引物和聚合酶链反应(PCR)扩增单链抗体基因。用 核酸内切酶切纯化的单链抗体基因和原核表达载体pPELB，通过酶切位点将单 链抗体基因组装到pPELB载体上。将含有单链抗体基因的原核表达载体转化大 肠杆菌感受态细胞，筛选阳性转化子，用异丙基-P-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱 导表达，单链抗体蛋白以可溶性形式分泌到菌体的周质腔里。收集菌体，低温下 超声破碎，离心去除菌体沉淀。用GSH亲和层析纯化单链抗体蛋白。透析冻干 后即得单链抗体蛋白纯品。经电泳检验为一条带，分子量为31000道尔顿。
所述的催化基团的引入，是用己公开的化学突变法(见专利99104234.4)将 GPX的催化基团SeCys引入到单链抗体的底物结合部位。即用苯甲基磺酰氟活 化单链抗体中的丝氨酸(Ser)残基上的羟基，再用硒氢化钠处理，则将Ser突 变成SeCys。由于GSH是GPX的底物,SeCys是GPX的催化基团，因而在该单 链抗体上既有GPX的底物结合部位，又有催化基团，结果产生高活力的人源含 硒单链抗体酶。
催化基团引入的具体方法可以是0.4-1.5X 10—5mmoI/L单链抗体纯品溶于无 氧水中，加入2.0-6.0X 10'5mmol/L苯甲基磺酰氟，15-30 。C振荡l-3h。 通高纯 氮气约20min以排除体系内氧气。加入0.5-3.0Xl(T4mol/L硒氢化钠(NaHSe) 溶液，在氮气保护下30-40 'C反应25-40h。取出，开盖使其充分氧化。10000g 离心15min，上清液用SephadexG25除盐后冻干即得具有GPX活力的人源含硒 单链抗体酶，其GPX活力为1005-1321U/U mol，达到天然GPX的数量级水平。
在可溶性单链抗体的表达与纯化过程中，所述的引物，是5'端引物加入起 始密码子和NcoI酶切位点，3'端引物在终止密码子下游加入NotI酶切位点；或 抗 体 库 公 共 引 物 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3' 和 5'-GAATTTTCTGTATGAGG-3'。所述的核酸内切酶可以是Ncol和Notl。
所说的筛选阳性转化子，可以是将转化后产物涂布在2xTY固体培养基上 (含100tig/mL氨苄青霉素和34pg/mL氯霉素)，37'C培养过夜，挑选在平板上 生长良好的单克隆菌落，通过DNA测序再次确定含有单链抗体基因的阳性转化 子。
所说的诱导表达，可以是将阳性转化子接种于2ml2xTY液体培养基里(含 100 )ng/mL氨苄青霉素和34 ng/mL氯霉素)，37。C振荡培养至006()()为0.4-1.0。加入终浓度为0.5-1 mmol/L的IPTG， 30。C下诱导表达4-8 h。
所说的离心去除菌体沉淀，可以是将菌体破碎液在低温下，S000-12000g离 心15-30min，去除菌体沉淀、获得上清液。
制备可溶性人源含硒单链抗体酶的第二种方法分离扩增单链抗体基因，组 装到真核分泌型表达载体上，转化酵母细胞，表达可溶性单链抗体蛋白，再用化 学突变法将GPX的催化基团引入到单链抗体的底物结合部位。具体过程如下。
一种可溶性人源含硒单链抗体酶的制备方法，有人单链抗体的筛选，可溶性 单链抗体的表达与纯化，催化基团的引入的过程，
人单链抗体的筛选过程与第一种方法相同。
