专利名称：：降低核酸酶活性的制作方法
技术领域：
：本发明提供了一种灭活获得自发酵液的枯草杆菌蛋白酶溶液中的核酸酶活性且维持枯草杆菌蛋白酶大部分活性的方法。
背景技术：
：核酸酶活性在自然界中普遍存在，并通常存在于任何发酵液中。已知某些核酸酶非常稳定。有时，获得自发酵液的枯草杆菌蛋白酶产物无核酸酶活性是非常重要的；例如，在将DNA和RNA从组织或细胞系中分离时枯草杆菌蛋白酶产物用于去除核酸酶的情况，或在枯草杆菌蛋白酶产物用于分离PCR或RT-PCR模板的情况。自"BiotechnologyTechniques,第6巻，第1期，1992，第53-54页"可知，当加热至8(TC持续20分钟时，热稳定a淀粉酶可以保持其活性的〉90X，且同时失去所有DNase。枯草杆菌蛋白酶通常不能耐受这种长时间的8(TC热处理，且会丧失其活性的大部分。本发明的发明人发现了一种改进的灭活核酸酶活性且维持枯草杆菌蛋白酶大部分活性的方法。发明概述本发明的发明人发现了可以灭活获得自发酵液的枯草杆菌蛋白酶溶液中的核酸酶活性且维持枯草杆菌蛋白酶的大部分活性，由此，申请人请求保护—种用于降低获得自发酵液的枯草杆菌蛋白酶溶液中核酸酶活性的方法，其包括a)将所述枯草杆菌蛋白酶溶液的pH调节到pH8.5至pH10.5的范围；b)添加多元醇；c)将所述枯草杆菌蛋白酶溶液的温度调节到5(TC至8(TC的范围；借此，所述核酸酶活性被降低至低于起始值的5%，且所述枯草杆菌蛋白酶活性维持在高于起始值的80%。发明详述禾亥,核酸酶可以是产生感兴趣的枯草杆菌蛋白酶的微生物还产生的任何核酸酶，或者可以是在枯草杆菌蛋白酶产物制备过程中已污染枯草杆菌蛋白酶产物的外源性核酸酶。核酸酶可以是核糖核酸酶(RNase)或脱氧核糖核酸酶(DNase)，特别是核糖核酸酶(RNase)。核酸酶活性可以使用本领域已知的任何测定进行检测，例如，实施例1中描述的RNase活性测定。禾古對干帛舶iS本发明处理枯草杆菌蛋白酶。枯草杆菌蛋白酶包括(但不限于)属于NC-IUBMB酶分类EC3.4.21.62的任何酶。在本专利申请中，我们将枯草杆菌蛋白酶定义为一种肽酶，根据MEROPS肽酶分类3(http:〃merops.Sanger,ac.uk/_Release7.80)，该肽酶被描述为SB大族，S8A族。枯草杆菌蛋白酶在例如Barrett等人，1998年，Handbookofproteolyticenzymes.Academicpress,289-294页中有描述。蛋白酶活性可以使用其中应用底物的任何测定方法检测，所述底物包含与所讨论的蛋白酶特异性有关的肽键。PH测定和温度测定同样适用于所讨论的蛋白酶。对于本发明的和/或用于根据本发明用途的枯草杆菌蛋白酶的起源没有限制。因此，术语"枯草杆菌蛋白酶"不仅包括天然或野生型枯草杆菌蛋白酶，还包括任何表现蛋白酶活性的其突变体、变异体、片段等，以及合成的蛋白酶、改组的蛋白酶、和共有蛋白酶。按照本领域公知的方法可以制备这些基因工程蛋白酶，例如，通过定点诱变、通过PCR(使用包含所需突变的PCR片段作为PCR反应中的引物之一)、或者通过随机诱变。共有蛋白质的制备在例如EP897985中有描述。优选的枯草杆菌蛋白酶是选自以下的枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶BPN'、枯草杆菌蛋白酶147、枯草杆菌蛋白酶309以及枯草杆菌蛋白酶1168，包括表现蛋白酶活性的其任何突变体、变异体、片段等。这5种枯草杆菌蛋白酶的氨基酸序列均在W089/06279中有描述。