包含丝氨酸蛋白酶变体的组合物和方法

专利名称：包含丝氨酸蛋白酶变体的组合物和方法
技术领域：
本发明提供了蛋白质改造的方法，以及从所述方法产生的丝氨酸蛋白酶。具体而言，本发明提供相比参照丝氨酸蛋白酶具有一个或多个取代的丝氨酸蛋白酶。此外，本发明提供包含这类丝氨酸蛋白酶变体的组合物。在一些实施方案中，本发明提供了包含至少一种的这类丝氨酸蛋白酶变体的清洁组合物。
背景技术：
各种蛋白质改造方法是本领域技术人员已知的。一般而言，为了获得理想的蛋白质性质而修饰蛋白质。在大部分方法中，突变编码蛋白质的克隆基因的核苷酸序列，并表达修饰的基因来产生变体，筛选所述变体的目标活性。通常，比较变体的性质与野生型蛋白质的性质。
从历史的观点而言，所探讨的蛋白质设计方法等价于这样的问题，即在所有的蛋白质空间(space)中发现一条适合理想应用的最佳序列。这一问题非常棘手，是“NP困难 (NP-hard)的”。在复杂性理论中，定义为P类的问题被认为是简单有效的，其解法存在多项式时间算法。NP困难问题是有效的多项式时间算法目前尚未知的问题，而如果可以解决任何NP困难问题，则可以解决所有的NP困难问题(见，例如，Pierce和Winfree，Protein Engineer. , 15 :779_782，200 。目前用于建立和筛选文库的策略一般涉及在整个序列中随机产生蛋白质序列多样性，或者在蛋白质的定义位置上以受控的随机方式产生所述多样性。这类文库一般具有对主要的目的性质是“阴性”的大量成员，为了发现相对少量的阳性突变，需要筛选很大数量。一般而言，忽视阴性突变，仅获得阳性成员的序列信息。
饱和诱变(Estell等，在 World Biotech Report 1984，第 2 卷，USA, Online Publications，London，第 181-187 页，1984 ；和 Wells 等，Gene，34 :315-323,1985 中)是一种技术，可用于搜索蛋白空间中优化蛋白质的若干性质的突变。一些小组已经开发了鉴别通过饱和诱变所改变的位点的策略(Reetz等，Angew. Chem. Int Edn, 44 =4192-4196,2005 ； Kato 等，J MolBiol，351 :683-692，2005 ；和 Sandberg 等，Proc Natl Acad Sci USA, 90 8367-8371，1993)，但尚未提出用于位点鉴别的一般系统。
此外，由于大部分蛋白质改造方法产生大量的氨基酸突变选型，故产生理想的蛋白质性质一般需要筛选大量的变体。一般而言，重复多次筛选来产生有益的变体。因而，大部分方法是耗费劳动力和时间的。本领域对于有效的且产生理想结果的蛋白质改造方法存在持续的需求。
发明概述 本发明提供了用于蛋白质改造的方法，具体而言，本发明提供了利用位点评估文库(site evaluation library)的方法。特别是，本发明提供了使用所获得的关于多种理想性质的信息的手段，为了理性而有效的设计将优化所述性质的文库。在一些实施方案中， 本发明提供了设计文库的手段，所述文库针对至少两种理想性质进行了改良。本发明还提供了相比参照的丝氨酸蛋白质，具有一个或多个取代的丝氨酸蛋白酶变体，所述变体是使用本文所述的蛋白质改造方法产生的。