所述的可溶性单链抗体的表达与纯化，是在保持氨基酸序列不变的前提下， 根据筛选的单链抗体B3或D8的基因序列设计引物，5'端引物加入起始密码子 和EcoRI酶切位点，3'端引物在终止密码子下游加入NotI酶切位点；以含有阳 性单链抗体基因的噬菌体单链DNA为模板，用该引物和PCR扩增单链抗体基因， 用EcoRI和Notl酶切单链抗体基因和分泌型酵母表达载体PIC9K，通过 EcoRI/Notl酶切位点，将单链抗体基因组装到PIC9K上；用BglII单酶切，使含 有单链抗体基因的表达载体线性化，将含有单链抗体基因的载体转化毕赤酵母感
受态细胞，在甲醇诱导下，在毕赤酵母细胞中表达人源单链抗体蛋白；单链抗体 蛋白以可溶性形式表达并分泌到培养基里，收集培养上清，浓縮后，用谷胱甘肽 亲和层析纯化单链抗体蛋白，透析冻干后即得单链抗体蛋白纯品，再进行催化基 团的引入。
可溶性单链抗体表达与纯化过程的细致步骤可以是在保持氨基酸序列不变 的前提下，根据单链抗体的基因序列设计引物。以含有单链抗体基因的噬菌体单 链DNA为模板，用引物和PCR技术扩增单链抗体基因。用琼脂糖凝胶电泳分离 单链抗体基因，用DNA胶回收试剂盒纯化单链抗体基因。用EcoRI和Notl酶切 纯化的单链抗体基因和分泌型酵母表达载体PIC9K，通过EcoRI/Notl酶切位点， 将单链抗体基因组装到PIC9K上。用BglII单酶切使含有单链抗体基因的表达载 体PIC9K线性化，转化毕赤酵母GS115感受态细胞，转化后的酵母细胞涂培养 平板，于3(TC培养箱倒置培养2-3天。从培养平板上挑取单克隆，通过DNA测 序确定含有单链抗体基因的阳性转化子。将阳性转化子接种于BMGY培养基中，30。C震荡培养，至OD600达2-6，室温离心(3000rpm) 5min，弃上清，用等体 积的BMMY培养基重悬细胞沉淀，3(TC震荡培养，用甲醇诱导表达。在诱导过 程中，每24h补充一次甲醇至终浓度0.5M，同时补充灭菌超纯水，使培养液总 体积保持不变。连续诱导培养7天，每24h取lml培养液，离心菌体，上清用于 SDS-PAGE蛋白分析，筛选阳性克隆的高表达菌株。取高表达菌株，扩大培养后 用适量甲醇诱导培养3天，单链抗体蛋白以可溶性形式表达并分泌到培养基里， 收集培养上清，经10k分子量超滤膜浓縮20倍，用GSH亲和层析纯化单链抗体 蛋白(用pH7.5， 50mmol/LTris-Cl平衡，用含10mmol/LGSH的该缓冲液洗脱 目的蛋白)。透析冻干后即得单链抗体蛋白纯品。经电泳检验为一条带，分子量 为31000道尔顿。
催化基团的引入的过程与第一种方法相同。
制备可溶性人源含硒单链抗体酶的第三种方法是通过基因突变法而不是化 学突变法引入催化基团。具体过程如下。
一种可溶性人源含硒单链抗体酶的制备方法，有人单链抗体的筛选，基因突 变法引入催化基团，抗体酶的表达与纯化的过程。
人单链抗体的筛选过程与第一种方法相同。
所述的基因突变法引入催化基团，是在保持氨基酸序列不变的前提下，根据 单链抗体的基因序列设计引物，以含有单链抗体基因的噬菌体单链DNA为模板， 用引物和PCR扩增单链抗体基因，用核酸内切酶切纯化的单链抗体基因和原核 表达载体pPELB，通过酶切位点将单链抗体基因组装到pPELB载体上。在保持 其它氨基酸序列不变的前提下，设计将Ser突变为半胱氨酸(Cys)的定点突变 引物，用定点突变引物和快速定点突变试剂盒(Invitrogen公司产品，按试剂盒 说明书操作)，将构建在原核表达载体上的单链抗体基因中的0-32个丝氨酸的编 码序列突变成Cys的密码子(TGC) (O个是指无Ser突变的情况下也具有GPX 的活性)。通过DNA测序确定突变成功，且无其它意外基因突变发生，结果通 过基因突变在单链抗体的底物结合部位引入了催化基团。