优选可商购获得的枯草杆菌蛋白酶包括ALCALASE、SAVINASE、ESPERASE、EVERLASETM、0V0ZYMETM、C0R0NASETM、P0LARZYMETM、KANNASETM、LIQUANASE,禾卩RELASETM(NovozymesA/S)、MAXATASE、MAXACAl"、MAXAPEM、PR0PERASE、raRAFECT、PURAFECT0XPTM、FN2TM、FN3以及FN4TM(GenencorInternationalInc.)。产牛感兴趣的枯草杆菌g白酶的微牛物根据本发明，感兴趣的枯草杆菌蛋白酶优选在芽孢杆菌种中产生。优选地，芽孢杆菌种选自嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus咖yloliquefa)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、耐盐嗜碱芽孢杆菌(Bacillushalodurans)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearotherophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、以及苏芸金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)。优选地，感兴趣的枯草杆菌蛋白酶在克劳氏芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌中产生。公众可从多个保藏中心容易地获得这些种类的菌株，诸如，美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(DSM)、荷兰微生物菌种保藏中心(CBS)、美国农业研究菌种保藏中心(NRRL)。发酵液产生感兴趣的枯草杆菌蛋白酶的微生物可通过本领域已知的任何方法来发酵。发酵培养基可为在例如W098/37179中描述的基本培养基，或者发酵培养基可为包含复合氮和碳源的复合培养基，其中复合氮源可如W02004/003216中描述的被部分水解。发酵可以分批、重复分批、补料分批、重复补料_分批或连续发酵工艺来进行。在补料分批工艺中，在发酵之前，不将包含一种或多种结构和/或催化元素的化4合物添加至培养基中，或者，将部分包含一种或多种结构和/或催化元素的化合物添加至培养基中，在发酵工艺过程中分别地补入所有或其余部分的包含一种或多种结构和/或催化元素的化合物。可以将选择用于补料的化合物一起或彼此分开补入发酵工艺中。在重复补料分批或连续发酵工艺中，在发酵过程中，另外补入完全起始培养基。所述起始培养基可与结构元素补料一起或分开补入。在重复补料-分批工艺中，以规律的时间间隔去除部分包含生物质的发酵液，而在连续工艺中，部分发酵液的去除连续进行。由此，发酵工艺补充有对应于去除的发酵液量的一部分新鲜培养基。雜/險制聚感兴趣的枯草杆菌蛋白酶可以通过本领域已知的方法发酵，例如US3，723，250中描述的。感兴趣的枯草杆菌蛋白酶不限于，但通常将通过使用下列一些或所有步骤来回收1)预处理发酵液；2)从发酵液去除细胞和其他固体物质(初步分离)；3)过滤；4)浓縮(例如，超滤、结晶、蒸发);4b)新步骤核酸酶灭活步骤；5)过滤；6)进一步纯化(例如，盐沉淀、色谱法)；7)稳定和标准化。在预处理步骤中，将细胞和固体物质絮凝，且沉淀某些可溶组分。该步骤可如W096/38469中所描述进行。细胞和其他固体物质的去除可以通过离心、过滤或微滤进行。可以包括过滤步骤，以改进枯草杆菌蛋白酶溶液的澄清度和/或去除微生物细胞。浓縮步骤通常涉及超滤步骤或在减压下蒸发水。在浓縮过程中，可形成固体物质，其可通过进一步过滤去除。