病毒基因表达的调节的制作方法

专利名称：病毒基因表达的调节的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用病毒基因的有义和反义RNA片段改变该基因在细胞、植物或动物中的表达的方法。重要的是，这些有义和反义RNA片段能够形成双链RNA分子。特别是，本发明涉及赋予细胞、植物或动物病毒抗性或耐受性的方法和组合物。优选地，本发明涉及赋予植物病毒抗性或耐受性的方法。本发明还优选地涉及用这些方法获得的植物细胞，由这些细胞产生的植物，这些植物的后代和这些植物产生的种子。在这些植物细胞或植物中，特定病毒基因表达的改变比利用本领域已知的现有方法获得的特定病毒基因表达的改变更有效、更有选择性且更有可预测性。
因此本发明提供 一种方法，包括向细胞中导入多种亚序列，例如RNA片段或DNA序列，其特征在于至少两种亚序列含有病毒RNA的有义和反义序列，并且能形成双链RNA分子。优选地，该方法包括向一种细胞中导入由多种亚序列组成的RNA，其特征在于至少两种亚序列含有病毒RNA的序列。优选地，该RNA含有至少一个位于3’末端亚序列上游的翻译终止密码子。在另一个实施方案中，该方法包括向一种细胞中导入编码该RNA表达的核苷酸序列或DNA分子。
因此本发明提供 一种方法，包括向细胞中导入病毒靶基因的有义RNA片段，和该靶基因的反义RNA片段，其中该有义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA分子，其中该靶基因在该细胞中的表达被改变。在一个优选实施方案中，靶基因含有一种病毒基因组或其部分，细胞优选地对病毒有抗性或耐受性。在一个优选实施方案中，所述病毒选自蕃茄斑萎病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、烟草花叶病毒、黄症病毒、黄瓜花叶病毒、雀麦花叶病毒、长线病毒、番茄丛矮病毒和真菌传棒状病毒。在另一个优选实施方案中，RNA片段含有来源于病毒外壳蛋白基因、病毒核壳蛋白基因、病毒复制酶基因、运动蛋白基因或其部分的核苷酸序列。在另一个优选实施方案中，细胞是一种植物细胞，如单子叶或双子叶植物细胞。在另一个优选实施方案中，RNA片段包含于两种不同的RNA分子中。在另一个优选实施方案中，RNA片段在被导入细胞中之前混合。在另一个优选实施方案中，RNA片段在被导入细胞中之前，在能使其形成双链RNA分子的条件下混合。在另一个优选实施方案中，这些RNA片段被顺序导入所述细胞中。在又另一个优选实施方案中，这些RNA片段包含于一种RNA分子中。在这种情况中，该RNA分子优选地能够折叠，使得其中包含的所述RNA片段形成双链RNA分子。
本发明还提供 一种方法，包括向一种细胞中导入能在该细胞中表达病毒靶基因的有义RNA片段的第一种DNA序列，和能在该细胞中表达该靶基因的反义RNA片段的第二种DNA序列，其中所述有义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA分子，其中该病毒靶基因在该细胞中的表达被改变。在一个优选实施方案中，靶基因含有一种病毒基因组或其部分，细胞优选地对病毒有抗性或耐受性。在一个优选实施方案中，所述病毒选自蕃茄斑萎病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、烟草花叶病毒、黄症病毒、黄瓜花叶病毒、雀麦花叶病毒、长线病毒、番茄丛矮病毒和真菌传棒状病毒。在另一个优选实施方案中，DNA片段含有来源于病毒外壳蛋白基因、病毒核壳蛋白基因、病毒复制酶基因、运动蛋白基因或其部分的核苷酸序列。在另一个优选实施方案中，细胞是一种植物细胞，如单子叶或双子叶植物细胞。在一个优选实施方案中，这些DNA序列稳定地整合于植物细胞的基因组中。在一个优选实施方案中，DNA分子还含有与所述第一种或第二种DNA序列有效连接的启动子。在另一个优选实施方案中，第一种DNA序列和第二种DNA序列包含于两种不同的即分别的DNA分子中。
另外，第一种DNA序列和第二种DNA序列也可包含于一种DNA分子中。在此情况中，第一种DNA序列和第二种DNA序列优选地包含于该DNA分子的同一DNA链中，意味着有义RNA片段和反义RNA片段包含于一个RNA分子中。优选地，该RNA分子能够折叠，使得其中包含的所述RNA片段形成双链区。这种RNA分子的例子包括SEQ IDNO13、SEQ ID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO25或SEQ ID NO28的反向重复序列。在另一个优选实施方案中，有义RNA片段和反义RNA片段包含于或者表达为两种RNA分子。在此情况中，第一种DNA序列和第二种DNA序列优选地与一种双向启动子有效连接，或者另外，第一种DNA序列与第一种启动子有效连接，而第二种DNA序列与第二种启动子有效连接，其中第一种启动子和第二种启动子是相同的启动子或不同的启动子。在另一个优选实施方案中，第一种DNA序列和第二种DNA序列包含于该DNA分子的互补链中。
在另一个优选实施方案中，在所述DNA分子中，第一种DNA序列是第二种DNA序列的互补DNA链。在此情况中，该DNA分子另外含有与所述第一种或第二种DNA序列有效连接的第一种启动子。在一个优选实施方案中，该DNA分子另外在第一种启动子与第一种或第二种DNA序列之间含有第一个位点特异性重组位点，在第一种DNA序列3’末端含有第二个位点特异性重组位点，其中第一个和第二个位点特异性重组位点能够在位点特异性重组酶的存在下，翻转位于第一个和第二个位点特异性重组位点之间的第一种或第二种DNA序列。在另一个优选实施方案中，由于这种翻转，第一种启动子能够表达第二种(或第一种，取决于哪种DNA序列与该启动子有效连接)DNA序列。植物细胞优选地另外含有一种能够识别所述位点特异性重组位点的位点特异性重组酶。
在另一个优选实施方案中，该DNA分子另外含有与所述第一种DNA序列有效连接的第一种启动子，和与第二种DNA序列有效连接的第二种启动子，其中第一种启动子和第二种启动子包括相同的启动子或不同的启动子。
在另一个优选实施方案中，DNA分子中的启动子包括该细胞的天然启动子。在另一个优选实施方案中，该启动子是异源启动子，例如组织特异性启动子、发育调节型启动子、组成型启动子或诱导型启动子。任选地，该启动子是一种能在启动子任一侧起始DNA序列转录的趋异(divergent)启动子或双向启动子。
在另一个优选实施方案中，DNA分子在编码有义和反义RNA片段的DNA序列之间含有一个接头。该接头包含，例如，含有功能基因(如选择性标记基因)或调节序列(如内含子加工信号)的表达盒。
本发明另外还提供 一种细胞，其含有本发明的有义和反义RNA片段，其中所述RNA片段改变了所述病毒靶基因在该细胞中的表达。在一个优选实施方案中，细胞对病毒有抗性或耐受性。在一个优选实施方案中，细胞是一种植物细胞，本发明进一步提供由该植物细胞产生的植物及其后代，和该植物产生的种子。
本发明还提供 含有本发明的DNA序列的DNA构建体。
在一个优选实施方案中，这种DNA构建体包含能在细胞中表达病毒基因组或其部分的有义RNA片段的第一种DNA序列，和能在该细胞中表达该病毒基因组或其部分的反义RNA片段的第二种DNA序列，其中所述有义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA分子。在另一个优选实施方案中，该病毒基因组或其部分在该细胞中的表达改变。在另一个优选实施方案中，该细胞中一种植物细胞。在另一个优选实施方案中，该病毒选自蕃茄斑萎病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、烟草花叶病毒、黄症病毒、黄瓜花叶病毒、雀麦花叶病毒、长线病毒、番茄丛矮病毒和真菌传棒状病毒。在另一个优选实施方案中，DNA序列含有来源于病毒外壳蛋白基因、病毒核壳蛋白基因、病毒复制酶基因、运动蛋白基因或其部分的核苷酸序列。在另一个优选实施方案中，DNA构建体进一步含有与所述第一种或第二种DNA序列有效连接的启动子。在另一个优选实施方案中，DNA构建体含有与所述第一种DNA序列有效连接的第一种启动子，和与第二种DNA序列有效连接的第二种启动子。在另一个优选实施方案中，DNA构建体还含有与第一种DNA序列和第二种DNA序列有效连接的双向启动子。
本发明还提供 一种DNA构建体，其包含 (a)能在细胞中表达靶基因的有义RNA片段的第一种DNA序列，和能在该细胞中表达该靶基因的反义RNA片段的第二种DNA序列，其中所述有义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA分子，其中在该DNA构建体中，第一种DNA序列是第二种DNA序列的互补链。
(b)一种与所述第一种或第二种DNA序列有效连接的启动子。
(c)在该启动子与第一种或第二种DNA序列之间的第一个位点特异性重组位点，和 (d)在第一种或第二种DNA序列3’末端的第二个位点特异性重组位点，其中第一个和第二个位点特异性重组位点能够在位点特异性重组酶的存在下，翻转位于第一个和第二个位点特异性重组位点之间的第一种或第二种DNA序列。
在一个优选实施方案中，该靶基因在该细胞中的表达被改变。
本发明还提供 一种DNA构建体，其包含 (a)能在细胞中表达靶基因的有义RNA片段的第一种DNA序列，和能在该细胞中表达该靶基因的反义RNA片段的第二种DNA序列，其中所述有义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA分子，其中在该DNA构建体中，第一种DNA序列是第二种DNA序列的互补链。
(b)与第一种DNA序列有效连接的第一种启动子。
(c)与第二种DNA序列有效连接的第二种启动子。
在一个优选实施方案中，该靶基因在该细胞中的表达被改变。
“双链RNA(dsRNA)”分子包含靶基因的有义RNA片段和同一靶基因的反义RNA片段，两者都含有彼此互补的核苷酸序列，从而使得有义和反义RNA片段配对，形成双链RNA分子。
“互补的”是指含有反平行核苷酸序列的两种核苷酸序列，它们能在反平行核苷酸序列的互补碱基残基之间形成氢键后彼此配对。
“反平行的”在此是指在互补碱基残基之间通过氢键配对的两种核苷酸序列，在一种核苷酸序列中磷酸二酯键为5’-3’方向，而在另一种核苷酸序列中为3’-5’方向。
“靶基因”是已知功能的任一病毒基因，或者是功能未知但全部或部分核苷酸序列已知的基因。靶基因是该细胞的天然基因，或者是以前已经优选地通过遗传转化或病毒感染细胞而导入细胞中的异源基因。优选地，靶基因是植物细胞中的一种基因。
“天然”基因是指存在于未转化细胞的基因组中的基因。
“必需”基因是编码细胞生长或存活所必需的蛋白质如生物合成酶、受体、信号转导蛋白、结构基因产物或转运蛋白的基因。
“改变”靶基因在细胞中的表达意思是，在应用本发明的方法后，靶基因在细胞中的表达水平不同于其在应用该方法之前在细胞中的表达。改变基因表达优选地是指，靶基因在细胞中的表达降低，优选地强烈降低，更优选地基因的表达不可检测，使细胞或由其衍生的植物或动物产生敲除突变表型。
在本发明申请书中“分离的”是一种分离的核酸分子，其通过人工操作与其天然环境分离，因此不是一种天然产物。分离的核酸分子可能以纯化的形式存在，或者可能存在于非天然环境中，如转基因宿主细胞中。
在此使用时，“表达盒”意思是能引导特定核苷酸序列在合适的宿主细胞中表达的DNA序列，包含与目的核苷酸序列有效地连接的启动子，该核苷酸序列与终止信号有效地连接。它一般还包含核苷酸序列正确翻译所需的序列。编码区通常编码一种目的蛋白，但也可编码一种目的功能性RNA，例如有义或反义方向的反义RNA或非翻译RNA。含有目的核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意思是其至少一种成分对于至少另一种成分是异源的。表达盒也可是天然存在，但已经以可用于异源表达的重组形式获得的。然而一般而言表达盒对于宿主是异源的，即表达盒的特定DNA序列不在宿主细胞中天然存在，必须通过转化事件被导入宿主细胞或宿主细胞的祖先中。表达盒中核苷酸序列的表达可以受组成型启动子或诱导型启动子控制，该启动子只有在宿主细胞接触某种特定外部刺激物时才起始转录。对于多细胞生物，如植物，启动子也可能是对特定组织或器官或发育阶段特异的。
在此使用时，“异源的”意思是“不同自然来源的”，或者表示一种非自然状态。例如，如果用从来源于另一种生物尤其是另一个种的核酸序列转化宿主细胞，该核酸序列对于该宿主细胞是异源的，对于携带该核酸序列的该宿主细胞的后代也是异源的。类似地，异源是指来源于和插入相同自然、原始细胞型的核苷酸序列，但它以非自然状态存在，例如，不同拷贝数，或处于不同调节元件控制之下。
最广义地来说，当在此对核苷酸序列使用时，术语“基本上类似”意思是一种对应于参照核苷酸序列的核苷酸序列，其中相应的序列编码一种与参照核苷酸序列编码的多肽有基本上相同的结构和功能的多肽，例如，只发生不影响多肽功能的氨基酸改变。希望地，基本上类似的核苷酸序列编码参照核苷酸序列编码的多肽。基本上类似的核苷酸序列与参照核苷酸序列之间同一性的百分数(互补序列中的互补碱基数除以互补序列中的碱基总数)希望地为至少80％，更希望地为85％，优选地至少90％，更优选地至少95％，再更优选地至少99％。
“调节元件”是指参与引起核苷酸序列表达的序列。调节元件包含与目的核苷酸序列有效连接的启动子和终止信号。它们一般还包含该核苷酸序列适当翻译所需的序列。
“植物”指处于任何发育阶段的任何植物或植物的部分。其中也包括插条、细胞或组织培养物和种子。在本发明中使用时，术语“植物组织”包括但不限于，整个植物、植物细胞、植物器官、植物种子、原生质体、愈伤组织、细胞培养物和组织成结构和/或功能单位的任何植物细胞组。
“病毒抗性或耐受性”在此是指，抗性或耐受性细胞、植物或动物不是易感的，与敏感的细胞、植物或动物相比，具有降低的对一种或多种病毒的敏感性。例如，抗性或耐受性是指，病毒感染的普通症状缺如或降低，或病毒在细胞中的积累或复制被阻止或降低，或病毒的运动例如从细胞到细胞的运动被阻止或减少。
“病毒基因组或其部分的表达的改变”一般被理解为，病毒或其部分或成分如病毒的RNA、DNA或蛋白质在细胞中的积累、复制或运动受到影响。
本发明涉及调节即改变病毒基因在细胞、植物或动物中的表达的方法。调节基因在细胞、植物或动物中表达的常用方法缺乏可预测性，并且显示取决于根据所调节的基因的变化性。本方法解决了这些问题，并且为细胞、植物或动物中基因的可重复和有效调节作了准备。
其表达被调节的基因是病毒基因组或其部分。在一个优选实施方案中，细胞是一种真核细胞，更优选地是一种植物细胞，如单子叶或双子叶植物细胞，或一种动物细胞，如来自哺乳动物如人、牛、绵羊、猪、猫或犬，或来自禽类的细胞。
本发明利用病毒靶基因的有义RNA片段和反义RNA片段改变基因在细胞中的表达。在第一个实施方案中，本发明提供了一种方法，包括向细胞中导入靶基因的有义RNA片段，和该靶基因的反义RNA片段，其中有义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA分子，其中靶基因在所述细胞中的表达被改变。通过不同转化方法(如粒子轰击或PEG介导的转化或电穿孔)将RNA片段导入细胞中。在另一个优选实施方案中，使用其他技术，如RNA片段的显微注射。在一个优选实施方案中，这些RNA片段包含于两种不同的RNA分子中。在此情况中，RNA片段在被导入所述细胞之前混合，例如在能使其形成双链RNA分子的条件下混合。在另一个优选实施方案中，这些RNA片段被顺序导入所述细胞中。优选地，导入每种RNA分子的时间间隔很短，优选地不到1小时。在又另一个实施方案中，这些RNA片段包含于一种单一RNA分子中。利用一种RNA分子，两种互补的RNA片段紧密接近，引起配对，这是有利的。在这种情况中，RNA分子优选地能够折叠，使得其中包含的RNA片段形成双链区。在这种情况中，RNA片段的互补部分彼此识别，互相配对，形成双链RNA分子。在一个优选实施方案中，在导入细胞中之前，在能使其形成双链RNA分子的条件下温育RNA片段。在又另一个实施方案中，RNA分子在有义RNA片段和反义RNA片段之间含有一个接头。该接头优选地包含含有功能基因(如选择性标记基因)的表达盒所编码的RNA序列。在另一个实施方案中，接头包含调节序列编码的RNA序列，例如，含有内含子加工信号。
在另一个优选实施方案中，本发明提供一种改变病毒基因组表达的方法，包括向细胞中导入能在该细胞中表达该病毒基因组的有义RNA片段的第一种DNA序列，和能在该细胞中表达病毒基因组的反义RNA片段的第二种DNA序列，其中有义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA分子。在一个优选实施方案中，第一种DNA序列和第二种DNA序列稳定地整合于细胞的基因组中。在另一个优选实施方案中，DNA序列包含于两种不同的DNA分子中。在另一个优选实施方案中，DNA序列包含于一个DNA分子中。在这种情况中，该DNA分子优选地编码一种含有有义和反义RNA片段的单个RNA分子。利用一种单个RNA分子，两种互补的RNA片段紧密接近，引起配对，这是有利的。该DNA分子编码两种不同的RNA分子，例如一种含有有义RNA片段的RNA分子和一种含有反义RNA片段的RNA分子。单个RNA分子或两种不同的RNA分子优选地能够折叠，使得包含的RNA片段形成双链区。其中RNA片段的互补部分彼此识别，互相配对，形成双链RNA分子。
在一个实施方案中，一种DNA分子或两种不同DNA分子的每一种含有与该DNA序列有效连接的启动子。在一个优选实施方案中，该DNA序列中的启动子含有一种天然植物启动子或欲灭活的病毒基因的自然启动子，以确保双链RNA在相同组织中在发育的相同时间表达为病毒靶基因。在另一个实施方案中，启动子是一种异源启动子，例如组织特异性启动子、发育调节型启动子、组成型启动子或诱导型启动子。
在另一个实施方案中，DNA序列在编码两种互补RNA片段的DNA序列之间含有一种接头。该接头优选地包含含有功能基因(如选择性标记基因)的表达盒。在另一个实施方案中，该接头包含调节序列，例如包含内含子加工信号。
本发明的DNA分子通过本领域周知的和以下所述的方法转化细胞。本发明也提供了一种含有本发明的DNA序列的DNA构建体，含有这些DNA构建体的重组载体，和含有本发明的DNA序列的组合物。在本发明中，有义与反义RNA片段之间互补区的长度希望地至少15个核苷酸长，更希望地至少50个核苷酸长，优选地至少500bp长。优选地，互补区小于5kb，更优选地小于2kb。在一个具体实施方案中，有义与反义RNA片段之间的互补区含有靶基因的编码区。在另一个优选实施方案中，互补区含有靶基因的非翻译区(UTR)，例如5’UTR或3’UTR。在另一个优选实施方案中，编码本发明的有义或反义RNA片段的DNA序列来源于一种c-DNA分子，或含有将改变其表达的病毒靶基因的调节元件，如启动子或终止信号。
在另一个优选实施方案中，有义与反义RNA片段之间的互补区与表达被改变的基因的相应序列相同。在另一个优选实施方案中，有义与反义RNA片段之间的互补区基本上类似于表达被改变的基因的相应序列，并且仍能改变该基因的表达。在这种情况中，互补区与表达被改变的基因的相应序列希望地至少50％相同，更希望地至少70％相同，优选地至少90％相同，更优选地至少95％相同。因此，应用一个双链RNA分子可以改变一种基因或多种基因的表达，单个基因包含与双链RNA相同，或基本上类似于双链RNA的序列。
在另一个优选实施方案中，有义与反义RNA片段之间的互补区在有义和反义RNA片段之间不包含任何错配。在另一个优选实施方案中，有义与反义RNA片段之间的互补区在有义与反义RNA片段之间包含至少一个错配，两种RNA片段仍能配对，并形成双链RNA分子，从而改变了基因的表达。希望地，在互补区的有义与反义RNA片段之间有低于50％的错配，更希望地低于30％的错配，优选地低于20％的错配，更优选地低于10％的错配，再更优选地低于5％的错配。
病毒的抗性或耐受性 本发明产生具有病毒抗性或耐受性的细胞、动物或植物。用本发明防治的病毒包括但不限于dsDNA病毒、dsRNA病毒、正链和负链ssRNA病毒、双义RNA病毒和反转录病毒。优选防治的是植物病毒，如蕃茄斑萎病毒(例如，芜菁花叶病毒，缩写为TuMV；莴苣花叶病毒，缩写为LMV；西瓜花叶病毒II，缩写为WMVII；胡瓜黄化花叶病毒，缩写为ZYMV；马铃薯Y病毒，缩写为PVY；和木瓜环斑病毒，缩写为PRSV)、马铃薯X病毒、烟草花叶病毒(例如胡椒淡斑点病毒，缩写为PMMV，和番茄花叶病毒，缩写为ToMV)、黄症病毒(例如甜菜西方黄化病毒，缩写为BWYV，和甜菜淡黄病毒，缩写为BWYV)、黄瓜花叶病毒(例如黄瓜花叶病毒，缩写为CMV)、双粒病毒(例如番茄黄曲叶病毒，缩写为TYLCV)、花椰菜病毒(例如花椰菜花叶病毒，缩写为CaMV)、雀麦花叶病毒、长线病毒、番茄丛矮病毒和真菌传棒状病毒(例如甜菜坏死黄叶脉病毒，缩写为BNYVV)。能用本发明防治的其他类病毒在Zacomer等人(1995)普通病毒学杂志(Jorunal of GeneralVirology)，76231-247和Martelli(1992)植物病害(Plant Disease)，76436-441中有述。为实现病毒防治优选的病毒基因组的DNA序列对应于编码病毒外壳蛋白、病毒核壳蛋白、病毒复制酶、运动蛋白等的基因区。在WO 95/09920中叙述了用来控制病毒基因组表达的其他核苷酸序列。优选的DNA序列可包括不翻译为蛋白质的病毒基因组的部分，如5’或3’非翻译区。
优选地，本发明的方法导致对广谱病毒的抗性或耐受性。例如，本发明的方法导致对病毒基因组编码的病毒和相同病毒类、群或属的其他病毒的抗性或耐受性。此外，本发明的方法也导致对病毒基因组编码的病毒和同一病毒的其他分离株的抗性或耐受性。本发明的方法也导致对病毒基因组编码的病毒和相同病毒群或属的其他病毒的抗性或耐受性，它们属于不同的种，优选地相关种，优选地存在这些病毒的种。任选地，使用一对以上，即至少两对能形成dsRNA的有义和反义RNA片段。这些对例如来源于同一病毒基因组，但来源于同一病毒基因组的不同部分。此外，这些对也可来源于不同的病毒基因组。因此，用本发明能获得对不同病毒类、群或属的抗性或耐受性。
具有病毒抗性或耐受性的植物细胞和它衍生的植物优选地是双子叶植物。本发明公开了在甜菜和芸苔中提供真菌传棒状病毒(参见，例如，Rush和Heidel(1995)植物病害79868-875)抗性或耐受性的方法，并在实施例9中对BNYVV——甜菜rhizomania(crazy root)的病因——更详细描述。提供对“黄化病毒”(参见，例如，《CRC甜菜病害手册》，第二卷，35-52页)如分别感染甜菜和油菜的BMYV和甜菜西方黄化病毒(BWYV)的抗性和耐受性的方法在实施例8中详述。本发明的方法也赋予单子叶植物耐受性和抗性。例如，利用本发明和美国专利5,569,828所述，获得对玉米褪绿矮缩病毒的耐受性或抗性。类似地，利用本发明和美国专利5,428,144所述，获得对玉米矮缩花叶病毒的耐受性或抗性。
植物转化技术 利用常规重组DNA技术将本发明的DNA分子掺入植物或细菌细胞中。通常，本发明的DNA分子包含于一种转化载体中。可使用大量的这些本领域所知的载体系统，如质粒、噬菌体病毒及其他修饰的病毒。表达系统的成分也可被修饰，例如，用于增强有义和反义RNA片段的表达。例如，可使用截短序列、核苷酸置换或其他修饰。本领域所知的表达系统可用来在适当条件下实际转化任何作物植物细胞。包含本发明的DNA分子的转基因优选地稳定转化到并整合到宿主细胞基因组中。在另一个优选实施方案中，包含本发明的DNA分子的转基因位于自主复制载体中。自主复制载体的实例是病毒，特别是双生病毒。转化细胞优选地再生为整个植物。
按照本发明转化的植物可以是单子叶植物或双子叶植物，包括但不限于玉米、小麦、大麦、黑麦、甘薯、菜豆、豌豆、菊苣、莴苣、洋白菜、花椰菜、硬花球花椰菜、萝卜、小萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、胡椒、芹菜、笋瓜、南瓜、大麻、夏季南瓜、苹果、梨、温柏、甜瓜、李子、樱桃、桃、油桃、杏、草莓、葡萄、木莓、黑莓、菠萝、鳄梨、木瓜、芒果、香蕉、大豆、番茄、高粱、甘蔗、甜菜、向日葵、油籽油菜、三叶草、烟草、胡萝卜、棉花、苜蓿、稻、马铃薯、茄子、黄瓜、拟南芥，和木本植物如松柏类和落叶类树。希望的核苷酸序列转化特定植物种后，可以用传统培育技术在该种中繁殖或转移到相同种的其他品种中，特别包括商业品种。
A.构建植物表达盒的要求 首先在表达盒中在可在植物中表达的适当启动子之后装配欲在转基因植物中表达的基因序列。这些表达盒也可包含转基因表达所需或选择的其他任何序列。这些序列包括但不限于，例如，转录终止子、增强表达的外部序列，如内含子、关键序列和用于将基因产物导向特定细胞器和细胞区室的序列。然后可将这些表达盒容易地转移至上述植物转化载体中。下面是典型表达盒的不同成分的描述。
1.启动子 在表达盒中使用的启动子的选择决定了转基因植物中转基因的空间和时间表达模式。选择的启动子将在特定的细胞型(如叶表皮细胞、叶肉细胞、根皮细胞)或在特定组织或器官(如根、叶或花)中表达转基因，此选择将反映基因产物积累的希望的位置。另外，所选的启动子可在多种诱导条件下引导基因表达。启动子在其强度即促进转录的能力方面不同。根据使用的宿主细胞系统，可使用本领域所知的多种合适启动子中的任一种。例如，对于组成型表达，使用CaMV 35S启动子、稻肌动蛋白启动子或遍在蛋白启动子。例如，对于调节型表达，使用来源于烟草或拟南芥的化学诱导型PR-1启动子(见，例如，美国专利号5,689,044)。
一类优选的启动子是创伤诱导型启动子。曾经描述了可在创伤部位表达的多种启动子。这类优选的启动子包括Stanford等人，分子普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)215200-208(1989)、Xu等人，植物分子生物学(Plant Molec.Biol.)22573-588(1993)、Logemann等人，植物细胞(Plant Cell)1151-158(1989)、Rohrmeier和Lehle，植物分子生物学22783-792(1993)、Firek等人，植物分子生物学22129-142(1993)和Warner等人，植物杂志(Plant J.)3191-201(1993)所述的启动子。