所述的抗体酶的表达与纯化，是将含有突变的单链抗体基因的载体转化营养 缺陷型菌株-BL21(DE3)CysE的感受态细胞，涂含Cys的营养琼脂平板，筛选阳 性转化子。将阳性转化子扩培养后，在含有SeCys和必需的生长因子和营养素的培养基里，经IPTG诱导，营养缺陷性菌株-BL21(DE3)CysE能用Cys的密码子 合成SeCys，最后直接表达出在GSH的底物结合部位含有SeCys的人源含硒单 链抗体酶，单链抗体酶以可溶性形式表达并分泌到菌体的周质腔里。收集菌体， 低温下超声破碎，离心去除菌体沉淀。用GSH亲和层析纯化单链抗体酶。透析 冻干后即得单链抗体酶纯品。经电泳检验为一条带，分子量为31000道尔顿。由 于GSH是GPX的底物，SeCys是GPX的催化基团，因而产生高活力的人源含硒 单链抗体酶。
在基因突变法引入催化基团过程中，所述的引物，可以是5'端引物加入起 始密码子和NcoI酶切位点，3'端引物在终止密码子下游加入NotI酶切位点；或 者是抗体库公共引物 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3' 和 5'-GAATTTTCTGTATGAGG-3'。所说的核酸内切酶可以是Ncol和Notl。
在基因突变法引入催化基团过程中，所述的定点突变引物，可以是根据要突 变为Cys的Ser的位置和它比邻的氨基酸的基因序列设计完全等长互补的两条定 点突变引物，弓l物长35-50bp，以Cys的密码子(TGC)为中心。
所说的离心去除菌体沉淀可以是将菌体破碎液在低温下，8000 -12000g离心 15-30min，去除菌体沉淀，获得上清液。
本发明还有第四种方法将单链抗体互补抗原决定区(CDR)的任何氨基酸 用基因突变或合成法进行链重组或替换为其它氨基酸，其它不变，也可用上述三 种方法制备单链抗体酶，使酶的活力提高。
本发明具有以下特点
(1) 本发明使用简单的抗体库筛选、基因工程和化学突变技术，制备方法简
单；
(2) 本发明方法制备的人源含硒单链抗体酶活力高，已达到天然GPX活力的 数量级水平，细胞生物学实验已证实对过氧化氢损伤的心肌细胞有防护作用；
(3) 本发明方法制备的人源含硒单链抗体酶，可以用于人体，不会引起免疫 反应，在生物制药方面有广阔的应用前景；
(4) 本发明使用的分泌型表达载体，能将单链抗体蛋白以可溶性形式表达并 分泌到大肠杆菌的周质腔或酵母的体外，引导蛋白分泌表达的前导信号肽由菌体 自动切除，所表达的蛋白为可溶性，具有天然蛋白的空间构象和活性，不需复性，可避免包涵体复性过程造成的产率下降和失活，因而生产周期短。
这些优点均有利于大规模生产，为今后的实际应用打下了坚实的基础，解决
天然GPX来源不足的问题。
具体实施例方式
实施例1:
用已有的技术(见专利99104234.4的实施例1)合成谷胱甘肽二丁酯，取 50yg的谷胱甘肽二丁酯，用二甲亚砜(DMSO)溶解后，包被在免疫平板上， 剩余位点用BSA封闭。以包被的谷胱甘肽二丁酯为靶抗原，用标准的免疫亲和 筛选法对噬菌体展示人单链抗体库进行5轮筛选，最后再用ELISA法进一步筛 选阳性克隆，得到与GSH亲和力较高的特异性单链抗体B3，测序确定全部基因 和氨基酸序列。
提取噬菌体DNA，以含单链抗体B3基因的噬菌体DNA作为模板，采用抗 体库公共引物(5 '-CAGGAAACAGCTATGAC-3 '和5 ' -GAATTTTCTGTATGAGG-3')做PCR扩增单链抗体B3基因。将PCR产物在 1.2 %琼脂糖凝胶上进行电泳，应用DNA胶回收试剂盒纯化扩增的单链抗体B3 基因。
