专利名称：：大菱鲆荧光标记微卫星六重pcr家系识别方法
技术领域：
：本发明属于分子生物学遗传育种的分子标记辅助技术，是一种大菱鲆荧光标记孩i卫星六重PCR家系识别方法。背景纟支术大菱鲆(Sco/^/^a//H"s/af//ff"sL.)又名多宝鱼，是原产欧洲的一种优质海水养殖品种。我国于1992年引进养殖，为我国重要的海水养殖对象。利用分子标记辅助育种是大菱鲆良种选育重要途径之一，目前应用最为广泛的分子标记为微卫星。常规微卫星检测技术为单对引物进行单个位点的PCR扩增，其产物利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测，效率低，周期长。微卫星多重PCR是基于常规PCR技术，在一个PCR反应体系中加入多对特异性的微卫星引物，针对特定模板进行多个微卫星目的片段的PCR技术。大菱鲆多重PCR检测技术的特点是效率高、周期短，可以有效利用少量模板，提高微卫星标记大菱鲆遗传多样性分析、个体系谱识别及遗传连锁图谱构建的效率。目前国内外尚未见有大菱鲆;徵卫星多重PCR技术的发明及相关报道。与本发明类似的专利申请有"中国对虾微卫星三重PCR家系识别技术，，(孔杰，高煥，申请号200510042402、9)。该专利将开发的三对中国明对奸微卫星引物纳入到一个PCR反应体系中，利用片段大小区分不同产物。其优点在于三重PCR提高了效率；缺点在于三重PCR提高的效率有限，不同目的片段的PCR产物靠目测难以区分。
发明内容本发明的目的是通过不同荧光标记的引物组合，结合优化PCR反应条件，建立一个大菱鲆六重^f效卫星PCR反应及^r测体系。为大菱鲆分子标记辅助育种提供高效、准确的微卫星标记检测技术。本发明是通过如下技术方法实现的本发明利用三种荧光(6FAM,HEX和NED)对六对引物才艮据其PCR扩增产物大小进^f亍了两两标记。利用引物3设计软件排除这六对引物在PCR反应过程中形成二聚体的可能，组合这六对引物于同一个PCR反应体系中，反应体系中包括ROX焚光分子内标。调整PCR反应体系，建立这六对引物可在同一个PCR反应体系中同时扩增的参数和合适的PCR反应程序。PCR产物经ABI3130或类似基因分析仪根据荧光标记进行大菱鲆六个微卫星位点分析。相同荧光标记的产物通过片段大小进行判断，对大菱鲆不同家系进行区分或者进行个体间及亲子之间的识别和鉴定。六对微卫星引物的序列如下YSKrOl正向序列为(5'-3，)CGAGTCAACAGCCATCAAGC，反向序列为(5'-3，)AGGTGGTGGACCGTTCAAGT;YSKr02正向序列为(5'-3，)TCGTTGCCGTAGAAACCATC,反向序列为(5'-3，)CTGTCTGGAGCCCAAACCT;YSKrl9正向序列为(5'-3，)TTGTGGTGCTGTGAATGTGTG,反向序列为(5'-3,):AGTGTTATGATATGTGGAGGC;YSKr29正向序列为(5'-3，)GCCTTGCTGTGATTCTTTG,反向序列为(5'-3，)AGTGCTGCTTGTCTCTTGTG;YSKr39正向序列为(5'-3，)GAGGGTTGTTATTGTGGAG，反向序列为(5'-3，)GAGGACAAAGTGACGACG;YSKr61正向序列为(5'-3，)CACCTCACTGCCCACTGA,反向序列为(5'-3，)TCTGGATGTTTCTCTGACTT;本发明的特点和效果本方法将需要分别进行六次的大菱鲆微卫星PCR扩增和4会测，整合为一次的六重PCR反应体系和一次的产物;险测，可大大提高大菱鲆微卫星标记的检测效率，组合的六重PCR技术的大菱鲆单亲排除率为99.63%,个体识别力99.99%。结合三种荧光标记，可提高产物分辨程度，避免常规检测中由于不同位点产物片段大小接近时无法有效区分的弊病。利用该六重PCR反应体系进行大菱鲆孩t卫星标记检测，可以大大节约包括PCR实验耗材、PCR试剂、电泳检测及时间成本等各项内容。具体实施例方式大菱鲆微卫星标记的开发是我们利用"菌落富集-探针杂交"策略测序获得的，对重复序列进行引物设计从而实现对大菱鲆特定微卫星位点的PCR扩增。首先利用引物设计软件分析排除这六对引物彼此形成引物二聚体、发荚结构的可能，对于检测到的严重影响复合PCR反应进行的二聚体及发荚结构的引物进行修改，使其完全适合复合PCR反应体系。对扩增产物大小差异显著的(>50bp)任意两对引物进4亍相同的单引物荧光标记，具体为YSKrOl和YSKrl9两条引物进4亍6FAM焚光标记；YSKr02和YSKr29两条引物进行HEX荧光标记；YSKr39和YSKr61两条引物进行NED荧光标记。组合这六对引物于同一个PCR反应体系，并在其中增加ROX荧光分子内标。调整PCR反应体系，建立这六对引物可在同一个PCR反应体系中同时扩增的参数，这些参数是10xBuffer3pl(内含750mMTris-HC1(pH8.8),200mM(NH4)2S04,0.1%Tween20),0.9mMMg2+,0.2mMdNTP，六对引物正向及反向序列各O.20pM，2.0unitDNA聚合酶，补充灭菌双蒸水^f吏PCR反应体系达到30pl。PCR反应程序为95。C预变性5min,随后的25个PCR循环为95。