优选的组织特异表达模式包括绿色组织特异、根特异、茎特异及花特异模式。适于在绿色组织中表达的启动子包括调节参与光合作用的基因的多种启动子，和已从单子叶植物和双子叶植物中克隆的多种这类启动子。一种优选的启动子是玉米磷酸烯醇羧化酶基因PEPC启动子(Hudspeth和Grula，植物分子生物学12579-589(1989))。用于根特异表达的一种优选启动子是de Framond(FEBS 290103-106(1991)；EP 0 452 269)所述的启动子，另一种优选的根特异启动子是本发明所述的来自于T-1基因的启动子。一种优选的茎特异启动子是美国专利5,625,136所述、能引导玉米trpA基因表达的启动子。
本发明的优选实施方案是以根特异方式表达核苷酸序列的转基因植物。其他的优选实施方案是以创伤诱导或病原体感染诱导方式表达核苷酸序列的转基因植物。
2.转录终止子 多种转录终止子均可在表达盒中使用。它们负责超出转基因之外的转录终止及其正确的聚腺苷酸化。合适的转录终止子是已知在植物中起作用的转录终止子，包括CaMV 35S终止子、tml终止子、胭脂氨酸合酶终止子和豌豆rbcS E9终止子。它们可用于单子叶及双子叶植物中。
3.增强或调节表达的序列 已发现许多序列能增强转录单位内的基因表达，这些序列可与本发明的基因结合使用而增强其在转基因植物中的表达。例如，多种内含子序列如玉米Adh1基因的内含子，显示能增强表达，尤其是在单子叶植物细胞中。另外，已知多种由病毒衍生的非翻译前导序列也可增强表达，且其在双子叶植物细胞中特别有效。
4.编码序列优化 通过改变用于在目的作物种中最佳表达的编码序列，可以遗传改造所选基因的编码序列。修饰编码序列以实现在特定作物种中最佳表达的方法是众所周知的(见，例如，Perlak等人，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)883324(1991)；Koziel等人，生物技术(Bio/technol.)11194(1993))。
在另一个优选实施方案中，本发明的DNA分子被直接转化到质体基因组中。质体转化技术在美国专利号5,451,513、5,545,817和5,545,818中，在PCT申请号WO 95/16783中，和McBride等人(1994)美国国家科学院院报91，7301-7305中有广泛描述。叶绿体转化的基本技术包括，例如使用biolistics或原生质体转化(如氯化钙或PEG介导的转化)，将侧翼为选择性标记的克隆的质体DNA区与目的基因一起导入合适的靶组织中。1-1.5kb的侧翼区，称为导向序列，可促进与质体基因组的同源重组，从而允许原质体系特定区域的替换或修饰。最初，叶绿体16SrRNA和赋予壮观霉素和/或链霉素抗性的rps12基因中的点突变被用作转化的选择性标记(Svab，Z.，Hajdukiewicz，P.和Maliga，P.(1990)美国国家科学院院报87，8526-8530；Staub，J.M.和Maliga，P.(1992)植物细胞4，39-45)。这些标记间存在克隆位点使得能产生用于导入外源DNA分子的质体导向载体(Staub，J.M.和Maliga，P.(1993)EMBOJ.12，601-606)。通过将隐性rRNA或r-蛋白抗生素抗性基因替换为一种显性选择标记——编码壮观霉素解毒酶氨基糖苷-3′-腺苷转移酶的细菌aadA基因，可获得转化率的大大提高(Svab，Z.和Maliga，P.(1993)美国国家科学院院报90，913-917)。以前，该标记已成功用于绿藻莱因哈德衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)质体基因组的高频转化(Goldschmidt-Clermont，M.(1991)核酸研究(Nucl.Acids Res.)194083-4089)。用于质体转化的其他选择性标记在本领域中公知，并包括于本发明的范围之中。
质体表达，其中通过同源重组将基因插入每个植物细胞存在的几千个拷贝的环形质体基因组中。在一个优选实施方案中，本发明的DNA插入质体导向载体中或转化到希望的植物宿主的质体基因组中。获得对含有本发明的DNA分子的质体基因组来说同质的植物，它们优先地能高表达该DNA分子。优选地，该DNA分子编码的有义和反义RNA片段能够配对，并能在植物质体中形成双链RNA分子，从而改变质体基因的表达。在一个优选实施方案中，有义和反义片段在互补区中不包含任何错配。在另一个优选实施方案中，有义和反义片段在互补区中包含至少一个错配。在该情况中，编码RNA片段的DNA分子的DNA序列不能互相重组。
B.植物转化载体的构建 可用于植物转化的多种转化载体为植物转化领域的技术人员所公知，并且与本发明有关的基因可与任何这些载体结合使用。载体的选择取决于优选的转化技术和用于转化的目标种。对于某些目标物种，优选不同的抗生素或除草剂选择标记。转化中常规使用的选择标记包括赋予卡那霉素及相关抗生素抗性的nptII基因(Messing和Vierra，基因(Gene)19259-268(1982)；Benvan等人，自然(Nature)304184-187(1983))、赋予除草剂膦丝菌素抗性的bar基因(White等人，核酸研究181062(1990)，Spencer等人，理论与应用遗传学(Theor.Appl.Genet.)79625-631(1990))、赋予抗生素潮霉素抗性的hph基因(Blochinger和Diggelmann，分子细胞生物学42929-2931)，和赋予氨甲喋呤抗性的dhfr基因(Bourouis等人，EMBO J.2(7)1099-1104(1983))，和赋予草甘膦抗性的EPSPS基因(美国专利号4,940,935和5,188,642)。
1.适用于农杆菌(Agrobacterium)转化的载体 许多载体可用于应用根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的转化。它们一般带有至少一个T-DNA边界序列，并且包括如pBIN19(Bevan，核酸研究(1984))和pXYZ的载体。适用于农杆菌转化的典型载体包括二元载体pCIB200和pCIB2001，以及二元载体pCIB10及其潮霉素选择衍生物。(见，例如，美国专利号5,639,949)。
2.适用于非农杆菌转化的载体 不使用根瘤农杆菌的转化避免了对所选的转化载体中T-DNA序列的需要，所以除上述包含T-DNA序列的载体外，也可应用缺少这些序列的载体。不依赖于农杆菌的转化技术包括通过粒子轰击、原生质体摄取(如PEG和电穿孔)和显微注射的转化。载体的选择主要取决于待转化的物种的优选。适用于非农杆菌转化的典型载体包括pCIB3064、pSOG19和pSOG35(见，例如，美国专利号5,639,949)。
C.转化技术 目的DNA序列被克隆到表达系统中后，即转化植物细胞。植物转化和再生的方法在本领域中众所周知。例如，Ti质粒载体已用于外源DNA的送递，以及直接DNA摄取、脂质体、电穿孔、显微注射和微粒轰击。另外，也可用农杆菌属的细胞转化植物细胞。
用于双子叶植物的转化技术在本领域中众所周知，包括基于农杆菌的技术和不需要农杆菌的技术。非农杆菌的技术包括原生质体或细胞对外源遗传物质的直接摄取。这可通过PEG或电穿孔介导的摄取、粒子轰击介导的送递、或显微注射来完成。在所有情况中，都用本领域公知的标准技术使转化的细胞再生为整个植物。大多数单子叶植物种的转化现也已成为常规。优选的技术包括使用PEG或电穿孔技术向原生质体中直接转移基因，对愈伤组织的粒子轰击，以及农杆菌介导的转化。
将参照下列详细实施例进一步描述本发明。提供这些实施例只是为了说明目的，除非另外指明而不意在限制。
实施例 在此使用的标准重组DNA和分子克隆技术在本领域中公知，并由Sambrook等人的《分子克隆》，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY(1989)，和T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist的《基因融合实验》，冷泉港实验室，冷泉港，NY(1984)，和Ausubel，F.M.等人的《现代分子生物学方法》，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience出版(1987)描述。
实施例1萤光素酶基因表达的调节 编码萤光素酶RNA双链体的嵌合DNA分子的构建 使用寡核苷酸引物ds_Luc1(5’-CGC GGA TCC TGG AAG ACGCCA AAA ACA-3’，SEQ ID NO1；BamHI限制位点以下划线标出)和ds_Luc2(5’-CGG AAG CTT AGG CTC GCC TAA TCG CAG TATCCG GAA TG-3’，SEQ ID NO2；HindIII限制位点以下划线标出)，从pPH108质粒DNA中扩增来源于质粒pLuc+(Promega)的萤火虫萤光素酶基因的738bp“有义”方向片段。按照使用手册在50μl反应体积中使用TurboPfu热稳定DNA聚合酶(Stratagene)，95℃/1分钟、55℃/1.5分钟、72℃/2分钟5个循环，随后95℃/1分钟、72℃/3.5分钟25个循环。用类似的方法，使用寡核苷酸引物ds_Luc3(5’-CGG TCT AGAGGA AGA CGC CAA AAA CAT A-3’，SEQ ID NO3；XbaI限制位点以下划线标出)和ds_Luc2(5’-CGG AAG CTT AGG CTC GCC TAATCG CAG TAT CCG GAA TG-3’，SEQ ID NO4；HindIII限制位点以下划线标出)，从pPH108质粒DNA中PCR扩增来源于质粒pLuc+的萤火虫萤光素酶基因的737bp“反义”方向片段。通过由低熔点琼脂糖(FMC)制备的1％Tris-乙酸盐凝胶电泳，随后酚-氯仿抽提切下的含有PCR产物的凝胶片，纯化得到的DNA片段。按照标准方法，用BamHI和HindIII消化有义产物(ds_Luc1/2)的DNA，用XbaI和HindIII消化反义产物(ds_Luc3/2)的DNA(限制酶从New England Biolabs获得)。得到的粘末端DNA片段如上所述凝胶纯化。通过用BamHI和HincII消化质粒CSA104并纯化564bp DNA片段，获得含有mas 1’启动子的DNA片段(Velten等人(1984)EMBO J.32723-2730)。该片段再用BamHI消化，分离并凝胶纯化含有mas 1’启动子的484bp EcoRI-BamHI亚片段。为了构建质粒pPH169，用EcoRI和XbaI消化克隆载体pLitmus29(New England Biolabs)的DNA，并以四路反应用T4DNA连接酶(New England Biolabs)将分离的片段与mas 1’启动子EcoRI-BamHI片段和有义(BamHI-HindIII)及反义(HindIII-XbaI)ds_Luc萤光素酶基因片段连接。
为了构建二元载体pPH170，以用于应用ds_Luc1/2/3双链构建体的农杆菌介导的植物转化，用EcoRI和XbaI消化带有用于细菌筛选的卡那霉素抗性基因和用于转基因植物筛选的潮霉素抗性基因的二元质粒pSGCHC1的DNA。以四路反应用T4DNA连接酶(New EnglandBiolabs)将得到的自pSGCHC1分离的11.6kb片段与mas 1’启动子EcoRI-BamHI片段和有义(BamHI-HindIII)及反义(HindIII-XbaI)ds_Luc萤光素酶基因片段连接。
农杆菌的转化和拟南芥植物的真空渗入 通过电穿孔将质粒pPH170导入根瘤农杆菌GV3101中，筛选并扩增转化的菌落。用带有pPH170二元T-DNA载体的农杆菌克隆真空渗入组成型(UBQ3启动子(Norris等人(1993)PMB 21895-906)/UBQ3+CaMV 35S 5’UTR/luc+；pPH108)或诱导型(拟南芥PR-1启动子/luc+；pPH135，6E系)表达萤光素酶的四至五周龄拟南芥突变系植物。在潮霉素和卡那霉素上共筛选转化植物，并在控制的人工气候室条件下生长，以测定萤光素酶活性。另外，在BTH诱导48小时后(BTH处理基本如Lawton等人，植物杂志1071-82所述)，估测pPH135-6E背景的萤光素酶活性。在加入萤光素底物后，用基于发光的测定法定量组织提取物中的萤光素酶活性。也可用CCD-冷成像系统(Hamamatsu)监测植物中的萤光素酶活性。
实施例2拟南芥GL1基因表达的调节 GL1基因编码起始正常毛状体(叶毛)形成所需的myb样转录因子(Oppenheimer等人(1991)细胞67483-493)。发育早期GL1表达的敲除产生缺乏毛状体的植物。敲除表型在幼苗中易于鉴定，并且不是致死的。构建了用于组成型表达的三种载体和用于Gal4/C1调节表达的三种载体。检测每种启动子的三种不同载体是GL1基因片段的有义(+)表达、反义(-)表达和双链(+/-)RNA表达。(+)和(-)载体是用于比较其对GL1表达的影响的对照。在每种情况中，用GL1序列(GenBank保藏M79448)从碱基#739-#1781的5’片段进行载体构建。
Gal4C1调节的表达 将GL1基因片段作为NcoI-SacI片段克隆到杂交诱导型载体构建体pJG304-1中。质粒pJG304由pBSSK+衍生。质粒pBS SK+(Stratagene，LaJolla，CA)用SacI线性化，用绿豆核酸酶处理除去SacI位点，并用T4连接酶再连接形成pJG201。用KpnI从pAT71中除去10XGAL4共有结合位点/CaMV 35S最小启动子/GUS基因/CaMV终止子盒，并克隆到pJG201的KpnI位点，形成pJG304。质粒pJG304用限制性内切核酸酶Asp718部分消化，分离全长线性片段。该片段与摩尔过量的22碱基寡核苷酸JG-L(5’-GTA CCT CGA GTC TAG ACT CGA G-3’，SEQ ID NO4)连接。用限制性分析鉴定该接头插入GAL4 DNA结合位点5’的克隆，该质粒被命名为pJG304DXhoI。
通过合成5’端含有合适限制位点的PCR引物，向(+)和(-)片段的末端添加NcoI和SacI位点。通过首先产生以下两个片段来产生(+/-)GL1片段在5’端含有NcoI位点，在3’端含有HindIII位点的a(+)片段，在5’端含有HindIII位点，在3’端含有SacI位点的a(-)片段。通过在EcoRI位点处连接得到的片段产生双链单位。该表达单位含有Gal4 DNA结合域，随后是最小TATA序列，和方向为(+)、(-)或(+/-)的GL1基因片段。
组成型表达 使用在双子叶植物中相对较强且为组成型的农杆菌甘露氨酸合酶mas 1’启动子。如上所述，将GL1(+)、(-)和(+/-)片段连接在pBluescript中的1’启动子之后。三种不同的表达盒作为EcoRI/SalI片段连接于pCIB200中(Uknes等人(1993)植物细胞5159-169)。
实施例3胱硫醚β-裂合酶基因表达的调节 胱硫醚β-裂合酶(CBL)基因编码甲硫氨酸生物合成途径中的一个步骤。调节其在植物中的表达的作用用有义和反义构建体和双链RNA构建体检测。
反义构建体使用二元BASTA载体pJG261，其含有pJG304DXhoI载体的片段，并以反义方向插入CBL基因的部分(核苷酸#13-1159，GenBank保藏#L40511)。
有义构建体除了CBL片段为相反方向外，与反义构建体相同。该构建体含有ATG起始密码子和大多数CBL ORF，用作CBL基因表达调节的对照。
双链构建体将有义方向的CBL基因片段(#13-1159)插入载体pJG304-1中反义方向形式CBL基因下游的SalI位点。两个拷贝的CBL之间有一个大约10bp的接头。
实施例4植物表达盒构建的要求 准备在转基因植物中表达的基因序列首先装配在位于合适的启动子之后和合适的转录终止子上游的表达盒中。植物表达盒构建的所有要求适用于本发明的DNA分子，并可用本领域公知的技术进行。
启动子选择 在表达盒中使用的启动子的选择决定转基因植物中DNA分子的空间和时间表达模式。选择的启动子将在特定的细胞型(如叶表皮细胞、叶肉细胞、根皮细胞)或在特定组织或器官(如根、叶或花)中表达DNA分子，这种选择反映该DNA分子编码的RNA片段生物合成的希望的位置。另外，所选的启动子可引导DNA分子在光诱导型或其他时间调节启动子之下的表达。另一个选择是，选择的启动子是化学调节型的。这将提供仅当希望时和用化学诱导剂处理时才诱导DNA分子表达的可能性。
转录终止子 多种转录终止子均可在表达盒中使用。它们负责转录的终止，和优选地正确的聚腺苷酸化。合适的转录终止子是已知在植物中起作用的转录终止子，包括CaMV 35S终止子、tml终止子、胭脂氨酸合酶终止子、豌豆rbcS E9终止子。它们可用于单子叶植物和双子叶植物。
增强或调节表达的序列 已发现许多序列能增强转录单位内的基因表达，这些序列可与本发明的DNA分子结合使用以增强其在转基因植物中的表达。
多种内含子序列显示能增强表达，尤其在单子叶植物细胞中。例如，发现当被导入玉米细胞时，玉米Adh1基因的内含子显著增强位于同源启动子之下的野生型基因的表达。发现内含子1在与氯霉素乙酰转移酶基因的融合构建体中特别有效且增强表达(Callis等人，基因发育(GenesDevelep)11183-1200(1987))。在同一实验系统中，玉米bronze1基因的内含子具有类似的增强表达的作用(Callis等人，同上文)。内含子序列已被常规掺入植物转化载体，一般在非翻译前导区内。
已知来源于病毒的多种非翻译前导序列也可增强表达，它们在双子叶植物细胞中特别有效。具体而言，烟草花叶病毒(TMV，“Ω-序列”)、玉米萎黄病斑点病毒(MCMV)和苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列显示在增强表达方面有效(如Gallie等人，核酸研究158693-8711(1987)；Skuzeski等人，植物分子生物学1565-79(1990))。
实施例5表达盒构建的实例 本发明包括本发明的DNA分子在可在植物中表达的任何启动子调节下的表达，而不论该启动子的来源如何。因此，用本领域公知的技术将DNA分子插入任何表达盒中。然后可将这些表达盒容易地转移到以下所述的植物转化载体中。
此外，本发明还包括任何可植物表达的启动子与DNA分子表达所需或所选的其他任何序列的联合使用。这些序列包括但不限于转录终止子、增强表达的外来序列(如内含子[如Adh内含子1]、病毒序列[如TMV-Ω])。
组成型表达CaMV 35S启动子 质粒pCGN1761的构建如公开专利申请EP 0 392 225所述。pCGN1761含有“双”35S启动子和tml转录终止子，在启动子与终止子之间含有唯一的EcoRI位点，并且具有pUC型骨架。构建了pCGN1761的一种衍生物，它含有一个除已有的EcoRI位点外还包含NotI和XhoI位点的修饰过的多接头。该衍生物被命名为pCGN1761ENX。pCGN1761ENX可用于其多接头内cDNA序列或基因序列(包括微生物开放阅读框序列)的克隆，其目的是在35S启动子控制下在转基因植物中表达。该结构的完整的35S启动子-基因序列-tml终止子盒可切下启动子5’侧的HindIII、SphI、SalI和XbaI位点以及终止子3’侧的XbaI、BamHI和BglI位点，向转化载体转移。此外，通过用HindIII、SphI、SalI、XbaI或PstI进行5′切割，并用任何多接头限制位点(EcoRI、NotI或XhoI)进行3′切割，可切下双35S启动子片段，而替换为另一种启动子。
因此，本发明的DNA分子插入pCGN1761ENX中，用于在CaMV 35S启动子控制下组成型表达。
化学调节型启动子下的表达 本章节描述了用所选的任何启动子替换pCGN1761ENX中的双35S启动子；用实施例的形式描述了化学调节型PR-1a启动子。选择的启动子优选地用限制酶从其来源切下，但另外也可用带有合适的末端限制位点的引物进行PCR扩增。如果进行PCR扩增，则应在克隆靶载体中的扩增启动子之后，对启动子重新测序以检查扩增错误。从质粒pCIB1004(见EP 0 332 104)上切下化学调节型烟草PR-1a启动子，转移至质粒pCGN1761ENX。用NcoI酶切pCIB1004，得到的线性片段的3′突出端通过T4DNA聚合酶处理成为平端。然后用HindIII酶切该片段，凝胶纯化得到的包含PR-1a启动子的片段，并克隆至已去除双35S启动子的pCGN1761ENX中。实现方法是用XhoI酶切，用T4聚合酶产生平端，随后用HindIII酶切，并分离较大的其中克隆有pCIB1004启动子片段的含载体-终止子片段。这产生一种pCGN1761ENX衍生物，其含有PR-1a启动子和tml终止子以及一个具有唯一EcoRI和NotI位点的间插多接头。
向该载体中插入本发明的DNA分子，随后将融合产物(即启动子-基因-终止子)转移至选择的任何转化载体中，包括本申请所述的转化载体，从而引起DNA分子的化学诱导型表达。
组成型表达肌动蛋白启动子 已知肌动蛋白的几个同种型可在大多数细胞型中表达，因此肌动蛋白启动子是组成型启动子的一种良好选择。尤其是，稻Act1基因的启动子已被克隆和表征(McElroy等人，植物细胞2163-171(1990))。发现该启动子的1.3kb片段含有在水稻原生质体中表达所需的所有调节元件。此外，已构建了多种基于Act1启动子的表达载体，特别用于单子叶植物(McElroy等人，分子普通遗传学231150-160(1991))。其中掺入了Act1-内含子1、Adhl 5′侧翼序列和(玉米乙醇脱氢酶基因的)Adh1-内含子1和CaMV 35S启动子的序列。显示最高表达的载体是35S和Act1内含子或Act1 5′侧翼序列和Act1内含子的融合体。McElroy等人(分子普通遗传学231150-160(1991))所述的启动子表达盒易于为了本发明DNA分子的表达而修饰，且特别适于在单子叶植物宿主中使用。例如，可从McElroy构建体中切下含启动子片段，用它来替换pCGN1761ENX中的双35S启动子，然后该载体可用于特定基因序列的插入。将这样构建的融合基因转移至合适的转化载体。在个别报道中，也发现含有第一种内含子的水稻Act1启动子可引导在培养的大麦细胞中的高表达(Chibbar等人，植物细胞报道(Plant Cell Rep.)12506-509(1993))。
将本发明的DNA分子插入该启动子下游，随后将融合产物(即启动子-基因-终止子)转移到选择的任何转化载体中，包括本申请书中所述的载体。
组成型表达遍在蛋白启动子 遍在蛋白是已知可在多种细胞型中积累的另一种基因产物，其启动子已从几个种中克隆，用于转基因植物(如向日葵-Binet等人，植物科学7987-94(1991)，玉米-Christensen等人，植物分子生物学12619-632(1989))。已在转基因单子叶系统中研究了玉米遍在蛋白，并且其序列和为单子叶植物转化构建的载体公开于专利公开文本EP 0342 926中。另外，Taylor等人(植物细胞报道12491-495(1993))描述了一种载体(pAHC25)，其包含玉米遍在蛋白启动子和第一种内含子，经微粒轰击导入时在多种单子叶植物细胞悬液中具有高活性。遍在蛋白启动子适于在转基因植物尤其单子叶植物中表达本发明的DNA分子。合适的载体是通过导入适当遍在蛋白启动子和/或内含子序列修饰的pAHC25衍生物或本申请所述的任何转化载体。
因此将本发明的DNA分子插入这类启动子中，融合产物(即启动子-基因-终止子)用于植物转化，引起DNA分子的组成型表达。
根特异的表达 本发明的DNA分子的一种优选表达模式是根表达。只在根组织中表达核苷酸序列具有只改变根中靶基因的表达而不同时改变叶和花组织及种子中的表达的优点。一种合适的根启动子是由de Framond(FEBS290103-106(1991))并在公开的专利申请EP 0 452 269中描述的启动子。该启动子被转移至合适的载体如pCGN1761ENX中，并向该载体中插入该DNA分子。随后将完整的启动子-基因-终止子盒转移至目的转化载体中。
创伤诱导型启动子 已描述了许多这类启动子(例如，Xu等人，植物分子生物学22573-588(1993)，Logemann等人，植物细胞1151-158(1989)，Rohrmeier和Lehle，植物分子生物学22783-792(1993)，Firek等人，植物分子生物学22129-142(1993)，Warner等人，植物杂志3191-201(1993))，且均都适用于本发明。Logemann等人(同上文)描述了双子叶植物马铃薯wun1基因的5′上游序列。Xu等人(同上文)证明双子叶植物马铃薯的创伤诱导型启动子(pin2)在单子叶植物水稻中有活性。此外，Rohrmeier和Lehle(同上文)描述了玉米Wipl cDNA的克隆，其为创伤诱导型，并可用来使用标准技术分离同源启动子。类似地，Firek等人(同上文)和Warner等人(同上文)描述了单子叶植物药用芦笋(Asparagus officinalis)的创伤诱导基因，它在局部创伤和病原体侵入部位表达。使用本领域公知的克隆技术，可将这些启动子转移至合适的载体中，与本发明的DNA分子融合，并用来在害虫侵害部位表达这些基因。
木髓偏好的表达 专利申请WO 93/07278描述了玉米trpA基因的分离，该基因优先在木髓细胞中表达。利用标准分子生物学技术，可将该启动子或其部分转移至如pCGN1761的载体中，可替换35S启动子，并用来以木髓偏好的方式引导本发明的DNA分子的表达。实际上，包含木髓偏好启动子或其部分的片段可被转移至任何载体中，并可为用于转基因植物而修饰。DNA分子的木髓偏好的表达通过向该载体中插入DNA分子而实现。
花粉特异的表达 专利申请WO 93/07278另外描述了在花粉细胞中表达的玉米钙依赖的蛋白激酶(CDPK)基因的分离。该基因序列和启动子从转录起点延伸可达1400bp。利用标准分子生物学技术，可将该启动子或其部分转移至如pCGN1761的载体中，替换35S启动子，并用来以花粉特异的方式引导本发明的DNA分子的表达。实际上，包含花粉特异的启动子或其部分的片段可被转移至任何载体中，并可为用于转基因植物而修饰。
叶特异的表达 Hudspeth和Grula(植物分子生物学12579-589(1989))描述了一种编码磷酸烯醇羧化酶(PEPC)的玉米基因。应用标准分子生物学技术，该基因的启动子可用来以叶特异的方式引导本发明的DNA分子在转基因植物中的表达。