将纯化后的B3基因用限制性内切酶Nco I和Not I双酶切后，连接到同样酶 切的载体pPELB载体上，将连接产物(pPELB-B3)转化大肠杆菌Rosetta (或 BL21)。将转化后产物涂布在2 x TY固体培养基上(含IOO ng/mL氨节青霉素 和34 pg/mL氯霉素)，37 'C培养过夜，挑选在平板上生长良好的单克隆菌落， 在2ml 2 x TY液体培养基上小量培养后，通过DNA测序确定含有单链抗体基因 的阳性转化子。将阳性转化子接种于2ml 2 x TY液体培养基里(含100 ng/mL 氨苄青霉素和34 pg/mL氯霉素)，37'C振荡培养至006()()为0.6。加入终浓度为1 mmol/L的IPTG， 3(TC下诱导表达4h。单链抗体蛋白以可溶性形式表达并分泌 到菌体的周质腔里，用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)筛选大量表达单 链抗体蛋白的高表达菌株。将高表达菌株接种到1 L 2 x TY培养基中(含100 pg/mL氨苄青霉素，34pg/mL氯霉素)，37。C振荡培养至OD600为0.6.加入终浓 度为1 mmol/L的IPTG (异丙基-P-D-硫代半乳糖苷)，30 'C下诱导表达4 h。 6000rpm离心10min，收集菌体并重悬在溶液中(300 mmol/L NaCl， 20 mmol/LTris， pH 7.4， 1 mmol/L苯甲基磺酰氟)，冰浴下超声破碎。将液体在4 °C， 8000
g离心15min，获得上清液。按说明书处理GSH亲合柱，应用缓冲液(50 mmol/L
Tris， pH7.5)平衡，将上清液加入GSH亲合柱上，用平衡缓冲液洗脱杂蛋白，用
10 mmol/L GSH洗脱目的蛋白。将洗脱液透析并冻干，即得人源单链抗体。经
电泳检验为一条带，分子量为31KD。
1.2X 10—5mmol/L单链抗体纯品溶于无氧水中，加入5.0X 10—5mmol/L苯甲基
磺酰氟，室温振荡3 h。通高纯氮气约20min以排除体系内氧气。加入2.0X
104inol/L硒氢化钠(NaHSe)溶液，在氮气保护下37 。C反应40 h。
取出，开
盖使其充分氧化，10000 g离心15min。上清液用SephadexG25除盐后冻干即得
人源含硒单链抗体酶，其GPX活力为1321u/!i mol，达到天然GPX的数量级水平。
实施例2:
按照专利99104234.4的方法合成半抗原-谷胱甘肽二丁酯，取50 u g的谷胱 甘肽二丁酯，用二甲亚砜(DMSO)溶解后，包被在免疫平板上，剩余位点用 BSA封闭。以包被的谷胱甘肽二丁酯为靶抗原，用标准的免疫亲和筛选法对噬 菌体展示人单链抗体库进行5轮筛选，最后再用ELISA法进一步筛选阳性克隆， 得到与GSH亲和力较高的特异性单链抗体B3，测序确定全部基因和氨基酸序列。
在保持氨基酸序列不变的前提下，根据单链抗体B3的基因序列设计引物(5 '-CGGAATTCATGGCCCGGGT-3'和5' -GTGCGGCCGCACCTAGGA-3' )，5 '端引物加入了起始密码子(ATG)和EcoRI酶切位点，3'端引物在终止密码 子下游加入了NotI酶切位点。提取噬菌体DNA，以含单链抗体B3基因的噬菌 体DNA作为模板，采用上述引物做PCR扩增单链抗体基因。将PCR产物在 1.2 %琼脂糖凝胶上进行电泳，应用DNA胶回收试剂盒纯化扩增的单链抗体基 因。