最后，可如本领域已知将枯草杆菌蛋白酶产物进一步纯化、稳定和标准化至所需浓度。除了上述列出的单元操作以外，还可以应用一些其他的回收工序和步骤，例如，使用活性碳和/或使用不同的吸收剂处理枯草杆菌蛋白酶溶液，以去除例如不期望的化合物，诸如负面活性(side-activity)和有色化合物。根据本发明的核酸酶灭活步骤通常在浓縮步骤后进行。核酸酶灭活工艺然后，将获得自发酵液的枯草杆菌蛋白酶溶液的pH(通常在絮凝、离心和超滤之后)调节到pH8.5至pH10.5范围的pH值，特别地调节到pH9.0至pH10.0范围的pH值。然后，添加一种或多种多元醇。多元醇可以在pH调节之前、同时或之后添加。然后，将获得自发酵液的枯草杆菌蛋白酶溶液的温度调节到5(TC至8(rC范围的温度，优选调节到55°C至75°C范围的温度，更优选调节到60°C至70°C范围的温度，特别地，调节到63t:至67t:范围的温度。通常，可以在高pH和高温下温育枯草杆菌蛋白酶溶液持续达30分钟的一段时间，5优选持续达15分钟的一段时间，更优选持续达10分钟的一段时间，特别地，持续达5分钟的一段时间。通过使用多元醇、高pH以及高温的组合，核酸酶活性被降低至低于起始值的5%，优选核酸酶活性被降低至低于起始值的4%，更优选核酸酶活性被降低至低于起始值的3%，甚至更优选核酸酶活性被降低至低于起始值的2%，特别地，核酸酶活性被降低至低于起始值的1%，尤其，核酸酶活性被降低至低于起始值的0.5%。通过使用多元醇、高pH以及高温的组合，枯草杆菌蛋白酶活性被维持在高于起始值的80%，优选枯草杆菌蛋白酶活性被维持在高于起始值的90%，更优选枯草杆菌蛋白酶活性被维持在高于起始值的91%，更优选枯草杆菌蛋白酶活性被维持在高于起始值的92%，更优选枯草杆菌蛋白酶活性被维持在高于起始值的93%，更优选枯草杆菌蛋白酶活性被维持在高于起始值的94%，更优选枯草杆菌蛋白酶活性被维持在高于起始值的95%，更优选枯草杆菌蛋白酶活性被维持在高于起始值的96%，更优选枯草杆菌蛋白酶活性被维持在高于起始值的97%，更优选枯草杆菌蛋白酶活性被维持在高于起始值的98%，更优选枯草杆菌蛋白酶活性被维持在高于起始值的99%，特别地，枯草杆菌蛋白酶活性被维持在高于起始值的99.5%。多元醇根据本发明，可以使用任何多元醇。然而，优选的是，选自1，2-丙二醇(单丙二醇或MPG)、1，3_丙二醇、丙三醇、乙二醇、木糖醇、阿拉伯糖醇、卫矛醇、甘露醇、赤藓醇、纤维二糖以及山梨糖醇，特别是MPG的多元醇。多元醇可以以10%(v/v)至60%(v/v)的浓度添加，优选以20%(v/v)至50%(v/v)的浓度添加，特别地，以30%(v/v)至50%(v/v)的浓度添加。下列实施例进一步描述了本发明，所述实施例并非意图以任何方式限制本发明所要求保护的范围。实施例1灭活获得自发酵液的枯草杆菌g白酶溶液中的RNase活件测定使用修改的Ambion测定方法分析枯草杆菌蛋白酶样品的RNase活性，并使用ProtazymeAK(交联和染色酪蛋白)测定分析枯草杆菌蛋白酶样品的蛋白酶活性。RNase活性测定该测定与来自AmbionInc.的RNase检测试剂盒:RNaseAlertQC系统(目录#1966)相比稍有修改。底物RNaseAlert底物，与荧光体和淬灭剂偶联的RNA(和试剂盒一起提供)。温度室温。测定缓冲液10XNucleaseAlert缓冲液和TE缓冲液(均和试剂盒一起提供)。无RNase的水(和试剂盒一起提供)。RNase去污染就在进行RNase活性测定之前，用RNaseZap(和试剂盒一起提供)来清洁吸量管和实验台。荧光计PolarStar，激发滤光片二485-P，发射滤光片二520-12，参数输出值=50，循环数=20，瞬时发光=4，迟延=0.3，循环时间=30秒。