C变性45s、61。C退火45s、72。C延伸45s，最后于72。C延伸5min。PCR反应过程在常规PCR仪上进行。PCR产物经ABI3130或类似基因分析仪根据焚光标记进行微卫星位点分析。相同荧光标记的产物通过片段大小进行判断。六对微卫星引物的序列如下YSKrOl正向序列为(5'-3，):CGAGTCAACAGCCATCAAGC，反向序列为(5'-3，)AGGTGGTGGACCGTTCAAGT;YSKr02正向序列为(5'-3，)TCGTTGCCGTAGAAACCATC,反向序列为(5'-3，)CTGTCTGGAGCCCAAACCT;YSKrl9正向序列为(5'-3，):TTGTGGTGCTGTGAATGTGTG，反向序列为(5'-3，)AGTGTTATGATATGTGGAGGC;YSKr29正向序列为(5'-3，):GCCTTGCTGTGATTCTTTG,反向序列为(5'-3，)AGTGCTGCTTGTCTCTTGTG;YSKr39正向序列为(5'-3，):GAGGGTTGTTATTGTGGAG,反向序列为(5'-3，)GAGGACAAAGTGACGACG;YSKr61正向序列为(5'-3，):CACCTCACTGCCCACTGA,反向序列为(5'-3，)TCTGGATGTTTCTCTGACTT;才支术指标YSKrOl，YSKr02，YSKrl9，YSKr29，YSKr39和YSKr61位点的目的片-炎分别为244bp，84bp，232bp，133bp,240bp和157bp,具有的等位基因数分别为8,7，5,3,5和5个，由此组合的六重PCR技术的大菱鲆单亲排除率为99.63%，个体识别力99.99%。应用范围可以通过此六重PCR技术，经过常规方式PCR扩增，结合基因分析仪一次性获得六个微卫星位点上的大菱鲆个体的遗传信息，通过这些不同个体间显示的遗传信息差异来进行个体和家系系谱识别。育种中的应用l)获得了家系个体六个微卫星位点的遗传信息，可以推测缺失的父本或母本的基因型或父母本的基因型组合；2)获得群体六个微卫星位点的遗传信息，可以对该群体按照家系组成进行归类；3)获得亲本之一或父母本六个微卫星位点的遗传信息，可以对混养的后代进行遗传分析，确定或排除后代是否为检测亲本的子代个体。<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>权利要求1、一种大菱鲆荧光标记微卫星六重PCR家系识别方法，其特征在于它的方法是利用三种荧光6FAM，HEX和NED对六对引物根据其PCR扩增产物大小进行了两两标记；利用引物设计软件排除这六对引物在PCR反应过程中形成二聚体的可能，组合这六对引物于同一个PCR反应体系中，反应体系中包括ROX荧光分子内标；调整PCR反应体系，建立这六对引物可在同一个PCR反应体系中同时扩增的参数和合适的PCR反应程序；PCR产物经ABI3130或类似基因分析仪根据荧光标记进行大菱鲆六个微卫星位点分析，相同荧光标记的产物通过片段大小进行判断，对大菱鲆不同家系进行区分或者进行个体间及亲子之间的识别和鉴定；所述的六对微卫星引物序列是YSKr01正向序列为(5‘-3’)CGAGTCAACAGCCATCAAGC，反向序列为(5‘-3’)AGGTGGTGGACCGTTCAAGT；YSKr02正向序列为(5‘-3’)TCGTTGCCGTAGAAACCATC，反向序列为(5‘-3’)CTGTCTGGAGCCCAAACCT；YSKr19正向序列为(5‘-3’)TTGTGGTGCTGTGAATGTGTG，反向序列为(5‘-3’)AGTGTTATGATATGTGGAGGC；YSKr29正向序列为(5‘-3’)GCCTTGCTGTGATTCTTTG，反向序列为(5‘-3’)AGTGCTGCTTGTCTCTTGTG；YSKr39正向序列为(5‘-3’)GAGGGTTGTTATTGTGGAG，反向序列为(5‘-3’)GAGGACAAAGTGACGACG；YSKr61正向序列为(5‘-3’)CACCTCACTGCCCACTGA，反向序列为(5‘-3’)TCTGGATGTTTCTCTGACTT。全文摘要一种大菱鲆荧光标记微卫星六重PCR家系识别方法，利用三种荧光(6FAM，HEX和NED)对六对引物根据其PCR扩增产物大小进行了两两标记；利用引物设计软件排除这六对引物在PCR反应过程中形成二聚体的可能，组合这六对引物于同一个PCR反应体系中，反应体系中包括ROX荧光分子内标；调整PCR反应体系，建立这六对引物可在同一个PCR反应体系中同时扩增的参数和合适的PCR反应程序；PCR产物经ABI3130或类似基因分析仪根据荧光标记进行大菱鲆六个微卫星位点分析。此六重PCR技术可提高大菱鲆微卫星标记的检测效率，单亲排除率为99.63％，个体识别力99.99％，可以对大菱鲆不同家系进行区分或者进行个体间及亲子之间的识别和鉴定。文档编号C12Q1/68GK101638692SQ20091020330公开日2010年2月3日申请日期2009年5月25日优先权日2009年5月25日发明者王伟继,阮晓红申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所