将纯化后的单链抗体基因用限制性内切酶EcoRI和Not I双酶切后，连接到 同样酶切的分泌型酵母表达载体PIC9K上。用BglII单酶切使含有单链抗体基因 的表达载体(PIC9K-B3)线性化，转化毕赤酵母GS115感受态细胞。转化后的酵 母细胞涂MD和MM培养平板，于3(TC培养箱倒置培养2 3天。能在MD和 MM上都生长的是甲醇利用快速型只能在MD上生长的是甲醇利用缓慢型。从MD和MM培养板上各挑取10个克隆，在2mlBMGY培养基中小量培养 后,进行DNA测序确定含有单链抗体基因的阳性转化子。将阳性转化子分别接种 于10ml BMGY培养基中，3(TC震荡培养(225 rpm) 24h，至OD600达2-6，室 温离心(3000 rpm) 5min，弃上清，用等体积(10ml)的BMMY培养基重悬细 胞沉淀，30'C震荡培养，诱导表达。在诱导过程中，每24h补充一次甲醇至终浓 度0.5%，同时补充灭菌超纯水，使培养液总体积保持不变。连续诱导培养7天， 每24h取lml培养液，离心菌体，上清用于SDS-PAGE蛋白分析，筛选高表达 菌株。取高表达菌株，在含1L培养液的5L摇瓶中诱导培养3天，收集培养液 上清，经10k分子量超滤膜浓縮20倍后。用GSH亲和层析柱纯化单链抗体(用 pH7.5，50 mmol/LTris-Cl平衡，用含10 mmol/L GSH的该缓冲液洗脱目的蛋白)。 收集有单链抗体的洗脱液，透析除盐，冻干即得人源单链抗体。经电泳检验为一 条带，分子量为31KD。
0.4X l(T5mmol/L单链抗体纯品溶于无氧水中，加入2.0X 10'5mmol/L苯甲基 磺酰氟，30'C振荡1.5h。通高纯氮气约20min以排除体系内氧气。加入0.5X 10^mol/L硒氢化钠(NaHSe)溶液，在氮气保护下40'C反应25 h.取出，开盖 使其充分氧化。10000 g离心15min.上清液用SephadexG25除盐后冻干即得人 源含硒单链抗体酶Sec -B3，其GPX活力为1235U/U mol，达到天然GPX的数 量级水平。
实施例3:
用已有的技术(见专利99104234.4的实施例1)合成谷胱甘肽二丁酯，取 50ug的谷胱甘肽二丁酯，用二甲亚砜(DMSO)溶解后，包被在免疫平板上， 剩余位点用BSA封闭。以包被的谷胱甘肽二丁酯为靶抗原，用标准的免疫亲和 筛选法对噬菌体展示人单链抗体库进行5轮筛选，最后再用ELISA法进一步筛 选阳性克隆，得到与GSH亲和力较高的特异性单链抗体B3，测序确定全部基因 和氨基酸序列。
提取噬菌体DNA，以含单链抗体B3基因的噬菌体DNA作为模板，采用抗 体库公共引物(5 '-CAGGAAACAGCTATGAC-3 '和5 ' -GAATTTTCTGTATGAGG-3')做PCR扩增单链抗体B3基因。将PCR产物在 1.2 %琼脂糖凝胶上进行电泳。应用DNA胶回收试剂盒纯化扩增的单链抗体B3基因。将纯化后的B3基因用限制性内切酶NcoI和Notl双酶切后，连接到同样 酶切的载体pPELB载体上。在保持其它氨基酸序列不变的前提下，根据63号丝 氨酸比邻的氨基酸的基因序列设计完全等长互补的两条定点突变引物，引物长 35-50bp，以Cys的密码子(TGC)为中心。用这两条完全互补的引物和快速定 点突变试剂盒(Invitrogen公司，按试剂盒说明书操作)，将构建在原核表达载 体pPelB上的单链抗体基因第63号丝氨酸的编码序列(TCA)突变成Cys的密 码子(TGC)，通过DNA测序确定突变成功，且无其它意外基因突变发生。