实施例6植物转化载体的构建 许多转化载体可用于植物转化，本发明的DNA分子可插入上述任何表达盒中，使其能在适当条件下在希望的细胞中表达该DNA分子。然后将含核苷酸序列的表达盒掺入以下所述的任一合适的转化载体中。
所用载体的选择取决于优选的转化技术和将转化的目标物种。对于某些目标物种，优选不同的抗生素或除草剂选择标记。转化中常规使用的选择标记包括赋予卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因(Messing和Vierra，基因19259-268(1982)；Benvan等人，自然(Nature)304184-187(1983))、赋予除草剂膦丝菌素抗性的bar基因(White等人，核酸研究181062(1990)，Spencer等人，理论与应用遗传学79625-631(1990))、赋予抗生素潮霉素抗性的hph基因(Blochinger和Diggelmann，分子细胞生物学42929-2931)和赋予氨甲喋呤抗性的dhfr基因(Bourouis等人，EMBO J.2(7)1099-1104(1983))。
适于农杆菌转化的载体 许多载体可用于应用根瘤农杆菌的转化。它们一般具有至少一个T-DNA边界序列，并且包括如pBIN19(Bevan，核酸研究(1984))和pVietorHINK(SEQ ID NO5)的载体。以下描述了两种典型载体的构建。
pCIB200和pCIB2001的构建 二元载体pCIB200和pCIB2001用于构建农杆菌使用的重组载体，按以下方法构建。通过用NarI消化pTJS75(Schmidhauser和Helinski，细菌学杂志164446-455(1985))切下四环素抗性基因，随后插入一个来自pUC4K的带有NPTII的AccI片段(Messing和Vierra，基因19259-268(1982)；Bevan等人，自然304184-187(1983)；McBride等人，植物分子生物学14266-276(1990))，产生pTJS75kan。使XhoI接头与pCIB7的EcoRV片段连接，该片段包含左和右T-DNA边界、植物选择性nos/nptII嵌合基因和pUC多接头(Rothstein等人，基因53153-161(1987))，并将XhoI消化片段克隆入SalI消化的pTJS75kan中产生pCIB200(参见EP 0 332 104)。pCIB200含有下列单一多接头限制位点EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbaI和SalI。pCIB2001是pCIB200的衍生物，它是通过向多接头中插入其他限制位点而产生的。pCIB2001多接头的单一限制位点是EcoRI、SstI、KpnI、BglII、XbaI、SalI、MluI、BclI、AvrII、ApaI、HpaI和StuI。除包含这些单一限制位点外，pCIB2001还有植物和细菌卡那霉素的选择性、用于农杆菌介导的转化的左和右T-DNA边界、在大肠杆菌和其他宿主之间转移的RK2衍生的trfA功能，以及也源自RK2的OriT和OriV功能。pCIB2001多接头适用于含有其自身调节信号的植物表达盒的克隆。
优选地使用多接头，将含本发明的DNA分子的上述任一种植物表达盒插入pCIB2001中。
DCIB10及其潮霉素选择衍生物的构建 二元载体pCIB10含有编码植物中筛选所需卡那霉素抗性的基因、T-DNA右和左边界序列，并且掺入宽宿主范围的质粒pRK252的序列，使其在大肠杆菌和农杆菌中均可复制。其构建由Rothstein等人描述(基因53153-161(1987))。已构建了pCIB10的多种衍生物，其中掺入了Gritz等人(基因25179-188(1983))所述的潮霉素B磷酸转移酶基因。这些衍生物能使在仅有潮霉素(pCIB743)或同时有潮霉素和卡那霉素(pCIB715、pCIB717)时筛选转基因植物细胞。该载体用来转化含有本发明的DNA分子的表达盒。
适于非农杆菌转化的载体 不使用根瘤农杆菌的转化避免了对所选的转化载体中T-DNA序列的需要，所以除如上所述包含T-DNA序列的载体外，还可使用缺少这些序列的载体。不依赖于农杆菌的转化技术包括通过粒子轰击、原生质体摄取(如PEG和电穿孔)、显微注射的转化或花粉转化(美国专利5,629,183)。载体的选择主要取决于待转化种的优选。下面，描述了某些典型载体的构建。
pCIB3064的构建 pCIB3064是一种pUC衍生载体，适用于与除草剂basta(或膦丝菌素)筛选结合的直接基因转移技术。质粒pCIB246包含与大肠杆菌GUS基因有效地融合的CaMV 35S启动子和CaMV 35S转录终止子，在PCT公开申请WO 93/07278中有述。该载体的35S启动子在起始位点5′端包含两个ATG序列。用标准PCR技术突变这些位点以去除ATG，产生限制位点SspI和PvuII。新限制位点距唯一的SalI位点96bp和37bp，距实际起始位点101bp和42bp。产生的pCIB246的衍生物命名为pCIB3025。然后通过SalI和SacI消化从pCIB3025上切下GUS基因，使末端变为平端，并再连接，产生质粒pCIB3060。质粒pJIT82从John Innes Centre，Norwich获得，切下含有产绿色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)bar基因的400bp的SmaI片段，将其插入pCIB3060的HpaI位点(Thompson等人，EMBO J.62519-2523(1987))。这产生了pCIB3064，其含有位于CaMV 35S启动子和终止子控制下的用于除草剂筛选的bar基因、氨苄青霉素抗性基因(用于在大肠杆菌中筛选)和具有单一SphI、PstI、HindIII、BamHI位点的多接头。该载体适用于含有自身调节信号的植物表达盒的克隆，用来引导本发明的DNA分子的表达。
pSOG19和pSOG35的构建 pSOG35是一种应用大肠杆菌基因二氢叶酸还原酶(DHFR)作为选择性标记提供氨甲喋呤抗性的转化载体。用PCR扩增35S启动子(～800bp)、玉米Adh1基因的内含子6(～550bp)和pSOG10的18bp的GUS非翻译前导序列。也PCR扩增编码大肠杆菌二氢叶酸还原酶II型基因的250bp片段，将这两个PCR片段与包含pUC19载体骨架和胭脂氨酸合酶终止子的pBI221(Clontech)SacI-PstI片段装配。这些片段的装配产生pSOG19，它含有与内含子6序列、GUS前导序列、DHFR基因和胭脂氨酸合酶终止子融合的35S启动子。pSOG19中的GUS前导序列替换为玉米萎黄病斑点病毒(MCMV)的前导序列产生载体pSOG35。pSOG19和pSOG35携带氨苄青霉素抗性的pUC基因，并且具有可用于克隆外源序列尤其是本发明的DNA分子的HindIII、SphI、PstI和EcoRI位点。
实施例7叶绿体转化 转化载体 为了在植物质体中表达本发明的DNA分子，使用质体转化载体pPH143(WO 97/32011，实施例36)。将DNA分子插入pPH143中，从而替换PROTOX编码序列。该载体然后用于质体转化和根据壮观霉素抗性的转化子筛选。另外，将DNA分子插入pPH143中，使其替换aadH基因。在这种情况中，根据对PROTOX抑制剂的抗性筛选转化子。
叶绿体转化 每板七个，按1″环形排列于T琼脂培养基上，使烟草c.v.′Xanthi nc′的种子萌发，播种12-14天后，基本如所述(Svab，Z.和Maliga，P.(1993)PNAS 90，913-917)，用质粒pPH143和pPH145的DNA包被的1μm钨颗粒(M10，Biorad，Hercules，CA)轰击。将轰击的秧苗在T培养基上温育两天，之后切下叶子，远轴侧朝上置于亮光下(350-500μmol光子/m2/s)，置于含有500μg/ml壮观霉素二盐酸盐(Sigma，St.Louis，MO)的RMOP培养基平板上(Svab，Z.，Hajdukiewicz，P.和Maliga，P.(1990)PNAS 87，8526-8530)。轰击三至八周后在漂白叶下出现的抗性苗被亚克隆至相同的选择培养基上，使之形成愈伤组织，分离并亚克隆第二批苗。用Southern印迹标准技术(Sambrook等人(1989)《分子克隆实验室手册》，冷泉港实验室，冷泉港)评价独立亚克隆中转化的质体基因组拷贝的完全分离(同质体状态)。BamHI/EcoRI消化的总细胞DNA(MettIer，I.J.(1987)植物分子生物学报道5，346-349)在1％Tris-硼酸(TBE)琼脂糖凝胶上分离，转移至尼龙膜上(Amersham)，用32P-标记的随机引物DNA序列探查，该序列对应于pC8的0.7kb BamHI/HindIII DNA片段，包含一部分rps7/12质体导向序列。同质的苗在含壮观霉素的MS/IBA培养基(McBride，K.E.等人(1994)PNAS 91，7301-7305)上无菌生根，将其转移到温室中。
实施例8由RolC启动子引导的、编码BWYV外壳蛋白的有义和反义(双链)RNA片段的嵌合基因盒的构建 使用引物HiNK025bis(5’-CAA TTA CCA TGG ACA CGG TCGTGG-3’，SEQ ID NO6；NcoI限制位点以下划线标出)和HiNK226(5’-GCC AAA TGT TTG AAC GCT GCA GCC TAT TTG-3’；SEQ IDNO7；PstI限制位点以下划线标出)，从质粒pZU046中扩增甜菜西方黄化病毒(BWYV)的0.6kb“有义”方向片段，一种所谓的病毒黄化外壳蛋白(CP)基因。此外，使用引物HiNK025bis2(5’-AAT CGT CCATGG ATA CGG TCG TGG-3’，SEQ ID NO8；核苷酸3475-3498，NcoI限制位点以下划线标出)和HiNK226bis(5’-CTA GGG CCG GGT TCCTCT GCA GCC TAT TTG-3’；SEQ ID NO9；核苷酸4114-4085，PstI限制位点以下划线标出)，从质粒pBW17(Veidt等人，核酸研究169917-9932，1988；保藏号X13063)中扩增该片段。按照使用说明在50μl反应体积中使用Taq DNA聚合酶(Life Technologies)，94℃/30秒、55℃/30秒、72℃/90秒的30个循环(+2秒/循环)。通过由Seakem GTG琼脂糖(FMC)制备的1％ Tris-乙酸盐凝胶电泳，随后用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)抽提含有PCR产物的凝胶片，纯化得到的DNA片段。随后按照标准方法，用NcoI和PstI消化PCR产物(所有限制酶均从Life Technologies获得)，并再次凝胶纯化。用T4 DNA连接酶(Life Technologies)将纯化的片段连接到RolC启动子和Nos终止子之间。得到的克隆命名为pHiNK138。
以与上所述类似的方法，使用引物HiNK251(5’-CTC CCA GGTTGA GAC TGC CCT GCA GTG CCC A-3’，SEQ ID NO10；PstI限制位点以下划线标出)和HiNK228(5’-TTA CCA TGC ATA CGG TCGTGG GTA-3’；SEQ ID NO11；NsiI限制位点以下划线标出)，从质粒Pzu174A中，或使用引物HiNK251(核苷酸4844-4814)和HiNK228bis(5’-CGT TAA TGC ATA CGG TCG TGG GTA-3’；SEQ ID NO12；核苷酸3478-3503，NsiI限制位点以下划线标出)，从质粒pBW17中，扩增1.4kb“反义”方向BWYV CP片段。待凝胶纯化后，用NsiI和PstI消化PCR产物。4.9kb质粒pHiNK138用PstI线性化，并用热敏感的碱性磷酸酶(Life Technologies)去磷酸化。凝胶纯化这两种载体和PCR片段，随后双向连接PCR片段与pHiNK138。通过限制位点分析确定产生CP基因(SEQ ID NO13)双链RNA的方向，产生质粒pHiNK152，其中反向重复由0.6kb CP基因组成，该基因被CP基因下游的来源于BWYV基因组的0.7kb间隔序列分开，称为ORF6。该间隔序列为反向方向。最后，将所述基因盒转移到携带磷酸甘露糖异构酶作为选择标记基因的专利二元载体pVictorHiNK(WO 94/20627)中，产生pHiNK179。
实施例9.1由拟南芥Ubi3int启动子引导的，编码BNYVV复制酶基因的有义和反义(双链)RNA片段的嵌合基因盒的构建 用QIAGEN的RNAeasy Plant mini试剂盒从甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)感染的甜菜根中提取总RNA。为了扩增BNYVV复制酶基因的3’端(RNA1)，用SuperscriptTM II RNAse H-反转录酶(RT)(LifeTechnologies)和反向引物HiNK285(5’-TCG TAG AAG AGA ATT CACCCA AAC TAT CC-3’，SEQ ID NO14)反转录RNA，产生cDNA。引物HiNK285位于BNYVV RNA1序列(保藏号D00115)的核苷酸6378与6405之间，用来导入一个EcoRI位点。随后用RT反应作为模板用于两次PCR反应 -反应A使用位于BNYVV RNA1核苷酸5168bp与5178bp之间，用来引入一个BamHI位点的引物HiNK283(5’-AAG AAT TGCAGG ATC CAC AGG CTC GGT AC-3’，SEQ ID NO15)，和位于BNYVV RNA1核苷酸5597bp与5620之间，用来引入一个EcoRI位点的引物HiNK284(5’-TTC CAA CGA ATT CGG TCTCAG ACA-3’，SEQ ID NO16)。
-反应B使用引物HiNK283与引物HiNK285，均如上所述。这样获得的RT-PCR产物在组成将来的RNA双链体的核苷酸5168-5620之间具有BNYVV RNA1序列。未来的间隔序列对应于用引物HiNK283和HiNK285获得的RT-PCR产物中存在的BNYVV RNA1的核苷酸5621-6405bp。
按照使用说明在25μl反应体积中使用Taq DNA聚合酶(LifeTechnologies)，94℃/30秒、55℃/30秒、72℃/90秒的30个循环(+2秒/循环)。通过由Seakem GTG琼脂糖(FMC)制备的1％ Tris-乙酸盐凝胶电泳，随后用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN)抽提含有PCR产物的凝胶片，纯化得到的DNA片段。待凝胶纯化后，按照标准方法用限制酶BamHI和EcoRI(Life Technologies)消化RT-PCR产物，并如上所述纯化。
最后，使用T4DNA连接酶(Life Technologies)，利用三路连接反应，将RT-PCR产物克隆到拟南芥遍在蛋白3(Ubi3int)启动子与Nos终止子之间。得到的两个克隆被命名为pHiNK181(反义方向的间隔区，见SEQ ID NO17)和pHiNK184(有义方向的间隔区，见SEQ IDNO18)。
为了构建用于农杆菌介导的甜菜转化的二元载体，用AscI和PacI(New England Biolabs)消化含有磷酸甘露糖异构酶基因作为选择性标记(WO 94/20627)的二元载体pVictorHiNK以及质粒pHiNK181和pHiNK184的DNA，载体和插入片段如上所述通过电泳纯化。用T4DNA连接酶(Life Technologies)将得到的7.7kb pVictorHiNK载体片段与编码BNYVV复制酶基因双链RNA的基因盒连接，分别产生pHiNK187(反义间隔区)和pHiNK188(有义间隔区)。
实施例9.2农杆菌介导的甜菜转化 农杆菌介导转化植物物种的方法已经建立，并为本领域技术人员所公知，并可因外植体类型、农杆菌株或选择性标记和使用的再生系统而不同。以下的方法叙述了利用子叶作为外植体来源，用甘露糖-6-磷酸异构酶作为选择性标记基因对甜菜的农杆菌介导的转化(Joersbo等人，分子栽培(Molecular Breeding)4111-117，1998)。表面消毒后，甜菜籽在水琼脂上并在约12℃下在微光下萌芽。横向切割结节区以下，从幼苗中切下完全发育的子叶，并通过轻轻拉开切割切下子叶。通过将子叶外植体浸于含有适当转化载体的农杆菌株EHA101的悬液中接种子叶外植体，该悬液用补充有20g/l蔗糖、0.25mg/l BA、0.05mg/l NAA、500μM乙酰丁香酮的MS培养基pH5.2稀释，将光密度(OD600)由0.1稀释为0.3。经5分钟的温育后，从农杆菌悬液中取出外植体，在无菌滤纸上蘸一下，除去过量的接种悬液，转移到共培育平板中。共培育平板包括含有1/10MS培养基ph5.7、30g/l蔗糖、200μM乙酰丁香酮的平皿，用4.7g/l琼脂糖固化，并在固化培养基顶部覆盖用1.5ml TXD培养基(补充有PGO维生素、0.005mg/l细胞分裂素、4mg/l CPA(对氯苯氧乙酸)、30g/l蔗糖的MS盐，pH5.7)湿润的滤纸。在21℃和弱光下共培育外植体4天，随后转移到选择性再生培养基中，该培养基由pH5.9的MS培养基组成，其中补充有20g/l蔗糖、1.25g/l甘露糖、0.25mg/l BA、0.05mg/lNAA、500mg/l羧苄青霉素，并用9g/l琼脂固化。每到第三周将外植体亚培养到含有逐渐提高的浓度、最大可达15g/l的甘露糖的新鲜培养基中。筛选并在21℃下再生12周后，收获再生的幼苗，生根，基本按照Feramisco和同事(Feramisco等人，生物化学与生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)55636-641，1973)所述的偶联酶测定法分析PMI活性。阳性植物埋于土壤中，最后转移到温室中。
实施例9.3rhizomania抗性的筛选 在播种并埋入土壤中后，首先用幼苗或T0转化子建立完全发育的根系统约4周，之后转移到遭携带BNYVV的Polymyxa betae侵袭的土壤中。从德国rhizomania感染的田间收集遭侵袭的土壤。在抗性测定中，植物在12cm区域中在约21℃和16小时的光照期中生长。转移到遭侵袭土壤中4周后，从土壤中拔出植物，通过用水漂洗去除根系统底部附着的任何泥土。利用Pollahne压力收集0.5g根组织的随机样品的汁液，加到10ml抽提缓冲液中，该缓冲液包含补充有2％PVP和0.2％卵白蛋白的磷酸缓冲液，pH7.2。基本按照使用说明书，利用英国苏格兰Adgen Ltd商品化的BNYVV三抗体夹心(TAS)ELISA测定样品(通过体外繁殖获得的克隆)中存在的病毒量。对每种植物制作标准曲线，由测量的吸光度值计算根系统的病毒含量。未转化的敏感性甜菜植物用作阴性对照，携带自然rhizomania抗性的C28基因的植物用作阳性对照。表1总结了用质粒pNIHK188获得的转化事件的结果。
表1 实施例10甜瓜中胡瓜黄化花叶马铃薯Y病毒(ZYMV)和木瓜环斑马铃薯Y病毒(PRSV)抗性的植物转化载体的构建 NOS终止子(Bevan，M.等人，1983核酸研究11(2)，369-385)作为260bp HindIII/PstI片段克隆到HindIII/PstI消化的质粒pZO1560中。pZO1560是一种pUC衍生的质粒，其中多克隆位点已被替换为更通用的位点。在插入NOS终止子后获得的新构建体被命名为pZU533。
通过BamHI消化，随后T4 DNA聚合酶处理和KpnI消化，分离1728bp Ubi3启动子/内含子片段(Callis，J.等人，(1995遗传学139(2)，921-939))。将该片段克隆到SmaI消化的pZU533中。新构建体被命名为pZU615。
首先用Pfx DNA聚合酶PCR扩增将插入pZU615中的其他DNA片段，并将获得的PCR片段克隆到pBluescript SK+中。为了扩增513bpActin2 IntronL(前导内含子)片段，根据An等人，植物杂志，10107-121，1996的序列设计两条引物。5’引物(ZUP15635’-GGGCGGATCCGCTAGCCCGCGGCCGCTCTTTCTTTCCAAGG-3’，SEQ ID NO19)直接在5’剪切位点下游退火，并向将扩增的Actin2IntronL片段5’端添加一个BamHI、一个NheI和一个SacII限制位点。3’引物(ZUP15645’-CCCGCCATGGGTCGACGCCATTTTTTATGAGCTGC-3’，EQ ID NO20)直接在3’剪切位点下游退火，并向将扩增的Actin2 IntronL片段3’端添加一个SalI和一个NcoI限制位点。将用ZUP1563和ZUP1564扩增的PCR片段克隆到pBluescript的EcoRV位点中。新质粒被命名为pZU611。为了提供含Act2 IntronL的质粒pZU615，从pZU611中分离499bp BamHI/NcoI Act2 IntronL片段，并克隆到BamHI和NcoI消化的pZU615中Ubi3启动子/内含子的下游，和NOS终止子的上游。新构建体被命名为pZU616。该片段的插入同时为下三个克隆步骤提供了含有5个另外限制位点的盒。
为了扩增非翻译(nt)739bp PRSV CP片段(Shyi-Dong，Y.等人，(1992)普通病毒学杂志73，2531-2541)，根据Shyi-Dong Yeh的法国田间分离株的序列设计两条引物。5’引物(ZUP15655’-CCCGCCATGGGAGCCGATGATTTCTACCGAGAATTAAGGG-3’，SEQ ID NO21)在PRSV CP起始密码子285bp下游退火，并向非翻译PRSV CP片段的5’端添加一个NcoI和一个BamHI限制位点。3’引物(ZUP15665’-GGGCGCTAGCCTAATGCTTATATAGTACC-3’，EQID NO22)在PRSV CP终止密码子55bp下游退火，并向非翻译PRSVCP片段添加一个NheI限制位点。将扩增的PCR片段克隆到pBluescript的EcoRV位点中。新质粒被命名为pZU612。
为了扩增735bp非翻译ZYMV CP片段(Gal-On，A.等人，(1990)基因87，273-277)，根据Gal-On，A.的法国田间分离株的序列设计两条引物。5’引物(ZUP15675’-GGGCGCTAGCCTTGCTGGAGTATAAGCCGG-3’，SEQ ID NO23)在ZYMV CP起始密码子253bp下游退火，在ZYMV CP非翻译片段的5’端含有一个NheI限制位点。3’引物(ZUP15685’-GGGCGTCGACCGCGGGCTTTAAAGGTGGGAGGCCC-3’，EQ ID NO24)在ZYMV CP终止密码子89bp下游退火，在非翻译ZYMV CP片段3’端含有一个SacII和SalI限制位点。将扩增的PCR片段克隆到pBluescript的EcoRV位点中。新质粒被命名为pZU613。随后将ZYMV CP非翻译片段克隆到pZU616中Ubi3启动子/内含子下游和Act2 IntronL上游。为此，从pZU613中分离719bpNheI/SacII ZYMV CP非翻译片段，并克隆到pZU616的NheI和SacII位点。该构建体被命名为pZU617。随后将PRSV CP非翻译片段克隆到pZU617中Ubi3启动子/内含子下游和ZYMV CP非翻译片段上游。为此，从pZU612中分离720bp BamHI/NheI PRSV CP非翻译片段，并克隆到pZU617的BamHI和NheI位点。该新构建体被命名为pZU618。
将克隆完成基因盒的最终片段含有PRSV CP非翻译片段，在其下游以相同方向含有一个ZYMV CP非翻译片段。用Pfx PCR和引物ZUP1565和ZUP1568，由pZU618作为模板扩增相应的片段。将PCR片段克隆到pBluescript的EcoRV位点中，得到的质粒被命名为pZU619。
为了产生反向重复基因盒，将PRSV CP(nt)/ZYMV CP(nt)片段以与pZU618质粒中已经存在的PRSV CP(nt)/ZYMV CP(nt)片段相反的方向插入pZU618中。为此，从pZU619中分离1445bp SalI/NcoIPRSV CP(nt)/ZYMV CP(nt)片段，并克隆到SalI和NcoI消化的pZU618中Act2 IntronL下游和NOS终止子上游。得到的质粒被命名为pZU622。将该盒插入二元载体pZU547中，它是一种来源于另外含有SMAS启动子/PMI/NOS终止子选择盒的质粒pVictorHink二元载体。为此，从pZU622中分离含有反向重复基因盒的5414bp AscI/PacIDNA片段，并以串联方向克隆到pZU547的AscI和PacI位点，和选择盒上游。终构建体被命名为pZU623(SEQ ID NO25)。
实施例11在番茄中马铃薯Y病毒(PVY)抗性的植物转化载体的构建 根据R.A.A.van der Vlugt(1993)的论文“对马铃薯Y病毒的工程抗性”中公开的PVYn(PVY的一种法国田间分离株)的序列，利用两条引物(ZUP15985’-CATGCCATGGATCCAATGGCCACGAATTAAAGCTATCACGTC-3’，SEQ ID NO26，和ZUP15905’-ACGCGTCGACCGCGGATTCAAACGATTATTAATTACGATAAAAG-3’，SEQ IDNO27)，使用来自Life Technologies的Platinum Pfx DNA聚合酶，通过标准PCR技术扩增含有外壳蛋白顺反子序列和3’端非翻译区的99个核苷酸的804bp片段。扩增的PCR片段作为平端片段克隆到pBluescriptSK+的EcoRV位点中，该质粒被命名为pZUA。扩增的PVY特异插入片段作为BamHI/SacI片段切下，克隆到pZU616(参见实施例10)的BamHI/SacI位点中，产生pZUB。pZUB和pZUA都用NcoI和SalI消化。来自pZUA的PVY特异性片段从琼脂糖凝胶中纯化，并与NcoI和SalI消化的pZUB连接，产生含有下列元件的pZUC 含内含子的UBI3启动子之后是有义方向的PVY PCR产物作为BamHI/SacI片段，之后是SacII/SalI ACT2内含子，之后是反义方向的PVY PCR产物作为SalI/NcoI片段，最后是nos终止子作为NcoI/HindIII片段。最后，将pZUC克隆到含有来自pHiNK085二元载体的SMAS启动子/PMI/NOS终止子选择盒的二元载体pZU547中。最终的构建体被命名为pZU634(SEQ ID NO28)。