6[OO74]底物(工作溶液)将1管冻干的RNaseAlert底物溶解于1mlTE缓冲液(涡旋)并使用无RNase的水稀释5倍。将20微升10XNucleaseAlert缓冲液和80微升稀释的枯草杆菌蛋白酶样品(在无RNase的水中稀释)置于黑色微量滴定板的微孔中。通过添加100微升底物(工作溶液)启动测定，通过PolarStar设备监测荧光的增加，作为对RNase活性的检测值。缓冲液盲(无RNase的水)包括在该测定中(代替酶)。禾古對干飾讓舌翻惊:底物ProtazymeAK片(来自Megazyme)。温度37。C。测定缓冲液:50mMH3B03/NaOH，0.01%TritonX_100，pH9.0。通过轻柔搅拌将ProtazymeAK片(来自Megazyme)悬浮于2.Oml0.01%TritonX-100中。将500微升该悬浮液和500微升测定缓冲液混合于E卯endorf管中，并置于冰上。添加20微升稀释的枯草杆菌蛋白酶样品(在0.01%TritonX-100中稀释)。通过将E卯endorf管转移至E卯endorf热混合器来启动测定，将所述E卯endorf热混合器设置到测定温度。于E卯endorf热混合器上以最高振动速率(1400r.p.m.)温育管15分钟。通过将管转移回冰浴来终止温育。然后，在冰冻离心机中离心该管几分钟，将200微升上清液转移至微量滴定板。读取0D65。作为蛋白酶活性的检测值。缓冲液盲包括在该测定中(代替酶)。试验A:如本领域已知对枯草杆菌蛋白酶147进行发酵。如本领域已知对发酵液进行絮凝、离心以及超滤。超滤液的pH为大约6.5，超滤液的温度为20-25。C(室温)。使用27%(w/w)NaOH将超滤液的pH调节到pH9.0(RNase活性或枯草杆菌蛋白酶活性未丧失)。将200微升调节过pH的超滤液转移至E卯endorf管。在时间=0分钟时，将管转移至被预温至7(TC和1400r.p.m.的Eppendorf混合器。通过从Eppendorf混合器移除管而终止温育，并使得管达到室温(几分钟)。然后，将管转移至冰浴，并保持于冰上直至检测RNase和枯草杆菌蛋白酶活性。在温育0分钟、1分钟、2分钟、4分钟、6分钟以及8分钟之后检测RNase和枯草杆菌蛋白酶活性。结果示于表1中。表1:RNase活性和枯草杆菌蛋白酶活性(pH9.0和70°C)时间o分钟l分钟2分钟4分钟6分钟8分钟RNase活性100%86%55%8%0%0%枯草杆菌蛋白酶活性100%100%96%80%70%64%结论从表1可以看出，如果没有添加多元醇，可以灭活RNase(6分钟之后0%)，但是同时枯草杆菌蛋白酶活性被降低至起始值的70%。试验B:如本领域已知对枯草杆菌蛋白酶147进行发酵。如本领域已知对发酵液进行絮凝、离心以及超滤。超滤液的pH为大约6.5，超滤液的温度为20-25。C(室温)。使用27%(w/w)NaOH将超滤液的pH调节到pH9.0，并添加MPG至最终50%(v/v)的浓度。将200微升调节过pH的超滤液转移至Eppendorf管。在时间=0分钟时，将管转移至被预温至7(TC和1400r.p.m.的Eppendorf混合器。通过从Eppendorf混合器移除管而终止温育，并使得管到达室温(几分钟)。然后，将管转移至冰浴，并保持于冰上直至检测RNase和枯草杆菌蛋白酶活性。在温育0分钟、1分钟、2分钟、4分钟、6分钟以及8分钟之后检测RNase和枯草杆菌蛋白酶活性。结果示于表2中。表2:RNase活性和枯草杆菌蛋白酶活性(pH9.0和70°C)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>结论从表2可以看出，通过使用本发明的方法，可以完全灭活RNase(2分钟之后0%)，同时维持所有枯草杆菌蛋白酶活性。试验C:如本领域已知对枯草杆菌蛋白酶147进行发酵。如本领域已知对发酵液进行絮凝、离心以及超滤。超滤液的pH为大约6.5，超滤液的温度为20-25。C(室温)。使用27%(w/w)Na0H将超滤液的pH调节到pH10.0，并添加MPG至最终50%(v/v)的浓度。将200微升调节过pH的超滤液转移至Eppendorf管。在时间=0分钟时，将管转移至被预温至7(TC和1400r.p.m.的Eppendorf混合器。通过从Eppendorf混合器移除管而终止温育，并使得管到达室温(几分钟)。然后，将管转移至冰浴，并保持于冰上直至检测RNase和枯草杆菌蛋白酶活性。在温育0分钟、1分钟、2分钟、4分钟、6分钟以及8分钟之后检测RNase和枯草杆菌蛋白酶活性。结果示于表3中。表3:RNA酶和枯草杆菌蛋白酶活性(pH10.0和60°C)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>结论从表3可以看出，通过使用本发明的方法，可以完全灭活RNase，同时维持所有枯草杆菌蛋白酶活性(通过使用与试验B相比较高的pH但较低的温度)。权利要求一种用于降低获得自发酵液的枯草杆菌蛋白酶溶液中核酸酶活性的方法，其包括a)将所述枯草杆菌蛋白酶溶液的pH调节到pH8.5至pH10.5的范围；b)添加多元醇；c)将所述枯草杆菌蛋白酶溶液的温度调节到50℃至80℃的范围；借此，所述核酸酶活性被降低至低于起始值的5％，且所述枯草杆菌蛋白酶活性维持在高于起始值的80％。2.根据权利要求l的方法，其中，所述核酸酶是核糖核酸酶(RNase)或脱氧核糖核酸酶(DNase)。3.根据权利要求1的方法，其中，所述枯草杆菌蛋白酶选自枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶BPN'、枯草杆菌蛋白酶147、枯草杆菌蛋白酶309以及枯草杆菌蛋白酶I168。4.根据权利要求1的方法，其中，所述枯草杆菌蛋白酶由芽孢杆菌产生。5.根据权利要求1的方法，其中，所述枯草杆菌蛋白酶溶液是超滤过的发酵液。6.根据权利要求l的方法，其中，将所述枯草杆菌蛋白酶溶液的pH调节到pH9.0至pH10.0的范围。7.根据权利要求l的方法，其中，将所述枯草杆菌蛋白酶溶液的温度调节到6(TC至70。C的范围。8.根据权利要求1的方法，其中，所述核酸酶活性被降低至低于起始值的1%。9.根据权利要求l的方法，其中，所述枯草杆菌蛋白酶活性维持在高于起始值的90%。10.根据权利要求l的方法，其中，所述多元醇选自1，2-丙二醇(单丙二醇或MPG)、1，3-丙二醇、丙三醇、乙二醇、木糖醇、阿拉伯糖醇、卫矛醇、甘露醇、赤藓醇、纤维二糖以及山梨糖醇。11.根据权利要求l的方法，其中，在高PH和高温下温育所述枯草杆菌蛋白酶溶液持续达10分钟的一段时间。12.根据权利要求1的方法，其中，在步骤a)之前进行步骤b)。全文摘要一种用于降低获得自发酵液的枯草杆菌蛋白酶溶液中核酸酶活性的方法，其包括a)将所述枯草杆菌蛋白酶溶液的pH调节到pH8.5至pH10.5的范围；b)添加多元醇；c)将所述枯草杆菌蛋白酶溶液的温度调节到50℃至80℃的范围；借此，所述核酸酶活性被降低至低于起始值的5％，且所述枯草杆菌蛋白酶活性维持在高于起始值的80％。文档编号C12N9/22GK101778938SQ200880103327公开日2010年7月14日申请日期2008年8月19日优先权日2007年8月20日发明者彼得·R·奥斯特加德,金·U·汉森申请人:诺维信公司