用装有突变的单链抗体基因的载体(pPelB-B3)转化营养缺陷型大肠杆菌 BL21 (DE3) CysE，涂含有Cys的营养琼脂平板，筛选阳性转化子。将阳性转 化子接种于1.2LM9表达培养基(在M9培养基中加入100yg/ml氨苄青霉素、 50 n g/ml卡那霉素、50 u g/ml Cys和除了 Cys之外的19种氨基酸各100 n g/ml) 中至OD600为0. 1 ，培养至0D600约为0. 3-1,加入终浓度0. 1-lmM的IPTG， 10min 后加入终浓度10ng/ml的氯霉素。加入氯霉素五分钟后培养液离心，低温 6000rpra离心5分钟，用冰浴的生理盐溶液洗两次，每次用1. 2L，然后用生产培 养基(在M9培养基中加入除了 Cys之外的19种氨基酸各50-400u g/ml)重悬， 并向培养基中补充终浓度400 ng的利福平和600 uM DL — SeCys。继续培养 2-12h，使单链抗体酶以可溶性形式表达在菌体的周质腔里。收集菌体(6000rpm， 10min)并用等体积的bufferT (50mM Tris buffer, pH7. 5，含lmM EDTA)洗涤 两次。用BufferT重悬菌体沉淀，加入终浓度lmM的PMSF (苯甲基磺酰氟)，超 声破碎菌体，4°C， 12000rpm离心30min，收集上清。按说明书处理GSH亲合柱， 应用缓冲液(50 mmol/L Tris， pH7.5)平衡，将上清液加入GSH亲合柱上，用 平衡缓冲液洗脱杂蛋白，用10 mmol/L GSH洗脱目的蛋白。将洗脱液透析并冻 干，即得人源单链抗体酶。经电泳检验为一条带，分子量为31KD。其GPX活力 为1289U/u mol，达到天然GPX的数量级水平。
实施例4:
以谷胱甘肽二异戊酯为靶抗原进行筛选，筛选方法与实施例1完全相同，得 到单链抗体D8。抗体的表达、纯化和催化基团的引入也与实施例1完全相同。 得人源含硒单链抗体酶Sec-D8，其GPX活力为1005U/n mol，达到天然GPX的数 量级水平。实施例5
以谷胱甘肽二异戊酯为靶抗原进行筛选，筛选方法与实施例1完全相同，得 到单链抗体D8。抗体的表达、纯化和催化基团的引入与实施例2完全相同，只 是基因扩增引物的设计要根据D8的基因序列决定。得人源含硒单链抗体酶 Sec-D8，其GPX活力为1098U/umol，达到天然GPX的数量级水平。
实施例6
以谷胱甘肽二异戊酯为靶抗原进行筛选，筛选方法与实施例1完全相同，得 到单链抗体D8。抗体的表达、纯化和催化基团的引入与实施例3完全相同，只 是基因突变引物的设计要根据D8要突变的具体Ser的位置和它比邻的基因序列 决定。得到人源含硒单链抗体酶Sec-D8，其GPX活力为1065U/ymo1，达到天然 GPX的数量级水平。
权利要求
1. 一种用于制备人源含硒单链抗体酶的人源单链抗体，其特征是，由15个氨基酸组成的短肽连接，氨基酸序列包括免疫球蛋白的轻链和重链可变区；人源单链抗体B3和人源单链抗体D8的氨基酸序列分别是，B3的氨基酸序列MAQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMHWVRQAPGQRLEWM50GWINAGNGNTKYS63QKFQGRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR100RGAYQNGPANWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGSALSSELTQDPAVSVAL150GQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGS200SSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGHPSVFGGGTKLTVLG245；D8的氨基酸序列MARVQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGYTLTYRYLHWVRQAPGQALEWM50GWITPFNGNANYAQKFQDRVTITRDRSMSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR100RGAYQNGPANWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGSALSSELTQDPAVSVAL150GQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGS200SSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHVFGGGTKLTVLG244。
2、 一种可溶性人源含硒单链抗体酶的制备方法，有人单链抗体的筛选，可 溶性单链抗体的表达与纯化，催化基团的引入的过程，其特征是，所述的人单链抗体的筛选，是以半抗原-S-二硝基苯取代的谷胱甘肽二酯为 靶抗原，通过免疫亲和筛选法对重组噬菌体展示人单链抗体库进行筛选，得到能 与谷胱甘肽及其衍生物结合的人源单链抗体B3或D8;所述的可溶性单链抗体的表达与纯化，是在保持氨基酸序列不变的前提下， 根据筛选获得的单链抗体B3或D8的基因序列设计引物；以含有单链抗体基因 的噬菌体单链DNA为模板，用引物和聚合酶链反应扩增单链抗体基因；用核酸 内切酶切单链抗体基因和分泌型原核表达载体pPELB，通过酶切位点将单链抗 体基因组装到pPELB载体上；将含有单链抗体基因的原核表达载体转化大肠杆 菌感受态细胞，筛选阳性转化子；用异丙基-P-D-硫代半乳糖苷诱导表达后，单 链抗体蛋白以可溶性形式分泌到菌体的周质腔里；收集菌体，低温下超声破碎， 离心去除菌体沉淀；用谷胱甘肽亲和层析纯化单链抗体蛋白，透析冻干后即得单 链抗体蛋白纯品；再进行催化基团的引入。
3、 按照权利要求2所述的可溶性人源含硒单链抗体酶的制备方法，其特征 是，所述的引物，是5'端引物加入起始密码子和Ncol酶切位点，3'端引物在 终止密码子下游加入Notl酶切位点；或者是5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'和 5'-GAATTTTCTGTATGAGG-3';所述的核酸内切酶是Ncol和Notl。
4、 一种可溶性人源含硒单链抗体酶的制备方法，有人单链抗体的筛选，可 溶性单链抗体的表达与纯化，催化基团的引入的过程，其特征是，所述的人单链抗体的筛选，是以半抗原-S-二硝基苯取代的谷胱甘肽二酯为 靶抗原，通过免疫亲和筛选法对重组噬菌体展示人单链抗体库进行筛选,得到能 与谷胱甘肽及其衍生物结合的人源单链抗体B3或D8;所述的可溶性单链抗体的表达与纯化，是在保持氨基酸序列不变的前提下， 根据筛选获得的单链抗体B3或D8的基因序列设计引物，5'端引物加入起始密 码子和EcoRI酶切位点，3'端引物在终止密码子下游加入NotI酶切位点；以含 有阳性单链抗体基因的噬菌体单链DNA为模板，用引物和聚合酶链反应扩增单 链抗体基因，用EcoRI和Notl酶切单链抗体基因和分泌型酵母表达载体PIC9K， 通过EcoRI/Notl酶切位点，将单链抗体基因组装到PIC9K上；用BglII单酶切， 使含有单链抗体基因的表达载体线性化，将含有单链抗体基因的载体转化毕赤酵 母感受态细胞，在甲醇诱导下，在毕赤酵母细胞中表达人源单链抗体蛋白，单链 抗体蛋白以可溶性形式表达并分泌到培养基里，收集培养上清，浓縮后，用谷胱 甘肽亲和层析纯化单链抗体蛋白，透析冻干后即得单链抗体蛋白纯品；再进行催 化基团的引入。