实施例12二元载体对甜瓜和番茄植物材料的转化 向植物材料转移二元载体的方法已经建立，并为本领域技术人员所公知。该方法的变化是由于，例如，所使用的农杆菌株的差异，外植体材料的不同来源，再生系统的不同，以及欲转化的植物种的不同栽培品种。按照下列方法在转化实验中使用以上实施例10和11中所述的二元植物转化载体。通过电穿孔将二元载体转移到根瘤农杆菌中，随后用转化的农杆菌株接种并与植物外植体材料共培育，用合适的抗生素选择性杀伤农杆菌株，通过在含甘露糖的选择性培养基上生长筛选转化的细胞，向诱导萌发培养基中转移组织，向诱发生根培养基中转移选择的幼芽，并向土壤中转移小植物。为了证实以上实施例10和11中所述的基因盒的存在，用众所周知的Sourthern印迹分析技术表征来源于转基因植物的总DNA。
实施例13为ZYMV和PRSV抗性筛选转基因甜瓜植物 转化的植物在标准检疫条件下在温室中生长，以防止病原体的任何感染。初级转化子自体受粉，并收获种子。
分析初级转化子的S1后代的100株植物，分析插入基因的分离和随后通过机械接种感染ZYMV。系统感染ZYMV的宿主植物的组织在5倍体积的冰预冷的接种缓冲液(10mM磷酸缓冲液)中研磨，并在碳化硅粉存在下在1周龄幼苗的子叶和第一只叶子上摩擦。在接种后3周内监视接种的植物的症状发展。与未转化的对照植物相比——它们在接种7天后显示严重的系统ZYMV症状，含有ZYMV序列的植物显示对ZYMV感染的敏感性降低。ZYMV耐受植物自体受粉，并收获种子。按照上述方法用PRSV机械接种转基因ZYMV抗性植物。与未转化的对照植物相比——它们在接种7天后显示严重的系统PRSV症状，已有ZYMV抗性的植物也显示对PRSV感染的敏感性降低。
实施例14为PVY抗性对转基因番茄植物的筛选 转化的植物在标准检疫条件下在温室中生长，以防止病原体的任何感染。初级转化子自体受粉，并收获种子。
分析初级转化子的S1后代的50株植物，分析插入基因的分离和随后通过机械接种感染PVY。系统感染PVY的宿主植物的组织在5倍体积的冰预冷的接种缓冲液(10mM磷酸缓冲液)中研磨，并在碳化硅粉存在下在5周龄幼苗的前两个完全展开的叶子上摩擦。在接种后3周内监视接种的植物的症状发展。与未转化的对照植物相比——它们在接种7天后显示严重的系统PVY症状，含有PVY序列的植物显示对PVY感染的敏感性降低。
以上公开的实施方案是说明性的。本发明的公开内容将使本领域技术人员了解本发明的许多变化。所有这些明显且可预知的变化均为附加权利要求所包括。
本发明的优选实施方案如下 1.一种改变病毒基因组的表达的方法，包括向一种细胞中导入能在该细胞中表达该病毒基因组的有义RNA片段的第一种DNA序列，和能在该细胞中表达该病毒基因组的反义RNA片段的第二种DNA序列，其中有义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA。
2.项目1的方法，其能使该细胞具有病毒抗性或耐受性。
3.项目1的方法，其中该细胞是一种植物细胞。
4.项目1的方法，其中所述病毒选自蕃茄斑萎病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯X病毒、烟草花叶病毒、黄症病毒、黄瓜花叶病毒、雀麦花叶病毒、长线病毒、番茄丛矮病毒和真菌传棒状病毒。
5.项目1的方法，其中所述DNA序列含有一种来源于病毒外壳蛋白基因、病毒核壳蛋白基因、病毒复制酶基因或病毒运动蛋白基因的核苷酸序列。
6.项目1的方法，其中所述第一种DNA序列和第二种DNA序列稳定整合于所述细胞的基因组中。
7.项目1的方法，其中所述第一种DNA序列和第二种DNA序列包含于两种不同的DNA分子中。
8.项目1的方法，其中将第一种和第二种DNA序列的至少两对导入细胞中。
9.项目8的方法，其中每一对DNA序列编码不同病毒种或分离株的有义和反义RNA片段。
10.项目1的方法，其中所述第一种DNA序列和第二种DNA序列包含于一种DNA分子中。
11.项目10的方法，其中所述第一种DNA序列和第二种DNA序列包含于该DNA分子的同一DNA链中。
12.项目11的方法，其中有义RNA片段和反义RNA片段包含于一种RNA分子中。
13.项目12的方法，其中所述RNA分子能够折叠，使得其中所含的RNA片段形成双链区。
14.项目1的方法，其中表达的RNA分子包含SEQ ID NO13、SEQID NO17、SEQ ID NO18、SEQ ID NO25或SEQ ID NO28的反向重复序列。
15.项目24的方法，其中所述RNA分子的表达由异源的启动子、组织特异性启动子、发育调节型启动子、组成型启动子或诱导型启动子驱动。
16.项目15的方法，其中所述DNA分子的表达由一种遍在蛋白启动子如拟南芥Ubi3启动子驱动。
17.项目15的方法，其中所述DNA分子的表达由农杆菌rolC启动子驱动。
18.项目12的方法，其中所述DNA分子在编码有义RNA片段和反义RNA片段的DNA序列之间含有一个接头。
19.项目18的方法，其中所述接头由拟南芥肌动蛋白2基因的前导内含子的核苷酸序列确定。
20.项目18的方法，其中所述接头由侧翼为有义或反义RNA片段的病毒区的核苷酸序列确定。
21.项目18的方法，其中所述接头包含功能基因如选择性标记基因的表达盒。
22.项目21的方法，其中所述接头包含调节序列如内含子加工信号。
23.项目11的方法，其中所述有义RNA片段和反义RNA片段包含于两种不同的RNA分子中。
24.项目23的方法，其中所述第一种DNA序列和第二种DNA序列与一种双向启动子有效连接。
25.项目11的方法，其中所述第一种DNA序列和第二种DNA序列包含于所述DNA分子的互补链中。
26.项目25的方法，其中在所述DNA分子中，第一种DNA序列是第二种DNA序列的互补DNA链。
27.一种可改变病毒基因组的表达的DNA构建体，其包含能在一种细胞中表达该病毒基因组的有义RNA片段的第一种DNA序列，和能在该细胞中表达该病毒基因组的反义RNA片段的第二种DNA序列，其中有义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA分子。
28.项目27的DNA构建体，其中该DNA构建体含有与所述第一种DNA序列有效连接的第一种启动子，和与第二种DNA序列有效连接的第二种启动子。
29.项目27的DNA构建体，其中该DNA构建体含有与第一种DNA序列和第二种DNA序列有效连接的双向启动子。
30.一种显示改变的病毒基因组表达的细胞，其包含能在该细胞中表达该病毒基因组的有义RNA片段的第一种DNA序列，和能在该细胞中表达该病毒基因组的反义RNA片段的第二种DNA序列，其中有义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA。
31.一种显示改变的病毒基因组表达的植物及由其产生的后代，其含有能在该细胞中表达该病毒基因组的有义RNA片段的第一种DNA序列，和能在该细胞中表达该病毒基因组的反义RNA片段的第二种DNA序列，其中有义RNA片段和反义RNA片段能形成双链RNA。
32.项目31的植物，其中该植物是病毒抗性或耐受的。
33.由项目31的植物产生的种子。
<110>Novartis AG
<120>病毒基因表达的调节
<130>S-30959A
<140>
<141>
<150>US 09/309038
<151>1999-05-10
<160>28
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述ds_Luc1
<400>1
cgcggatcct ggaagacgcc aaaaaca27
<210>2
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述ds_Luc2
<400>2
cggaagctta ggctcgccta atcgcagtat ccggaatg38
<210>3
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述ds_Luc3
<400>3
cggtctagag gaagacgcca aaaacata 28
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述JG-L
<400>4
gtacctcgag tctagactcg ag 22
<210>5
<211>4732
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述pvictorHINK
<400>5
gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 60
caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 120
agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac 180
tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt 240
tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcae 300
gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 360
gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa 420
aaggatcttc acctagatcc ttttgatccg gaattaattc ctgtggttgg catgcacata 480
caaatggacg aacggataaa ccttttcacg cccttttaaa tatccgatta ttctaataaa 540
cgctcttttc tcttaggttt acccgccaat atatcctgtc aaacactgat agtttaaact 600
gaaggcggga aacgacaatc tgatcatgag cggagaatta agggagtcac gttatgaccc 660
ccgccgatga cgcgggacaa gccgttttac gtttggaact gacagaaccg caacgctgca 720
ggaattggcc gcagcggcca tttaaatcaa ttgggcgcgc cgaattcgag ctcggtaccc 780
ggggatcctc tagagtcgac catggtgatc actgcaggca tgcaagcttc gtacgttaat 840
taattcgaat ccggagcggc cgcacgcgtg ggcccgttta aacctcgaga gatctgctag 900
ccctgcagga aatttaccgg tgcccgggcg gccagcatgg ccgtatccgc aatgtgttat 960
taagttgtct aagcgtcaat ttgtttacac cacaatatat cctgccacca gccagccaac 1020
agctccccga ccggcagctc ggcacaaaat caccactcga tacaggcagc ccatcagaat 1080
taattctcat gtttgacagc ttatcatcga ctgcacggtg caccaatgct tctggcgtca 1140
ggcagccatc ggaagctgtg gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca taattcgtgt 1200
cgctcaaggc gcactcccgt tctggataat gttttttgcg ccgacatcat aacggttctg 1260
gcaaatattc tgaaatgagc tgttgacaat taatcatcgg ctcgtataat gtgtggaatt 1320
gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agaccatgag ggaagcggtg atcgccgaag 1380
tatcgactca actatcagag gtagttggcg tcatcgagcg ccatctcgaa ccgacgttgc 1440
tggccgtaca tttgtacggc tccgcagtgg atggcggcct gaagccacac agtgatattg 1500
atttgctggt tacggtgacc gtaaggcttg atgaaacaac gcggcgagct ttgatcaacg 1560
accttttgga aacttcggct tcccctggag agagcgagat tctccgcgct gtagaagtca 1620
ccattgttgt gcacgacgac atcattccgt ggcgttatcc agctaagcgc gaactgcaat 1680
ttggagaatg gcagcgcaat gacattcttg caggtatctt cgagccagcc acgatcgaca 1740
ttgatctggc tatcttgctg acaaaagcaa gagaacatag cgttgccttg gtaggtccag 1800
cggcggagga actctttgat ccggttcctg aacaggatct atttgaggcg ctaaatgaaa 1860
ccttaacgct atggaactcg ccgcccgact gggctggcga tgagcgaaat gtagtgctta 1920
cgttgtcccg catttggtac agcgcagtaa ccggcaaaat cgcgccgaag gatgtcgctg 1980
ccgactgggc aatggagcgc ctgccggccc agtatcagcc cgtcatactt gaagctaggc 2040
aggcttatct tggacaagaa gatcgcttgg cctcgcgcgc agatcagttg gaagaatttg 2100
ttcactacgt gaaaggcgag atcaccaagg tagtcggcaa ataaagctct agtggatccc 2160
cgaggaatcg gcgtgacggt cgcaaaccat ccggcccggt acaaatcggc gcggcgctgg 2220
gtgatgacct ggtggagaag ttgaaggccg cgcaggccgc ccagcggcaa cgcatcgagg 2280
cagaagcacg ccccggtgaa tcgtggcaag cggccgctga tcgaatccgc aaagaatccc 2340
ggcaaccgcc ggcagccggt gcgccgtcga ttaggaagcc gcccaagggc gacgagcaac 2400
cagatttttt cgttccgatg ctctatgacg tgggcacccg cgatagtcgc agcatcatgg 2460
acgtggccgt tttccgtctg tcgaagcgtg accgacgagc tggcgaggtg atccgctacg 2520
agcttccaga cgggcacgta gaggtttcag cagggccggc cggcatggcc agtgtgtggg 2580
attacgacct ggtactgatg gcggtttccc atctaaccga atccatgaac cgataccggg 2640
aagggaaggg agacaagccc ggccgcgtgt tccgtccaca cgttgcggac gtactcaagt 2700
tctgccggcg agccgatggc ggaaagcaga aagacgacct ggtagaaacc tgcattcggt 2760
taaacaccac gcacgttgcc atgcagcgta cgaagaaggc caagaacggc cgcctggtga 2820
cggtatccga gggtgaagcc ttgattagcc gctacaagat cgtaaagagc gaaaccgggc 2880
ggccggagta catcgagatc gagctagctg attggatgta ccgcgagatc acagaaggca 2940
agaacccgga cgtgctgacg gttcaccccg attacttttt gatcgatccc ggcatcggcc 3000
gttttctcta ccgcctggca cgccgcgccg caggcaaggc agaagccaga tggttgttca 3060
agacgatcta cgaacgcagt ggcagcgccg gagagttcaa gaagttctgt ttcaccgtgc 3120
gcaagctgat cgggtcaaat gacctgccgg agtacgattt gaaggaggag gcggggcagg 3180
ctggcccgat cctagtcatg cgctaccgca acctgatcga gggcgaagca tccgccggtt 3240
cctaatgtac ggagcagatg ctagggcaaa ttgccctagc aggggaaaaa ggtcgaaaag 3300
gtctctttcc tgtggatagc acgtacattg ggaacccaaa gccgtacatt gggaaccgga 3360
acccgtacat tgggaaccca aagccgtaca ttgggaaccg gtcacacatg taagtgactg 3420
atataaaaga gaaaaaaggc gatttttccg cctaaaactc tttaaaactt attaaaactc 3480
ttaaaacccg cctggcctgt gcataactgt ctggccagcg cacagccgaa gagctgcaaa 3540
aagcgcctac ccttcggtcg ctgcgctccc tacgccccgc cgcttcgcgt cggcctatcg 3600
cggccgctgg ccgctcaaaa atggctggcc tacggccagg caatctacca gggcgcggac 3660
aagccgcgcc gtcgccactc gaccgccggc gctgaggtct gcctcgtgaa gaaggtgttg 3720
ctgactcata ccaggcctga atcgccccat catccagcca gaaagtgagg gagccacggt 3780
tgatgagagc tttgttgtag gtggaccagt tggtgatttt gaacttttgc tttgccacgg 3840
aacggtctgc gttgtcggga agatgcgtga tctgatcctt caactcagca aaagttcgat 3900
ttattcaaca aagccgccgt cccgtcaagt cagcgtaatg ctctgccagt gttacaacca 3960
attaaccaat tctgattaga aaaactcatc gagcatcaaa tgaaactgca atttattcat 4020
atcaggatta tcaataccat atttttgaaa aagccgtttc tgtaatgaag gagaaaactc 4080
accgaggcag ttccatagga tggcaagatc ctggtatcgg tctgcgattc cgactcgtcc 4140
aacatcaata caacctatta atttcccctc gtcaaaaata aggttatcaa gtgagaaatc 4200
accatgagtg acgactgaat ccggtgagaa tggcaaaagc tctgcattaa tgaatcggcc 4260
aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact 4320
cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac 4380
ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa 4440
aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg 4500
acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 4560
gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 4620
ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac 4680
gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gt 4732
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述HiNK025bis
<400>6
caattaccat ggacacggtc gtgg24
<210>7
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述HiNK226
<400>7
gccaaatgtt tgaacgctgc agcctatttg 30
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述HiNK025bis2
<400>8
aatcgtccat ggatacggtc gtgg24
<210>9
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述HiNK226bis
<400>9
ctagggccgg gttcctctgc agcctatttg 30
<210>10
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述HiNK251
<400>10
ctcccaggtt gagactgccc tgcagtgccc a31
<210>11
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述HiNK228
<400>11
ttaccatgca tacggtcgtg ggtagg26
<210>12
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述HiNK228bis
<400>12
cgttaatgca tacggtcgtg ggtagg26
<210>13
<211>3338
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述BWYV duplex
RNA gene
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(1131)
<223>RolC启动子
<220>
<221>重复单元
<222>(1132)..(1737)
<223>BWYV CP反向重复片段
<220>
<221>茎-环
<222>(1738)..(2470)
<223>BWYV CP基因下游0.7kb间隔基片段
<220>
<221>重复单元
<222>(2471)..(3074)
<223>BWYV CP反向重复片段
<220>
<221>终止子
<222>(3076)..(3338)
<223>NOS终止子
<400>13
ggatccggcg tcggaaactg gcgccaatca gacacagtct ctggtcggga aagccagagg 60
tagtttggca acaatcacat caagatcgat gcgcaagaca cgggaggcct taaaatctgg 120
atcaagcgaa aatactgcat gcgtgatcgt tcatgggttc atagtactgg gtttgctttt 180
tcttgtcgtg ttgtttggcc ttagcgaaag gatgtcaaaa aaggatgccc ataattggga 240
ggagtggggt aaagcttaaa gttggcccgc tattggattt cgcgaaagcg cattggcaaa 300
cgtgaagatt gctgcattca agatactttt tctattttct ggttaagatg taaagtattg 360
ccacaatcat attaattact aacattgtat atgtaatata gtgcggaaat tatctatgcc 420
aaaatgatgt attaataata gcaataataa tatgtgttaa tctttttcaa tcgggaatac 480
gtttaagcga ttatcgtgtt gaataaatta ttccaaaagg aaatacatgg ttttggagaa 540
cctgctatag atatatgcca aatttacact agtttagtgg gtgcaaaact attatctctg 600
tttctgagtt taataaaaaa taaataagca gggcgaatag cagttagcct aagaaggaat 660
ggtggccatg tacgtgcttt taagagaccc tataataaat tgccagctgt gttgctttgg 720
tgccgacagg cctaacgtgg ggtttagctt gacaaagtag cgcctttccg cagcataaat 780
aaaggtaggc gggtgcgtcc cattattaaa ggaaaaagca aaagctgaga ttccatagac 840
cacaaaccac cattattgga ggacagaacc tattccctca cgtgggtcgc tgagctttaa 900
acctaataag taaaaacaat taaaagcagg caggtgtccc ttctatattc gcacaacgag 960
gcgacgtgga gcatcgacag ccgcatccat taattaataa atttgtggac ctatacctaa 1020
ctcaaatatt tttattattt gctccaatac gctaagagct ctggattata aatagtttgg 1080
atgcttcgag ttatgggtac aagcaacctg tttcctactt tgttaccatg gacacggtcg 1140
tgggtaggag aattatcaat ggaagaagac gaccacgcag gcaaacacga cgcgctcagc 1200
gccctcagcc agtggttgtg gtccaaacct ctcgggcaac acaacgccga cctagacgac 1260
gacgaagagg taacaaccgg acaggaagaa ctgttcctac cagaggagca ggttcgagcg 1320
agacatttgt tttctcaaaa gacaatctcg cgggaagttc cagcggagca atcacgttcg 1380
ggccgagtct atcagactgc ccggcattct ctaatggaat gctcaaggcc taccatgagt 1440
ataaaatctc aatggtcatt ttggagttcg tctccgaagc ctcttcccaa aattccggtt 1500
ccatcgctta cgagctggac ccacactgta aactcaactc cctttcctca actatcaaca 1560
agttcgggat cacaaagccc gggaaaaggg cgtttacagc gtcttacatc aacggaacgg 1620
aatggcacga cgttgccgag gaccaattca ggatcctcta caaaggcaat ggttcttcat 1680
cgatagctgg ttctttcaga atcaccatta agtgtcaatt ccacaacccc aaataggctg 1740
cagtgcccaa ctctctttgg tctttctgtc tttacggaac cggatgagcc ttgttcatca 1800
agtgctatgg cgatcatccc tatctccatc atccgatctg tccaggctcc gtacgaaacg 1860
gcgtaattat atttagattg cttctggaca gcgggtccaa caacaaagaa ggaggcattg 1920
tcaccagtcg tcttgatatg acaagtcaaa tctccatctc tttccagaca ctgtccttga 1980
ttgaaatgac agccattgag ttccatgtct gggtggccat acttcaaagt attatcggcc 2040
ttgttgttgg ttatctccac attattgtaa atccccacgt tccaaccttc actaagatca 2100
tcgttgtagg cgatgagacc atcttgtttg tccttgttag gatctgtggt gcttgaggtt 2160
ggttgatacc cctccatcga tatttccacg gtccactcac cttgagggac tggcactatt 2220
atcatcggga tggctttcaa agaattctgg gaataccatc gagaatcgag gttcgtccag 2280
ttcatgttct cgtcctctat gtagcgaaac cgttgggacg gcatatcata caaagagatg 2340
gcatcatccg tagattgagc cattatacga gtcacgggga ctccagtata gacgataaaa 2400
cgatatttct tttggggtgt gggttgtgga gagggagaag gccctgggct agggccgggt 2460
tcctcgtcta cctatttggg gttgtggaat tgacacttaa tggtgattct gaaagaacca 2520
gctatcgatg aagaaccatt gcctttgtag aggatcctga attggtcctc ggcaacgtcg 2580
tgccattccg ttccgttgat gtaagacgct gtaaacgccc ttttcccggg ctttgtgatc 2640
ccgaacttgt tgatagttga ggaaagggag ttgagtttac agtgtgggtc cagctcgtaa 2700
gcgatggaac cggaattttg ggaagaggct tcggagacga actccaaaat gaccattgag 2760
attttatact catggtaggc cttgagcatt ccattagaga atgccgggca gtctgataga 2820
ctcggcccga acgtgattgc tccgctggaa cttcccgcga gattgtcttt tgagaaaaca 2880
aatgtctcgc tcgaacctgc tcctctggta ggaacagttc ttcctgtccg gttgttacct 2940
cttcgtcgtc gtctaggtcg gcgttgtgtt gcccgagagg tttggaccac aaccactggc 3000
tgagggcgct gagcgcgtcg tgtttgcctg cgtggtcgtc ttcttccatt gataattctc 3060
ctacccacga ccgtatgcag atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa 3120
tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt 3180
aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc 3240
gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaacct aggataaatt 3300
atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga tctctaga 3338
<210>14
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述HiNK285
<400>14
tcgtagaaga gaattcaccc aaactatcc29
<210>15
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述HiNK283
<400>15
aagaattgca ggatccacag gctcggtac29
<210>16
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述HiNK284
<400>16
ttccaacgaa ttcggtctca gaca 24
<210>17
<211>3648
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述pHiNK181
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(1738)
<223>遍在蛋白3启动子加内含子
<220>
<221>重复单元
<222>(1739)..(2166)
<223>BNYVV RNA1重复片段
<220>
<221>misc_feature
<222>(2167)..(2946)
<223>间隔基片段
<220>
<221>重复单元
<222>(2947)..(3375)
<223>BNYVV RNA1重复片段
<220>
<221>茎-环
<222>(1739)..(3375)
<223>由间隔基分隔的BNYVV RNA1片段的反向重复
<220>
<221>终止子
<222>(3376)..(3648)
<223>NOS终止子
<400>17
ggtaccggat ttggagccaa gtctcataaa cgccattgtg gaagaaagtc ttgagttggt 60
ggtaatgtaa cagagtagta agaacagaga agagagagag tgtgagatac atgaattgtc 120
gggcaacaaa aatcctgaac atcttatttt agcaaagaga aagagttccg agtctgtagc 180
agaagagtga ggagaaattt aagctcttgg acttgtgaat tgttccgcct cttgaatact 240
tcttcaatcc tcatatattc ttcttctatg ttacctgaaa accggcattt aatctcgcgg 300
gtttattccg gttcaacatt ttttttgttt tgagttatta tctgggctta ataacgcagg 360
cctgaaataa attcaaggcc caactgtttt tttttttaag aagttgctgt taaaaaaaaa 420
aaaagggaat taacaacaac aacaaaaaaa gataaagaaa ataataacaa ttactttaat 480
tgtagactaa aaaaacatag attttatcat gaaaaaaaga gaaaagaaat aaaaacttgg 540
atcaaaaaaa aaaacataca gatcttctaa ttattaactt ttcttaaaaa ttaggtcctt 600
tttcccaaca attaggttta gagttttgga attaaaccaa aaagattgtt ctaaaaaata 660
ctcaaatttg gtagataagt ttccttattt taattagtca atggtagata cttttttttc 720
ttttctttat tagagtagat tagaatcttt tatgccaagt tttgataaat taaatcaaga 780
agataaacta tcataatcaa catgaaatta aaagaaaaat ctcatatata gtattagtat 840
tctctatata tattatgatt gcttattctt aatgggttgg gttaaccaag acatagtctt 900
aatggaaaga atcttttttg aactttttcc ttattgatta aattcttcta tagaaaagaa 960
agaaattatt tgaggaaaag tatatacaaa aagaaaaata gaaaaatgtc agtgaagcag 1020
atgtaatgga tgacctaatc caaccaccac cataggatgt ttctacttga gtcggtcttt 1080
taaaaacgca cggtggaaaa tatgacacgt atcatatgat tccttccttt agtttcgtga 1140
taataatcct caactgatat cttccttttt ttgttttggc taaagatatt ttattctcat 1200
taatagaaaa gacggttttg ggcttttggt ttgcgatata aagaagacct tcgtgtggaa 1260
gataataatt catcctttcg tctttttctg actcttcaat ctctcccaaa gcctaaagcg 1320
atctctgcaa atctctcgcg actctctctt tcaaggtata ttttctgatt ctttttgttt 1380
ttgattcgta tctgatctcc aatttttgtt atgtggatta ttgaatcttt tgtataaatt 1440
gcttttgaca atattgttcg tttcgtcaat ccagcttcta aattttgtcc tgattactaa 1500
gatatcgatt cgtagtgttt acatctgtgt aatttcttgc ttgattgtga aattaggatt 1560
ttcaaggacg atctattcaa tttttgtgtt ttctttgttc gattctctct gttttaggtt 1620
tcttatgttt agatccgttt ctctttggtg ttgttttgat ttctcttacg gcttttgatt 1680
tggtatatgt tcgctgattg gtttctactt gttctattgt tttatttcag gtggatccac 1740
aggctcggta cttatttcga aaagtgagaa attctccatc atcgacacaa gatagtgttg 1800
cacgtatggt tgctcagcta tttgtttctg attgtttggt gccaaatgta gctgatactt 1860
tttctgcttc caatttgtgg cgaattatgg acaaagctat gcatgacatg gtcgcaaaaa 1920
attaccaagg ccaaatggaa gaggagttta cgcgtaatgc taaactatat cgttttcagt 1980
tgaaggatat tgaaaaacct ttgaaggacc cagagactga tttggcaaag gctggtcaag 2040
ggatattggc atggtctaag gaggcacatg ttaagtttat ggttgctttt agagttttaa 2100
atgatttgtt attgaagtca ttaaactcta atgttgttta cgataacaca atgtctgaga 2160
ccgaattcac ccaaactatc ctcaacgggt ggcaatgaca taaaaacttc ccgtatcggg 2220
aacatcatca taaattgctc acgcccgatt cgagacacag agataatagc atccaaccaa 2280
cgttgaacat catcaacatt gcgacaagat aagctagcgt tacactccaa aaaatcagca 2340
taaacagctg ggtctttggg aagattttta atccaatcac gcaaagattc ctggtattca 2400
caaaaatgct tatactcacg gaacctgtgt gctgctatct tcgtcaattt acgcgaaaca 2460
cttggaaaca aatgtccatt agataaagca taaccacaaa aagtgatagg aacatttaaa 2520
tccaatttga aatccaagac agtttccttt ttaatcaact ttaacatttg atcgttaatt 2580
ttcaaattag cctgcctttt aaaaccatca tcgcccttca tggccataca aaatggtccg 2640
gtcccacgaa gcatagcatt taacatagca cccattaaaa tggtattacc aagcaaagtg 2700
ccgggttctc cactagtctt aacataagac atatgtgctc tgacatatct ggactgcata 2760
acatatttct cacgaaatga gaaataccaa tccaaaaaga agtcagaaat gcccaaagca 2820
gcataaatat gtctttctat caattgggtg aaaacccctt gcccagaatc gcaagcagca 2880
gcatcgataa ccccgtttat agcactatct ggtactgtat tcatggcggc atttattttt 2940
ccaacaaatt cggtctcaga cattgtgtta tcgtaaacaa cattagagtt taatgacttc 3000
aataacaaat catttaaaac tctaaaagca accataaact taacatgtgc ctccttagac 3060
catgccaata tcccttgacc agcctttgcc aaatcagtct ctgggtcctt caaaggtttt 3120
tcaatatcct tcaactgaaa acgatatagt ttagcattac gcgtaaactc ctcttccatt 3180
tggccttggt aattttttgc gaccatgtca tgcatagctt tgtccataat tcgccacaaa 3240
ttggaagcag aaaaagtatc agctacattt ggcaccaaac aatcagaaac aaatagctga 3300
gcaaccatac gtgcaacact atcttgtgtc gatgatggag aatttctcac ttttcgaaat 3360
aagtaccgag cctgtggatc ccccgaattt ccccgatcgt tcaaacattt ggcaataaag 3420
tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct tgcgatgatt atcatctaat ttctgttgaa 3480
ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta atgcatgacg ttatttatga gatgggtttt 3540
tatgattaga gtcccgcaat tatacattta atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc 3600
aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc atctatgtta ctagatcc 3648
<210>18
<211>3648
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述pHiNK184
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(1738)
<223>遍在蛋白3启动子加前导内含子
<220>
<221>重复单元
<222>(1739)..(2166)
<223>BNYVV RNA1重复片段
<220>
<221>misc_feature
<222>(2167)..(2946)
<223>间隔基
<220>
<221>重复单元
<222>Complement((2947)..(3375))
<223>BNYVV RNA1重复片段
<220>
<221>茎-环
<222>(1739)..(3375)
<223>由间隔基分隔的BNYVV RNA1片段的反向重复
<220>
<221>终止子
<222>(3376)..(3648)
<223>NOS终止子
<400>18
ggtaccggat ttggagccaa gtctcataaa cgccattgtg gaagaaagtc ttgagttggt 60
ggtaatgtaa cagagtagta agaacagaga agagagagag tgtgagatac atgaattgtc 120
gggcaacaaa aatcctgaac atcttatttt agcaaagaga aagagttccg agtctgtagc 180
agaagagtga ggagaaattt aagctcttgg acttgtgaat tgttccgcct cttgaatact 240
tcttcaatcc tcatatattc ttcttctatg ttacctgaaa accggcattt aatctcgcgg 300
gtttattccg gttcaacatt ttttttgttt tgagttatta tctgggctta ataacgcagg 360
cctgaaataa attcaaggcc caactgtttt tttttttaag aagttgctgt taaaaaaaaa 420
aaaagggaat taacaacaac aacaaaaaaa gataaagaaa ataataacaa ttactttaat 480
tgtagactaa aaaaacatag attttatcat gaaaaaaaga gaaaagaaat aaaaacttgg 540
atcaaaaaaa aaaacataca gatcttctaa ttattaactt ttcttaaaaa ttaggtcctt 600
tttcccaaca attaggttta gagttttgga attaaaccaa aaagattgtt ctaaaaaata 660
ctcaaatttg gtagataagt ttccttattt taattagtca atggtagata cttttttttc 720
ttttctttat tagagtagat tagaatcttt tatgccaagt tttgataaat taaatcaaga 780
agataaacta tcataatcaa catgaaatta aaagaaaaat ctcatatata gtattagtat 840
tctctatata tattatgatt gcttattctt aatgggttgg gttaaccaag acatagtctt 900
aatggaaaga atcttttttg aactttttcc ttattgatta aattcttcta tagaaaagaa 960
agaaattatt tgaggaaaag tatatacaaa aagaaaaata gaaaaatgtc agtgaagcag 1020
atgtaatgga tgacctaatc caaccaccac cataggatgt ttctacttga gtcggtcttt 1080
taaaaacgca cggtggaaaa tatgacacgt atcatatgat tccttccttt agtttcgtga 1140
taataatcct caactgatat cttccttttt ttgttttggc taaagatatt ttattctcat 1200
taatagaaaa gacggttttg ggcttttggt ttgcgatata aagaagacct tcgtgtggaa 1260
gataataatt catcctttcg tctttttctg actcttcaat ctctcccaaa gcctaaagcg 1320
atctctgcaa atctctcgcg actctctctt tcaaggtata ttttctgatt ctttttgttt 1380
ttgattcgta tctgatctcc aatttttgtt atgtggatta ttgaatcttt tgtataaatt 1440
gcttttgaca atattgttcg tttcgtcaat ccagcttcta aattttgtcc tgattactaa 1500
gatatcgatt cgtagtgttt acatctgtgt aatttcttgc ttgattgtga aattaggatt 1560
ttcaaggacg atctattcaa tttttgtgtt ttctttgttc gattctctct gttttaggtt 1620
tcttatgttt agatccgttt ctctttggtg ttgttttgat ttctcttacg gcttttgatt 1680
tggtatatgt tcgctgattg gtttctactt gttctattgt tttatttcag gtggatccac 1740
aggctcggta cttatttcga aaagtgagaa attctccatc atcgacacaa gatagtgttg 1800
cacgtatggt tgctcagcta tttgtttctg attgtttggt gccaaatgta gctgatactt 1860
tttctgcttc caatttgtgg cgaattatgg acaaagctat gcatgacatg gtcgcaaaaa 1920
attaccaagg ccaaatggaa gaggagttta cgcgtaatgc taaactatat cgttttcagt 1980
tgaaggatat tgaaaaacct ttgaaggacc cagagactga tttggcaaag gctggtcaag 2040
ggatattggc atggtctaag gaggcacatg ttaagtttat ggttgctttt agagttttaa 2100
atgatttgtt attgaagtca ttaaactcta atgttgttta cgataacaca atgtctgaga 2160
ccgaatttgt tggaaaaata aatgccgcca tgaatacagt accagatagt gctataaacg 2220