5、 一种可溶性人源含硒单链抗体酶的制备方法，有人单链抗体的筛选，基 因突变法引入催化基团，抗体酶的表达与纯化的过程，所述的人单链抗体基因的筛选，是以半抗原-S-二硝基苯取代的谷胱甘肽二 酯为靶抗原，通过免疫亲和筛选法对重组噬菌体展示人单链抗体库进行筛选，得 到能与谷胱甘肽及其衍生物结合的人源单链抗体B3或D8;所述的通过基因突变引入催化基团，是在保持氨基酸序列不变的前提下，根 据筛选获得的单链抗体B3或D8的基因序列设计引物；以含有单链抗体基因的 噬菌体单链DNA为模板，用引物和聚合酶链反应扩增单链抗体基因，用核酸内 切酶切单链抗体基因和分泌型原核表达载体pPELB,通过酶切位点将单链抗体基因组装到pPELB载体上；在保持其它氨基酸序列不变的前提下，设计将Ser 突变为Cys的定点突变引物，用定点突变引物和快速定点突变试剂盒将构建在原 核表达载体上的单链抗体基因中的0-32个丝氨酸的编码序列突变成Cys的密码 子，通过DNA测序确定突变成功，结果通过基因突变在单链抗体的底物结合部 位引入了催化基团；所述的抗体酶的表达与纯化，是将含有突变的单链抗体基因的载体转化营养 缺陷性菌株-BL21(DE3)CysE的感受态细胞，涂含Cys的营养琼脂平板，筛选阳 性转化子，将阳性转化子扩培养后，在含有SeCys和必需的生长因子和营养素的 培养基里，经异丙基-P-D-硫代半乳糖苷诱导，营养缺陷性菌株-BL21(DE3)CysE 能用Cys的密码子合成SeCys，最后直接表达出在谷胱甘肽的底物结合部位含有 SeCys的人源含硒单链抗体酶，单链抗体酶以可溶性形式表达并分泌到菌体的周 质腔里；收集菌体，低温下超声破碎，离心去除菌体沉淀，用谷胱甘肽亲和层析 纯化单链抗体酶，透析冻干后即得单链抗体酶纯品。
6、 按照权利要求5所述的可溶性人源含硒单链抗体酶的制备方法，其特征 是，所述的引物，是5'端引物加入起始密码子和Ncol酶切位点，3'端引物在 终止密码子下游加入Notl酶切位点；或者是5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3'和 5'-GAATTTTCTGTATGAGG-3';所述的核酸内切酶是Ncol和Notl。
7、 按照权利要求5或6所述的可溶性人源含硒单链抗体酶的制备方法，其 特征是，所述的定点突变引物，是根据要突变为Cys的Ser的位置和它比邻的氨 基酸的基因序列设计完全等长互补的两条定点突变引物，引物长35-50bp，以Cys 的密码子为中心。
全文摘要
本发明的可溶性人源含硒单链抗体酶的制备方法属于生物技术领域。以谷胱甘肽衍生物为靶抗原，通过免疫亲和筛选法对重组噬菌体展示人单链抗体库进行筛选，得到单链抗体B3和D8。将单链抗体基因组装到分泌型原核或真核表达载体上，转化大肠杆菌或酵母细胞，在原核或真核中表达并纯化单链抗体蛋白；用化学突变法在抗体的底物结合部位引入GPX的催化基团SeCys。或用基因突变技术和营养缺陷型大肠杆菌直接表达在底物结合部位含有GPX催化基团的可溶性单链抗体蛋白，赋予抗体以GPX的催化活性。本发明的制备方法简单；制备的人源含硒单链抗体酶活力高；所表达的蛋白为可溶性；有利于大规模生产，在生物制药方面有广阔的应用前景。
文档编号C12N15/81GK101280015SQ20081005055
公开日2008年10月8日 申请日期2008年4月1日 优先权日2008年4月1日
发明者刘慧娟, 徐俊杰, 唯 李, 李杰帅, 罗贵民, 罗际巡, 阎岗林, 锐 霍, 魏景艳 申请人:吉林大学