gggttatcga tgctgctgct tgcgattctg ggcaaggggt tttcacccaa ttgatagaaa 2280
gacatattta tgctgctttg ggcatttctg acttcttttt ggattggtat ttctcatttc 2340
gtgagaaata tgttatgcag tccagatatg tcagagcaca tatgtcttat gttaagacta 2400
gtggagaacc cggcactttg cttggtaata ccattttaat gggtgctatg ttaaatgcta 2460
tgcttcgtgg gaccggacca ttttgtatgg ccatgaaggg cgatgatggt tttaaaaggc 2520
aggctaattt gaaaattaac gatcaaatgt taaagttgat taaaaaggaa actgtcttgg 2580
atttcaaatt ggatttaaat gttcctatca ctttttgtgg ttatgcttta tctaatggac 2640
atttgtttcc aagtgtttcg cgtaaattga cgaagatagc agcacacagg ttccgtgagt 2700
ataagcattt ttgtgaatac caggaatctt tgcgtgattg gattaaaaat cttcccaaag 2760
acccagctgt ttatgctgat tttttggagt gtaacgctag cttatcttgt cgcaatgttg 2820
atgatgttca acgttggttg gatgctatta tctctgtgtc tcgaatcggg cgtgagcaat 2880
ttatgatgat gttcccgata cgggaagttt ttatgtcatt gccacccgtt gaggatagtt 2940
tgggtgaatt cggtctcaga cattgtgtta tcgtaaacaa cattagagtt taatgacttc 3000
aataacaaat catttaaaac tctaaaagca accataaact taacatgtgc ctccttagac 3060
catgccaata tcccttgacc agcctttgcc aaatcagtct ctgggtcctt caaaggtttt 3120
tcaatatcct tcaactgaaa acgatatagt ttagcattac gcgtaaactc ctcttccatt 3180
tggccttggt aattttttgc gaccatgtca tgcatagctt tgtccataat tcgccacaaa 3240
ttggaagcag aaaaagtatc agctacattt ggcaccaaac aatcagaaac aaatagctga 3300
gcaaccatac gtgcaacact atcttgtgtc gatgatggag aatttctcac ttttcgaaat 3360
aagtaccgag cctgtggatc ccccgaattt ccccgatcgt tcaaacattt ggcaataaag 3420
tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct tgcgatgatt atcatctaat ttctgttgaa 3480
ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta atgcatgacg ttatttatga gatgggtttt 3540
tatgattaga gtcccgcaat tatacattta atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc 3600
aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc atctatgtta ctagatcc3648
<210>19
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述ZUP1563
<400>19
gggcggatcc gctagcccgc ggccgctctt tctttccaag g41
<210>20
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述ZUP1564
<400>20
cccgccatgg gtcgacgcca ttttttatga gctgc 35
<210>21
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述ZUP1565
<400>21
cccgccatgg gatccgatga tttctaccga gaattaaggg40
<210>22
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述ZUP1566
<400>22
gggcgctagc ctaatgctta tatagtacc29
<210>23
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述ZUP1567
<400>23
gggcgctagc cttgctggag tataagccgg 30
<210>24
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述ZUP1568
<400>24
gggcgtcgac cgcgggcttt aaaggtggga ggccc 35
<210>25
<211>12766
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述pZU623
<220>
<221>启动子
<222>(55)..(1781)
<223>遍在蛋白3加先导内含子
<220>
<221>misc_feature
<222>(1790)..(2430)
<223>PRSV nt CP区
<220>
<221>misc_feature
<222>(2511)..(3111)
<223>ZYMV nt CP区
<220>
<221>内含子
<222>(3245)..(3686)
<223>actin2 intronL
<220>
<221>misc_feature
<222>Complement((3822)..(4422))
<223>ZYMV nt CP区
<220>
<221>misc_feature
<222>Complement((4503)..(5143))
<223>PRSV nt CP区
<220>
<221>终止子
<222>(5160)..(5429)
<223>NOS启动子
<220>
<221>启动子
<222>(5498)..(6669)
<223>SMAS启动子
<220>
<221>基因
<222>(6691)..(7866)
<223>磷酸甘露糖异构酶A编码序列
<220>
<221>终止子
<222>(7928)..(8202)
<223>胭脂碱合酶终止子
<220>
<221>misc_feature
<222>(8254)..(8385)
<223>胭脂碱左边界片段
<220>
<221>基因
<222>(8664)..(9452)
<223>壮观霉素(aadA)编码序列
<220>
<221>misc_structure
<222>(9462)..(11549)
<223>pVSl ORI
<220>
<221>misc_structure
<222>(11550)..(12484)
<223>pUC19 ORI
<220>
<221>misc_feature
<222>(12500)..(12755)
<223>胭脂碱右边界区
<220>
<221>茎-环
<222>(1790)..(5143)
<223>PRSV-ZYMV反向重复片段
<400>25
ggccgcagcg gccatttaaa tcaattgggc gcgccgaatt cgagctcggt accccggatt 60
tggagccaag tctcataaac gccattgtgg aagaaagtct tgagttggtg gtaatgtaac 120
agagtagtaa gaacagagaa gagagagagt gtgagataca tgaattgtcg ggcaacaaaa 180
atcctgaaca tcttatttta gcaaagagaa agagttccga gtctgtagca gaagagtgag 240
gagaaattta agctcttgga cttgtgaatt gttccgcctc ttgaatactt cttcaatcct 300
catatattct tcttctatgt tacctgaaaa ccggcattta atctcgcggg tttattccgg 360
ttcaacattt tttttgtttt gagttattat ctgggcttaa taacgcaggc ctgaaataaa 420
ttcaaggccc aactgttttt tttttaagaa gttgctgtta aaaaaaaaaa aagggaatta 480
acaacaacaa caaaaaaaga taaagaaaat aataacaatt actttaattg tagactaaaa 540
aaacatagat tttatcatga aaaaaagaga aaagaaataa aaacttggat caaaaaaaaa 600
aacatacaga tcttctaatt attaactttt cttaaaaatt aggtcctttt tcccaacaat 660
taggtttaga gttttggaat taaaccaaaa agattgttct aaaaaatact caaatttggt 720
agataagttt ccttatttta attagtcaat ggtagatact tttttttctt ttctttatta 780
gagtagatta gaatctttta tgccaagttt tgataaatta aatcaagaag ataaactatc 840
ataatcaaca tgaaattaaa agaaaaatct catatatagt attagtattc tctatatata 900
ttatgattgc ttattcttaa tgggttgggt taaccaagac atagtcttaa tggaaagaat 960
cttttttgaa ctttttcctt attgattaaa ttcttctata gaaaagaaag aaattatttg 1020
aggaaaagta tatacaaaaa gaaaaataga aaaatgtcag tgaagcagat gtaatggatg 1080
acctaatcca accaccacca taggatgttt ctacttgagt cggtctttta aaaacgcacg 1140
gtggaaaata tgacacgtat catatgattc cttcctttag tttcgtgata ataatcctca 1200
actgatatct tccttttttt gttttggcta aagatatttt attctcatta atagaaaaga 1260
cggttttggg cttttggttt gcgatataaa gaagaccttc gtgtggaaga taataattca 1320
tcctttcgtc tttttctgac tcttcaatct ctcccaaagc ctaaagcgat ctctgcaaat 1380
ctctcgcgac tctctctttc aaggtatatt ttctgattct ttttgttttt gattcgtatc 1440
tgatctccaa tttttgttat gtggattatt gaatcttttg tataaattgc ttttgacaat 1500
attgttcgtt tcgtcaatcc agcttctaaa ttttgtcctg attactaaga tatcgattcg 1560
tagtgtttac atctgtgtaa tttcttgctt gattgtgaaa ttaggatttt caaggacgat 1620
ctattcaatt tttgtgtttt ctttgttcga ttctctctgt tttaggtttc ttatgtttag 1680
atccgtttct ctttggtgtt gttttgattt ctcttacggc ttttgatttg gtatatgttc 1740
gctgattggt ttctacttgt tctattgttt tacttcaggt gggggatccg atgatttcta 1800
ccgagaatta agggaaagac tgtccttaat ttaaatcatc ttcttcagta taatccgcaa 1860
caaattgaca tttctaacac tcgtgccact cagtcacaat ttgagaagtg gtatgaggga 1920
gtgaggaatg attatggtct caatgataat gaaatgcaag tgatgctaaa tggcttgatg 1980
gtttggtgta tcgagaatgg tacatctcca gacatatctg gtgtctgggt tatgatggat 2040
ggggaaaccc aagttgatta tccaatcaag cctttaatag agcatgctac tccgtcattt 2100
aggcaaatta tggctcactt tagtaacgcg gcagaagcat acattgcgaa gagaaatgct 2160
actgagagat acatgccgcg gtatggaatc aagagaaatt tgactgacat tagtcttgct 2220
agatacgctt tcgacttcta tgaggtgaat tcgaaaacac ctgatagggc tcgtgaagct 2280
cacatgcaga tgaaagctgc agcgctgcga aacactagtc gcagaatgtt tggtatggac 2340
ggcagtgtta gtaacaagga agaaaacacg gagagacaca cagtggaaga tgtcaataga 2400
gacatgcact ctctcctggg tatgcgcaac tgaatactcg cgcttgtgtg tttgtcgagt 2460
ctgactcgac cctgtttcac cttatggtac tatataagca ttaggctagc cttgctggag 2520
tataagccgg atcaaattga gttatacaac acacgagcgt ctcatcagca attcgcctct 2580
tggttcaacc aagttaaaac agaatatgat ctgaatgagc aacagatggg agttgtaatg 2640
aatggtttca tggtttggtg cattgaaaat ggcacgtcac ccgacattaa cggagtatgg 2700
gttatgatgg acggtaatga gcaggttgaa tatcctttga aaccaatagt tgaaaatgca 2760
aagccaacgc tgcgacaaat aatgcatcac ttttcagatg cagcggaggc atatatagag 2820
atgagaaatg cagaggcacc atacatgccg aggtatggtt tgcttcgaaa cttacgggat 2880
aggagtttgg cacgatatgc tttcgacttc tacgaagtca attccaaaac tccggaaaga 2940
gcccgcgaag ctgttgcgca gatgaaagca gcagccctta gcaatgtttc ttcaaggttg 3000
tttggccttg atggaaatgt tgccaccact agcgaagaca ctgaacggca cactgcacgt 3060
gatgttaata ggaacatgca caccttgcta ggtgtgaata caatgcagta aagggtaggt 3120
cgcctaccta ggttatcgtt tcgctgccga cgtaattcta atatttaccg ctttatgtga 3180
tgtctttaga tttctagagt gggcctccca cctttaaagc ccgcggccgc tctttctttc 3240
caaggtaata ggaactttct ggatctactt tatttgctgg atctcgatct tgttttctca 3300
atttccttga gatctggaat tcgtttaatt tggatctgtg aacctccact aaatcttttg 3360
gttttactag aatcgatcta agttgaccga tcagttagct cgattatagc taccagaatt 3420
tggcttgacc ttgatggaga gatccatgtt catgttacct gggaaatgat ttgtatatgt 3480
gaattgaaat ctgaactgtt gaagttagat tgaatctgaa cactgtcaat gttagattga 3540
atctgaacac tgtttaagtt agatgaagtt tgtgtataga ttcttcgaaa ctttaggatt 3600
tgtagtgtcg tacgttgaac agaaagctat ttctgattca atcagggttt atttgactgt 3660
attgaactct ttttgtgtgt ttgcagctca taaaaaatgg cgtcgaccgc gggctttaaa 3720
ggtgggaggc ccactctaga aatctaaaga catcacataa agcggtaaat attagaatta 3780
cgtcggcagc gaaacgataa cctaggtagg cgacctaccc tttactgcat tgtattcaca 3840
cctagcaagg tgtgcatgtt cctattaaca tcacgtgcag tgtgccgttc agtgtcttcg 3900
ctagtggtgg caacatttcc atcaaggcca aacaaccttg aagaaacatt gctaagggct 3960
gctgctttca tctgcgcaac agcttcgcgg gctctttccg gagttttgga attgacttcg 4020
tagaagtcga aagcatatcg tgccaaactc ctatcccgta agtttcgaag caaaccatac 4080
ctcggcatgt atggtgcctc tgcatttctc atctctatat atgcctccgc tgcatctgaa 4140
aagtgatgca ttatttgtcg cagcgttggc tttgcatttt caactattgg tttcaaagga 4200
tattcaacct gctcattacc gtccatcata acccatactc cgttaatgtc gggtgacgtg 4260
ccattttcaa tgcaccaaac catgaaacca ttcattacaa ctcccatctg ttgctcattc 4320
agatcatatt ctgttttaac ttggttgaac caagaggcga attgctgatg agacgctcgt 4380
gtgttgtata actcaatttg atccggctta tactccagca aggctagcct aatgcttata 4440
tagtaccata aggtgaaaca gggtcgagtc agactcgaca aacacacaag cgcgagtatt 4500
cagttgcgca tacccaggag agagtgcatg tctctattga catcttccac tgtgtgtctc 4560
tccgtgtttt cttccttgtt actaacactg ccgtccatac caaacattct gcgactagtg 4620
tttcgcagcg ctgcagcttt catctgcatg tgagcttcac gagccctatc aggtgttttc 4680
gaattcacct catagaagtc gaaagcgtat ctagcaagac taatgtcagt caaatttctc 4740
ttgattccat accgcggcat gtatctctca gtagcatttc tcttcgcaat gtatgcttct 4800
gccgcgttac taaagtgagc cataatttgc ctaaatgacg gagtagcatg ctctattaaa 4860
ggcttgattg gataatcaac ttgggtttcc ccatccatca taacccagac accagatatg 4920
tctggagatg taccattctc gatacaccaa accatcaagc catttagcat cacttgcatt 4980
tcattatcat tgagaccata atcattcctc actccctcat accacttctc aaattgtgac 5040
tgagtggcac gagtgttaga aatgtcaatt tgttgcggat tatactgaag aagatgattt 5100
aaattaagga cagtctttcc cttaattctc ggtagaaatc atcggatcca tggtgatcac 5160
tgcagatcgt tcaaacattt ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct 5220
tgcgatgatt atcatataat ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta 5280
atgcatgacg ttatttatga gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat tatacattta 5340
atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc 5400
atctatgtta ctagatctct agaaagcttc gtacgttaat taattcgaat ccggagcggc 5460
cgcagggcta gcatcgatgg taccgagctc gagactatac aggccaaatt cgctcttagc 5520
cgtacaatat tactcaccgg tgcgatgccc cccatcgtag gtgaaggtgg aaattaatga 5580
tccatcttga gaccacaggc ccacaacagc taccagtttc ctcaagggtc caccaaaaac 5640
gtaagcgctt acgtacatgg tcgataagaa aaggcaattt gtagatgtta acatccaacg 5700
tcgctttcag ggatcccgaa ttccaagctt ggaattcggg atcctacagg ccaaattcgc 5760
tcttagccgt acaatattac tcaccggtgc gatgcccccc atcgtaggtg aaggtggaaa 5820
ttaatgatcc atcttgagac cacaggccca caacagctac cagtttcctc aagggtccac 5880
caaaaacgta agcgcttacg tacatggtcg ataagaaaag gcaatttgta gatgttaaca 5940
tccaacgtcg ctttcaggga tcccgaattc caagcttgga attcgggatc ctacaggcca 6000
aattcgctct tagccgtaca atattactca ccggtgcgat ccccccatcg taggtgaagg 6060
tggaaattaa tgatccatct tgagaccaca ggcccacaac agctaccagt ttcctcaagg 6120
gtccaccaaa aacgtaagcg cttacgtaca tggtcgataa gaaaaggcaa tttgtagatg 6180
ttaacatcca acgtcgcttt cagggatccc gaattccaag cttgggctgc aggtcaatcc 6240
cattgctttt gaagcagctc aacattgatc tctttctcga gggagatttt tcaaatcagt 6300
gcgcaagacg tgacgtaagt atccgagtca gtttttattt ttctactaat ttggtcgttt 6360
atttcggcgt gtaggacatg gcaaccgggc ctgaatttcg cgggtattct gtttctattc 6420
caactttttc ttgatccgca gccattaacg acttttgaat agatacgctg acacgccaag 6480
cctcgctagt caaaagtgta ccaaacaacg ctttacagca agaacggaat gcgcgtgacg 6540
ctcgcggtga cgccatttcg ccttttcaga aatggataaa tagccttgct tcctattata 6600
tcttcccaaa ttaccaatac attacactag catctgaatt tcataaccaa tctcgataca 6660
ccaaatcgag atctgcaggg atccccgatc atgcaaaaac tcattaactc agtgcaaaac 6720
tatgcctggg gcagcaaaac ggcgttgact gaactttatg gtatggaaaa tccgtccagc 6780
cagccgatgg ccgagctgtg gatgggcgca catccgaaaa gcagttcacg agtgcagaat 6840
gccgccggag atatcgtttc actgcgtgat gtgattgaga gtgataaatc gactctgctc 6900
ggagaggccg ttgccaaacg ctttggcgaa ctgcctttcc tgttcaaagt attatgcgca 6960
gcacagccac tctccattca ggttcatcca aacaaacaca attctgaaat cggttttgcc 7020
aaagaaaatg ccgcaggtat cccgatggat gccgccgagc gtaactataa agatcctaac 7080
cacaagccgg agctggtttt tgcgctgacg cctttccttg cgatgaacgc gtttcgtgaa 7140
ttttccgaga ttgtctccct actccagccg gtcgcaggtg cacatccggc gattgctcac 7200
tttttacaac agcctgatgc cgaacgttta agcgaactgt tcgccagcct gttgaatatg 7260
cagggtgaag aaaaatcccg cgcgctggcg attttaaaat cggccctcga tagccagcag 7320
ggtgaaccgt ggcaaacgat tcgtttaatt tctgaatttt acccggaaga cagcggtctg 7380
ttctccccgc tattgctgaa tgtggtgaaa ttgaaccctg gcgaagcgat gttcctgttc 7440
gctgaaacac cgcacgctta cctgcaaggc gtggcgctgg aagtgatggc aaactccgat 7500
aacgtgctgc gtgcgggtct gacgcctaaa tacattgata ttccggaact ggttgccaat 7560
gtgaaattcg aagccaaacc ggctaaccag ttgttgaccc agccggtgaa acaaggtgca 7620
gaactggact tcccgattcc agtggatgat tttgccttct cgctgcatga ccttagtgat 7680
aaagaaacca ccattagcca gcagagtgcc gccattttgt tctgcgtcga aggcgatgca 7740
acgttgtgga aaggttctca gcagttacag cttaaaccgg gtgaatcagc gtttattgcc 7800
gccaacgaat caccggtgac tgtcaaaggc cacggccgtt tagcgcgtgt ttacaacaag 7860
ctgtaagagc ttactgaaaa aattaacatc tcttgctaag ctgggagctc gtcgacggat 7920
cgaattcctg cagatcgttc aaacatttgg caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt 7980
gccggtcttg cgatgattat catataattt ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt 8040
aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga tgggttttta tgattagagt cccgcaatta 8100
tacatttaat acgcgataga aaacaaaata tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc 8160
gcggtgtcat ctatgttact agatctctag aactagtgga tctgctagcc ctgcaggaaa 8220
tttaccggtg cccgggcggc cagcatggcc gtatccgcaa tgtgttatta agttgtctaa 8280
gcgtcaattt gtttacacca caatatatcc tgccaccagc cagccaacag ctccccgacc 8340
ggcagctcgg cacaaaatca ccactcgata caggcagccc atcagaatta attctcatgt 8400
ttgacagctt atcatcgact gcacggtgca ccaatgcttc tggcgtcagg cagccatcgg 8460
aagctgtggt atggctgtgc aggtcgtaaa tcactgcata attcgtgtcg ctcaaggcgc 8520
actcccgttc tggataatgt tttttgcgcc gacatcataa cggttctggc aaatattctg 8580
aaatgagctg ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggaattgt gagcggataa 8640
caatttcaca caggaaacag accatgaggg aagcggtgat cgccgaagta tcgactcaac 8700
tatcagaggt agttggcgtc atcgagcgcc atctcgaacc gacgttgctg gccgtacatt 8760
tgtacggctc cgcagtggat ggcggcctga agccacacag tgatattgat ttgctggtta 8820
cggtgaccgt aaggcttgat gaaacaacgc ggcgagcttt gatcaacgac cttttggaaa 8880
cttcggcttc ccctggagag agcgagattc tccgcgctgt agaagtcacc attgttgtgc 8940
acgacgacat cattccgtgg cgttatccag ctaagcgcga actgcaattt ggagaatggc 9000
agcgcaatga cattcttgca ggtatcttcg agccagccac gatcgacatt gatctggcta 9060
tcttgctgac aaaagcaaga gaacatagcg ttgccttggt aggtccagcg gcggaggaac 9120
tctttgatcc ggttcctgaa caggatctat ttgaggcgct aaatgaaacc ttaacgctat 9180
ggaactcgcc gcccgactgg gctggcgatg agcgaaatgt agtgcttacg ttgtcccgca 9240
tttggtacag cgcagtaacc ggcaaaatcg cgccgaagga tgtcgctgcc gactgggcaa 9300
tggagcgcct gccggcccag tatcagcccg tcatacttga agctaggcag gcttatcttg 9360
gacaagaaga tcgcttggcc tcgcgcgcag atcagttgga agaatttgtt cactacgtga 9420
aaggcgagat caccaaggta gtcggcaaat aaagctctag tggatccccg aggaatcggc 9480
gtgacggtcg caaaccatcc ggcccggtac aaatcggcgc ggcgctgggt gatgacctgg 9540
tggagaagtt gaaggccgcg caggccgccc agcggcaacg catcgaggca gaagcacgcc 9600
ccggtgaatc gtggcaagcg gccgctgatc gaatccgcaa agaatcccgg caaccgccgg 9660
cagccggtgc gccgtcgatt aggaagccgc ccaagggcga cgagcaacca gattttttcg 9720
ttccgatgct ctatgacgtg ggcacccgcg atagtcgcag catcatggac gtggccgttt 9780
tccgtctgtc gaagcgtgac cgacgagctg gcgaggtgat ccgctacgag cttccagacg 9840
ggcacgtaga ggtttcagca gggccggccg gcatggccag tgtgtgggat tacgacctgg 9900
tactgatggc ggtttcccat ctaaccgaat ccatgaaccg ataccgggaa gggaagggag 9960
acaagcccgg ccgcgtgttc cgtccacacg ttgcggacgt actcaagttc tgccggcgag 10020
ccgatggcgg aaagcagaaa gacgacctgg tagaaacctg cattcggtta aacaccacgc 10080
acgttgccat gcagcgtacg aagaaggcca agaacggccg cctggtgacg gtatccgagg 10140
gtgaagcctt gattagccgc tacaagatcg taaagagcga aaccgggcgg ccggagtaca 10200
tcgagatcga gctagctgat tggatgtacc gcgagatcac agaaggcaag aacccggacg 10260
tgctgacggt tcaccccgat tactttttga tcgatcccgg catcggccgt tttctctacc 10320
gcctggcacg ccgcgccgca ggcaaggcag aagccagatg gttgttcaag acgatctacg 10380
aacgcagtgg cagcgccgga gagttcaaga agttctgttt caccgtgcgc aagctgatcg 10440
ggtcaaatga cctgccggag tacgatttga aggaggaggc ggggcaggct ggcccgatcc 10500
tagtcatgcg ctaccgcaac ctgatcgagg gcgaagcatc cgccggttcc taatgtacgg 10560
agcagatgct agggcaaatt gccctagcag gggaaaaagg tcgaaaaggt ctctttcctg 10620
tggatagcac gtacattggg aacccaaagc cgtacattgg gaaccggaac ccgtacattg 10680
ggaacccaaa gccgtacatt gggaaccggt cacacatgta agtgactgat ataaaagaga 10740
aaaaaggcga tttttccgcc taaaactctt taaaacttat taaaactctt aaaacccgcc 10800
tggcctgtgc ataactgtct ggccagcgca cagccgaaga gctgcaaaaa gcgcctaccc 10860
ttcggtcgct gcgctcccta cgccccgccg cttcgcgtcg gcctatcgcg gccgctggcc 10920
gctcaaaaat ggctggccta cggccaggca atctaccagg gcgcggacaa gccgcgccgt 10980
cgccactcga ccgccggcgc tgaggtctgc ctcgtgaaga aggtgttgct gactcatacc 11040
aggcctgaat cgccccatca tccagccaga aagtgaggga gccacggttg atgagagctt 11100
tgttgtaggt ggaccagttg gtgattttga acttttgctt tgccacggaa cggtctgcgt 11160
tgtcgggaag atgcgtgatc tgatccttca actcagcaaa agttcgattt attcaacaaa 11220
gccgccgtcc cgtcaagtca gcgtaatgct ctgccagtgt tacaaccaat taaccaattc 11280
tgattagaaa aactcatcga gcatcaaatg aaactgcaat ttattcatat caggattatc 11340
aataccatat ttttgaaaaa gccgtttctg taatgaagga gaaaactcac cgaggcagtt 11400
ccataggatg gcaagatcct ggtatcggtc tgcgattccg actcgtccaa catcaataca 11460
acctattaat ttcccctcgt caaaaataag gttatcaagt gagaaatcac catgagtgac 11520
gactgaatcc ggtgagaatg gcaaaagctc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga 11580
gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg 11640
tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag 11700
aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc 11760
gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca 11820
aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 11880
ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc 11940
tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca atgctcacgc tgtaggtatc 12000
tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc 12060
ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact 12120
tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg 12180
ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta 12240
tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca 12300
aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagae 12360
aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg 12420
aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc 12480
ttttgatccg gaattaattc ctgtggttgg catgcacata caaatggacg aacggataaa 12540
ccttttcacg cccttttaaa tatccgatta ttctaataaa cgctcttttc tcttaggttt 12600
acccgccaat atatcctgtc aaacactgat agtttaaact gaaggcggga aacgacaatc 12660
tgatcatgag cggagaatta agggagtcac gttatgaccc ccgccgatga cgcgggacaa 12720
gccgttttac gtttggaact gacagaaccg caacgctgca ggaatt12766
<210>26
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述ZUP1598
<400>26
catgccatgg atccaatggc cacgaattaa agctatcacg tc42
<210>27
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述ZUP1590
<400>27
acgcgtcgac cgcggattca aacgattatt aattacgata aaag 44
<210>28
<211>11461
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述pZU634
<220>
<221>启动子
<222>(55)..(1786)
<223>遍在蛋白3启动子加先导内含子
<220>
<221>misc_feature
<222>(1790)..(2574)
<223>PVY nt CP区
<220>
<221>内含子
<222>(2595)..(3036)
<223>actin2 intronL
<220>
<221>misc_feature
<222>complement((3057)..(3847))
<223>PVY nt cP区
<220>
<221>终止子
<222>(3855)..(4124)
<223>NOS终止子
<220>
<221>启动子
<222>(4193)..(5364)
<223>SMAS启动子
<220>
<221>gene
<222>(5386)..(6561)
<223>磷酸甘露糖异构酶A编码序列
<220>
<221>终止子
<222>(6623)..(6897)
<223>胭脂碱合酶终止子
<220>
<221>misc_feature
<222>(6949)..(7080)
<223>胭脂碱左边界片段
<220>
<221>gene
<222>(7359)..(8147)
<223>壮观霉素(aadA)编码区
<220>
<221>misc_structure
<222>(8157)..(10244)
<223>pVS1 ORI
<220>
<221>misc_structure
<222>(10245)..(11179)
<223>pUC19 ORI
<220>
<221>misc_feature
<222>(11195)..(11450)
<223>胭脂碱右边界片段
<220>
<221>茎-环
<222>(1790)..(3847)
<223>PVY反向重复区
<400>28
ggccgcagcg gccatttaaa tcaattgggc gcgccgaatt cgagctcggt acccgtaccg 60
gatttggagc caagtctcat aaacgccatt gtggaagaaa gtcttgagtt ggtggtaatg 120
taacagagta gtaagaacag agaagagaga gagtgtgaga tacatgaatt gtcgggcaac 180
aaaaatcctg aacatcttat tttagcaaag agaaagagtt ccgagtctgt agcagaagag 240
tgaggagaaa tttaagctct tggacttgtg aattgttccg cctcttgaat acttcttcaa 300
tcctcatata ttcttcttct atgttacctg aaaaccggca tttaatctcg cgggtttatt 360
ccggttcaac attttttttg ttttgagtta ttatctgggc ttaataacgc aggcctgaaa 420
taaattcaag gcccaactgt tttttttttt aagaagttgc tgttaaaaaa aaaaaaaggg 480
aattaacaac aacaacaaaa aaagataaag aaaataataa caattacttt aattgtagac 540
taaaaaaaca tagattttat catgaaaaaa agagaaaaga aataaaaact tggatcaaaa 600
aaaaaaacat acagatcttc taattattaa cttttcttaa aaattaggtc ctttttccca 660
acaattaggt ttagagtttt ggaattaaac caaaaagatt gttctaaaaa atactcaaat 720
ttggtagata agtttcctta ttttaattag tcaatggtag atactttttt ttcttttctt 780
tattagagta gattagaatc ttttatgcca agttttgata aattaaatca agaagataaa 840
ctatcataat caacatgaaa ttaaaagaaa aatctcatat atagtattag tattctctat 900
atatattatg attgcttatt cttaatgggt tgggttaacc aagacatagt cttaatggaa 960
agaatctttt ttgaactttt tccttattga ttaaattctt ctatagaaaa gaaagaaatt 1020
atttgaggaa aagtatatac aaaaagaaaa atagaaaaat gtcagtgaag cagatgtaat 1080
ggatgaccta atccaaccac caccatagga tgtttctact tgagtcggtc ttttaaaaac 1140
gcacggtgga aaatatgaca cgtatcatat gattccttcc tttagtttcg tgataataat 1200
cctcaactga tatcttcctt tttttgtttt ggctaaagat attttattct cattaataga 1260
aaagacggtt ttgggctttt ggtttgcgat ataaagaaga ccttcgtgtg gaagataata 1320
attcatcctt tcgtcttttt ctgactcttc aatctctccc aaagcctaaa gcgatctctg 1380
caaatctctc gcgactctct ctttcaaggt atattttctg attctttttg tttttgattc 1440
gtatctgatc tccaattttt gttatgtgga ttattgaatc ttttgtataa attgcttttg 1500
acaatattgt tcgtttcgtc aatccagctt ctaaattttg tcctgattac taagatatcg 1560
attcgtagtg tttacatctg tgtaatttct tgcttgattg tgaaattagg attttcaagg 1620
acgatctatt caatttttgt gttttctttg ttcgattctc tctgttttag gtttcttatg 1680
tttagatccg tttctctttg gtgttgtttt gatttctctt acggcttttg atttggtata 1740
tgttcgctga ttggtttcta cttgttctat tgttttattt caggtggggg atccaatggc 1800
cacgaattaa agctatcacg tccaaaatga gaatgcccaa gagtaagggt gcaactgtac 1860
taaatttgga acacctactc gagtatgctc cacagcaaat tgaaatctca aatactcgag 1920
caactcaatc acagtttgat acatggtatg aagcagtaca acttgcatac gacataggag 1980
aaactgaaat gccaactgtg atgaatgggc ttatggtttg gtgcattgaa aatggaacct 2040
cgccaaatat caatggagtt tgggttatga tggatggaga tgaacaagtc gaatacccac 2100
tgaaaccaat cgttgagaat gcaaaaccaa cacttaggca aatcatggca catttctcag 2160
atgttgcaga agcgtatata gaaatgcgca acaaaaagga accatatatg ccacgatatg 2220
gtttagttcg taatctgcgc gatggaagtt tggctcgcta tgcttttgac ttttatgaag 2280
ttacatcacg tacaccagtg agggctagag aggcacacat tcaaatgaag gccgcagctt 2340
taaaatcagc tcaatctcga cttttcggat tggatggtgg cattagtaca caagaggaaa 2400
acacagagag gcacaccacc gaggatgttt ctccaagtat gcatactcta cttggagtga 2460
agaacatgtg attgtagtgt ctttccggac gatatataga tatttatgtt tgcagtaagt 2520
attttggctt ttcctgtact acttttatcg taattaataa tcgtttgaat ccgcggccgc 2580
tctttctttc caaggtaata ggaactttct ggatctactt tatttgctgg atctcgatct 2640
tgttttctca atttccttga gatctggaat tcgtttaatt tggatctgtg aacctccact 2700
aaatcttttg gttttactag aatcgatcta agttgaccga tcagttagct cgattatagc 2760
taccagaatt tggcttgacc ttgatggaga gatccatgtt catgttacct gggaaatgat 2820
ttgtatatgt gaattgaaat ctgaactgtt gaagttagat tgaatctgaa cactgtcaat 2880
gttagattga atctgaacac tgtttaagtt agatgaagtt tgtgtataga ttcttcgaaa 2940
ctttaggatt tgtagtgtcg tacgttgaac agaaagctat ttctgattca atcagggttt 3000
atttgactgt attgaactct ttttgtgtgt ttgcagctca taaaaaatgg cgtcgaccgc 3060
ggattcaaac gattattaat tacgataaaa gtagtacagg aaaagccaaa atacttactg 3120
caaacataaa tatctatata tcgtccggaa agacactaca atcacatgtt cttcactcca 3180
agtagagtat gcatacttgg agaaacatcc tcggtggtgt gcctctctgt gttttcctct 3240
tgtgtactaa tgccaccatc caatccgaaa agtcgagatt gagctgattt taaagctgcg 3300
gccttcattt gaatgtgtgc ctctctagcc ctcactggtg tacgtgatgt aacttcataa 3360
aagtcaaaag catagcgagc caaacttcca tcgcgcagat tacgaactaa accatatcgt 3420
ggcatatatg gttccttttt gttgcgcatt tctatatacg cttctgcaac atctgagaaa 3480
tgtgccatga tttgcctaag tgttggtttt gcattctcaa cgattggttt cagtgggtat 3540
tcgacttgtt catctccatc catcataacc caaactccat tgatatttgg cgaggttcca 3600
ttttcaatgc accaaaccat aagcccattc atcacagttg gcatttcagt ttctcctatg 3660
tcgtatgcaa gttgtactgc ttcataccat gtatcaaact gtgattgagt tgctcgagta 3720
tttgagattt caatttgctg tggagcatac tcgagtaggt gttccaaatt tagtacagtt 3780
gcacccttac tcttgggcat tctcattttg gacgtgatag ctttaattcg tggccattgg 3840
atccatggtg atcactgcag atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa 3900
tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt 3960
aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc 4020
gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaacct aggataaatt 4080
atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga tctctagaaa gcttcgtacg ttaattaatt 4140
cgaatccgga gcggccgcag ggctagcatc gatggtaccg agctcgagac tatacaggcc 4200
aaattcgctc ttagccgtac aatattactc accggtgcga tgccccccat cgtaggtgaa 4260
ggtggaaatt aatgatccat cttgagacca caggcccaca acagctacca gtttcctcaa 4320
gggtccacca aaaacgtaag cgcttacgta catggtcgat aagaaaaggc aatttgtaga 4380
tgttaacatc caacgtcgct ttcagggatc ccgaattcca agcttggaat tcgggatcct 4440
acaggccaaa ttcgctctta gccgtacaat attactcacc ggtgcgatgc cccccatcgt 4500
aggtgaaggt ggaaattaat gatccatctt gagaccacag gcccacaaca gctaccagtt 4560
tcctcaaggg tccaccaaaa acgtaagcgc ttacgtacat ggtcgataag aaaaggcaat 4620
ttgtagatgt taacatccaa cgtcgctttc agggatcccg aattccaagc ttggaattcg 4680
ggatcctaca ggccaaattc gctcttagcc gtacaatatt actcaccggt gcgatccccc 4740
catcgtaggt gaaggtggaa attaatgatc catcttgaga ccacaggccc acaacagcta 4800
ccagtttcct caagggtcca ccaaaaacgt aagcgcttac gtacatggtc gataagaaaa 4860
ggcaatttgt agatgttaac atccaacgtc gctttcaggg atcccgaatt ccaagcttgg 4920
gctgcaggtc aatcccattg cttttgaagc agctcaacat tgatctcttt ctcgagggag 4980
atttttcaaa tcagtgcgca agacgtgacg taagtatccg agtcagtttt tatttttcta 5040
ctaatttggt cgtttatttc ggcgtgtagg acatggcaac cgggcctgaa tttcgcgggt 5100
attctgtttc tattccaact ttttcttgat ccgcagccat taacgacttt tgaatagata 5160
cgctgacacg ccaagcctcg ctagtcaaaa gtgtaccaaa caacgcttta cagcaagaac 5220
ggaatgcgcg tgacgctcgc ggtgacgcca tttcgccttt tcagaaatgg ataaatagcc 5280
ttgcttccta ttatatcttc ccaaattacc aatacattac actagcatct gaatttcata 5340
accaatctcg atacaccaaa tcgagatctg cagggatccc cgatcatgca aaaactcatt 5400
aactcagtgc aaaactatgc ctggggcagc aaaacggcgt tgactgaact ttatggtatg 5460
gaaaatccgt ccagccagcc gatggccgag ctgtggatgg gcgcacatcc gaaaagcagt 5520
tcacgagtgc agaatgccgc cggagatatc gtttcactgc gtgatgtgat tgagagtgat 5580
aaatcgactc tgctcggaga ggccgttgcc aaacgctttg gcgaactgcc tttcctgttc 5640
aaagtattat gcgcagcaca gccactctcc attcaggttc atccaaacaa acacaattct 5700
gaaatcggtt ttgccaaaga aaatgccgca ggtatcccga tggatgccgc cgagcgtaac 5760
tataaagatc ctaaccacaa gccggagctg gtttttgcgc tgacgccttt ccttgcgatg 5820
aacgcgtttc gtgaattttc cgagattgtc tccctactcc agccggtcgc aggtgcacat 5880
ccggcgattg ctcacttttt acaacagcct gatgccgaac gtttaagcga actgttcgcc 5940
agcctgttga atatgcaggg tgaagaaaaa tcccgcgcgc tggcgatttt aaaatcggcc 6000
ctcgatagcc agcagggtga accgtggcaa acgattcgtt taatttctga attttacccg 6060
gaagacagcg gtctgttctc cccgctattg ctgaatgtgg tgaaattgaa ccctggcgaa 6120
gcgatgttcc tgttcgctga aacaccgcac gcttacctgc aaggcgtggc gctggaagtg 6180
atggcaaact ccgataacgt gctgcgtgcg ggtctgacgc ctaaatacat tgatattccg 6240
gaactggttg ccaatgtgaa attcgaagcc aaaccggcta accagttgtt gacccagccg 6300
gtgaaacaag gtgcagaact ggacttcccg attccagtgg atgattttgc cttctcgctg 6360
catgacctta gtgataaaga aaccaccatt agccagcaga gtgccgccat tttgttctgc 6420
gtcgaaggcg atgcaacgtt gtggaaaggt tctcagcagt tacagcttaa accgggtgaa 6480
tcagcgttta ttgccgccaa cgaatcaccg gtgactgtca aaggccacgg ccgtttagcg 6540
cgtgtttaca acaagctgta agagcttact gaaaaaatta acatctcttg ctaagctggg 6600
agctcgtcga cggatcgaat tcctgcagat cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta 6660
agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg attatcatat aatttctgtt gaattacgtt 6720
aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt ttttatgatt 6780
agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag 6840
gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg ttactagatc tctagaacta gtggatctgc 6900
tagccctgca ggaaatttac cggtgcccgg gcggccagca tggccgtatc cgcaatgtgt 6960
tattaagttg tctaagcgtc aatttgttta caccacaata tatcctgcca ccagccagcc 7020
aacagctccc cgaccggcag ctcggcacaa aatcaccact cgatacaggc agcccatcag 7080
aattaattct catgtttgac agcttatcat cgactgcacg gtgcaccaat gcttctggcg 7140
tcaggcagcc atcggaagct gtggtatggc tgtgcaggtc gtaaatcact gcataattcg 7200
tgtcgctcaa ggcgcactcc cgttctggat aatgtttttt gcgccgacat cataacggtt 7260
ctggcaaata ttctgaaatg agctgttgac aattaatcat cggctcgtat aatgtgtgga 7320
attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagaccat gagggaagcg gtgatcgccg 7380
aagtatcgac tcaactatca gaggtagttg gcgtcatcga gcgccatctc gaaccgacgt 7440
tgctggccgt acatttgtac ggctccgcag tggatggcgg cctgaagcca cacagtgata 7500
ttgatttgct ggttacggtg accgtaaggc ttgatgaaac aacgcggcga gctttgatca 7560
acgacctttt ggaaacttcg gcttcccctg gagagagcga gattctccgc gctgtagaag 7620
tcaccattgt tgtgcacgac gacatcattc cgtggcgtta tccagctaag cgcgaactgc 7680
aatttggaga atggcagcgc aatgacattc ttgcaggtat cttcgagcca gccacgatcg 7740
acattgatct ggctatcttg ctgacaaaag caagagaaca tagcgttgcc ttggtaggtc 7800
cagcggcgga ggaactcttt gatccggttc ctgaacagga tctatttgag gcgctaaatg 7860
aaaccttaac gctatggaac tcgccgcccg actgggctgg cgatgagcga aatgtagtgc 7920
ttacgttgtc ccgcatttgg tacagcgcag taaccggcaa aatcgcgccg aaggatgtcg 7980
ctgccgactg ggcaatggag cgcctgccgg cccagtatca gcccgtcata cttgaagcta 8040
ggcaggctta tcttggacaa gaagatcgct tggcctcgcg cgcagatcag ttggaagaat 8100
ttgttcacta cgtgaaaggc gagatcacca aggtagtcgg caaataaagc tctagtggat 8160
ccccgaggaa tcggcgtgac ggtcgcaaac catccggccc ggtacaaatc ggcgcggcgc 8220
tgggtgatga cctggtggag aagttgaagg ccgcgcaggc cgcccagcgg caacgcatcg 8280
aggcagaagc acgccccggt gaatcgtggc aagcggccgc tgatcgaatc cgcaaagaat 8340
cccggcaacc gccggcagcc ggtgcgccgt cgattaggaa gccgcccaag ggcgacgagc 8400
aaccagattt tttcgttccg atgctctatg acgtgggcac ccgcgatagt cgcagcatca 8460
tggacgtggc cgttttccgt ctgtcgaagc gtgaccgacg agctggcgag gtgatccgct 8520
acgagcttcc agacgggcac gtagaggttt cagcagggcc ggccggcatg gccagtgtgt 8580
gggattacga cctggtactg atggcggttt cccatctaac cgaatccatg aaccgatacc 8640
gggaagggaa gggagacaag cccggccgcg tgttccgtcc acacgttgcg gacgtactca 8700
agttctgccg gcgagccgat ggcggaaagc agaaagacga cctggtagaa acctgcattc 8760
ggttaaacac cacgcacgtt gccatgcagc gtacgaagaa ggccaagaac ggccgcctgg 8820
tgacggtatc cgagggtgaa gccttgatta gccgctacaa gatcgtaaag agcgaaaccg 8880
ggcggccgga gtacatcgag atcgagctag ctgattggat gtaccgcgag atcacagaag 8940
gcaagaaccc ggacgtgctg acggttcacc ccgattactt tttgatcgat cccggcatcg 9000
gccgttttct ctaccgcctg gcacgccgcg ccgcaggcaa ggcagaagcc agatggttgt 9060
tcaagacgat ctacgaacgc agtggcagcg ccggagagtt caagaagttc tgtttcaccg 9120
tgcgcaagct gatcgggtca aatgacctgc cggagtacga tttgaaggag gaggcggggc 9180
aggctggccc gatcctagtc atgcgctacc gcaacctgat cgagggcgaa gcatccgccg 9240
gttcctaatg tacggagcag atgctagggc aaattgccct agcaggggaa aaaggtcgaa 9300
aaggtctctt tcctgtggat agcacgtaca ttgggaaccc aaagccgtac attgggaacc 9360
ggaacccgta cattgggaac ccaaagccgt acattgggaa ccggtcacac atgtaagtga 9420
ctgatataaa agagaaaaaa ggcgattttt ccgcctaaaa ctctttaaaa cttattaaaa 9480
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tcgcggccgc tggccgctca aaaatggctg gcctacggcc aggcaatcta ccagggcgcg 9660
gacaagccgc gccgtcgcca ctcgaccgcc ggcgctgagg tctgcctcgt gaagaaggtg 9720
ttgctgactc ataccaggcc tgaatcgccc catcatccag ccagaaagtg agggagccac 9780
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tcttcaccta gatccttttg atccggaatt aattcctgtg gttggcatgc acatacaaat 11220
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gatgacgcgg gacaagccgt tttacgtttg gaactgacag aaccgcaacg ctgcaggaat 11460
t 1146权利要求
1.一种给植物细胞赋予对选自由真菌传棒状病毒、马铃薯Y病毒、蕃茄斑萎病毒和黄瓜花叶病毒构成的组中的一种以上病毒的抗性或耐受性的方法，包括以下步骤向植物细胞中导入多于一对DNA序列，其中对于每一对，第一种DNA序列编码真菌传棒状病毒、马铃薯Y病毒、蕃茄斑萎病毒或黄瓜花叶病毒的病毒基因组的一部分，并且所述一对DNA序列的第二种DNA序列编码对于第一种DNA序列反义的序列，这样当在所述植物细胞中表达时，一对DNA序列的第一和第二种DNA序列所编码的RNA序列形成双链RNA分子，导致一旦病毒感染则产生该对的DNA序列所来源的病毒基因组的该部分的表达降低，并且其中被导入的DNA序列对中的至少2对来自所述组的不同病毒，产生所述植物细胞对所述组中一种以上的病毒的抗性或耐受性。
2.权利要求1的方法，其中一对的第一种DNA序列含有一种获自病毒外壳蛋白基因、病毒核壳蛋白基因、病毒复制酶基因、病毒运动蛋白基因或其部分的核苷酸序列。
3.权利要求1的方法，其中每一对的所述第一种DNA序列和所述第二种DNA序列稳定整合于所述细胞的基因组中。
4.权利要求1的方法，其中每一对的所述第一种DNA序列和所述第二种DNA序列包含于2种不同的DNA分子中。
5.权利要求4的方法，其中所述DNA序列还含有与所述第一种DNA序列有效连接的第一种启动子，和与第二种DNA序列有效连接的第二种启动子。
6.权利要求1的方法，其中一对的所述第一种DNA序列和所述第二种DNA序列包含于1种DNA分子中。
7.权利要求6的方法，其中一对的所述第一种DNA序列和所述第二种DNA序列包含于所述DNA分子的同一个DNA链中。
8.权利要求7的方法，其中由一对的所述第一种和第二种DNA序列编码的所述RNA序列包含于一个RNA分子中。
9.权利要求8的方法，其中所述RNA分子能够折叠，使得其中所含的RNA序列形成双链区。
10.权利要求8的方法，其中所述DNA分子还含有效连接至所述第一种和第二种DNA序列的一个启动子。
11.权利要求10的方法，其中所述启动子是异源启动子。
12.权利要求10的方法，其中所述启动子是组织特异性启动子。
13.权利要求10的方法，其中所述启动子是发育调节型启动子。
14.权利要求10的方法，其中所述启动子是组成型启动子。
15.权利要求10的方法，其中所述启动子是诱导型启动子。
16.权利要求8的方法，其中所述DNA分子在第一种和第二种DNA序列之间还含有一个接头。
17.权利要求16的方法，其中所述接头含有内含子加工信号。
18.权利要求7的方法，其中由第一种和第二种DNA序列编码的所述RNA序列包含于2种RNA分子中。
19.权利要求18的方法，其中所述第一种DNA序列有效连接至第一种启动子，并且所述第二种DNA序列有效连接至第二种启动子。
20.权利要求18的方法，其中所述第一种DNA序列和所述第二种DNA序列与一种双向启动子有效连接。
21.权利要求7的方法，其中所述第一种DNA序列和所述第二种DNA序列包含于所述DNA分子的互补链中。
22.权利要求21的方法，其中在所述DNA分子中，所述第一种DNA序列是所述第二种DNA序列的互补DNA链。
23.权利要求22的方法，其中所述DNA分子还含有与所述第一种DNA序列有效连接的第一种启动子。
24.通过权利要求1的方法得到的植物细胞，其中所述细胞对选自由真菌传棒状病毒、马铃薯Y病毒、蕃茄斑萎病毒和黄瓜花叶病毒构成的组中的一种以上病毒具有抗性或耐受性。
25.含有权利要求24的植物细胞的植物，其中所述植物对选自由真菌传棒状病毒、马铃薯Y病毒、蕃茄斑萎病毒和黄瓜花叶病毒构成的组中的一种以上病毒具有病毒抗性或耐受性。
26.从权利要求24的植物细胞再生的植物，其中所述植物对选自由真菌传棒状病毒、马铃薯Y病毒、蕃茄斑萎病毒和黄瓜花叶病毒构成的组中的一种以上病毒具有抗性或耐受性。
27.从权利要求26的植物产生的种子，其中所述种子对选自由真菌传棒状病毒、马铃薯Y病毒、蕃茄斑萎病毒和黄瓜花叶病毒构成的组中的一种以上的病毒具有抗性或耐受性，并且含有一对以上的所述DNA序列。
28.权利要求1的方法，其中所述DNA序列对中的一个含有从真菌传棒状病毒复制酶基因或其部分得到的核苷酸序列。
29.权利要求1的方法，其中所述DNA序列对中的一个含有从甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)得到的核苷酸序列。
30.权利要求29的方法，其中所述DNA序列对含有从甜菜坏死黄脉病毒或其部分的复制酶基因(RNA1)得到的核苷酸序列。
31.权利要求30的方法，其中来自BNYVV的复制酶的部分含有3’末端。
32.权利要求1的方法，其中所述DNA序列对中的一个含有从马铃薯Y病毒得到的核苷酸序列。
33.权利要求1的方法，其中所述DNA序列对中的一个含有从蕃茄斑萎病毒得到的核苷酸序列。
34.权利要求1的方法，其中所述DNA序列对中的一个含有从黄瓜花叶病毒得到的核苷酸序列。
35.从权利要求26的植物得到的后代，其中所述后代对选自由真菌传棒状病毒、马铃薯Y病毒、蕃茄斑萎病毒和黄瓜花叶病毒构成的组中的一种以上病毒具有抗性或耐受性，并且所述后代含有一对以上的所述DNA序列。
全文摘要
本发明涉及病毒基因表达的调节。本发明涉及利用基因的有义和反义RNA片段改变病毒基因在细胞中表达的方法。有义和反义RNA片段能够配对并形成双链RNA分子，从而改变基因的表达。本发明还涉及用本发明的方法获得的细胞、植物或动物，其后代和产生的种子。优选的，这些细胞、植物或动物为病毒抗性或耐受的。
文档编号C12N1/15GK101348785SQ20081021061
公开日2009年1月21日 申请日期2000年5月8日 优先权日1999年5月10日
发明者P·B·赫菲茨, D·A·帕顿, J·Z·莱文, Q·曲越, 哈恩 P·T·德, J·J·L·吉雷恩 申请人:辛根塔参与股份公司