本发明提供了鉴别蛋白质的氨基酸序列内的位置的手段，所述位置涉及改善蛋白质的理想性质。在一些特别优选的实施方案中，本发明提供了为了产生具有这类理想性质以及改良性质的蛋白质，确定何种突变是期望的之手段。在其他一些特别优选的实施方案中，本发明提供了鉴别氨基酸位置和突变的手段，所述位置和突变比野生型蛋白质改善了特定的百分比(例如，一种性质比野生型的110%好)。在其他的优选实施方案中，本发明提供了鉴别突变的手段，所述突变提供了至少一种极大改良的性质和至少一种不显著差于野生型蛋白质的其他性质(例如，一种性质比野生型的110%好，另一种性质不比野生型的 90%差)。在其他的优选实施方案中，基于该信息构建文库。在一些实施方案中，使用所有已鉴别的突变构建文库，而在一些其他的实施方案中，使用所鉴别突变的子集来构建文库。 实际上，文库并非意在限于任何特定的突变数量和/或类型。
本发明提供了用于蛋白质过程的方法，其包括步骤提供蛋白质变体的文库；在目标测试中，测试蛋白质变体文库的至少一种目标性质；针对至少一种目标性质鉴别值域； 鉴别值域内与目标测试的有利结果相关的最小值；以及，提供复数的具有至少一种突变的蛋白质变体，所述突变在至少一种目标性质的域中高于最小值，从而提供包含至少一种突变的蛋白质变体文库，其中所述文库富含在目标测试中具有有利结果的成员。在一些实施方案中，与上文第一步中所述测试中观察到的最大值相比，有利的结果对应的值大于大约 50%、约60%、约70%、约80%、约90%或约95%。在一些可选的实施方案中，在本发明的方法中使用一种以上的目标测试。在一些优选的实施方案中，所述蛋白质是酶。在一些特别优选的实施方案中，所述酶选自蛋白酶、转移酶、金属蛋白酶、酯酶、淀粉酶、纤维素酶、氧化酶、角质酶(cutinase)和脂肪酶。
本发明还提供了蛋白质改造的方法，其包括步骤提高野生型蛋白质，和野生型蛋白质的蛋白质变体文库；在目标测试中，针对至少一种目标性质，测试蛋白质变体和野生型蛋白质的文库；鉴别至少一种目标性质的值域；鉴别与目标测试的有利结果相关的值域中的最小值；鉴别相比从野生型获得的结果，具有有利结果的蛋白质变体，其中有利的结果是改良的目标性质；和提供复数的蛋白质变体，所述变体高于至少一种目标性质的域中的最小值，从而提供改良的蛋白质变体的文库，所述文库富含在目标测试中具有有利结果的成员。在一些优选的实施方案中，该方法进一步包括确定性能指数的步骤，其中所述性能指数是通过每种改良的蛋白质变体所获得的值除以野生型蛋白质所获得的值来确定的。在一些特别优选的实施方案中，该方法进一步包括鉴别改良的蛋白质变体的步骤，其中改良的蛋白质变体在目标测试中达到大于约1.1的性能指数值。在一些其他的实施方案中，所述蛋白质是酶。在一些特别优选的实施方案中，所述酶选自蛋白酶、转移酶、金属蛋白酶、酯酶、 淀粉酶、纤维素酶、氧化酶、角质酶和脂肪酶。在一些可选的实施方案中，所述蛋白质选自抗体和生长因子。在其他的优选的实施方案中，野生型蛋白质是酶的成熟形式，所述酶选自蛋白酶、转移酶、金属蛋白酶、酯酶、淀粉酶、纤维素酶、氧化酶、角质酶和脂肪酶。在一些优选的实施方案中，目标性质选自电荷、洗涤性能、硬表面清洁性能、热稳定性、储藏稳定性、去垢剂稳定性、底物结合、酶抑制、表达水平、反应速率，和底物降解。在一些实施方案中，野生型蛋白质和蛋白质变体是至少一种去垢剂组合物的组分。在一些优选的实施方案中，在配制成粉末状或液体去垢剂的去垢剂组合物中测试洗涤性能，所述粉末状或液体去垢剂具有在约5和约12.0之间的pH。
本发明还提供了产生参照蛋白质在蛋白质折叠(protein fold)中的改良变体的方法，其包括在目标测定中，测定测试蛋白质在蛋白质折叠中的多个变体，所述蛋白质折叠覆盖一系列的目标性质；鉴别与目标测定的有利结果相关的一系列的目标性质中的最小值；测定目标测定中蛋白质折叠的参照蛋白质；通过将氨基酸取代导入参照蛋白质中，产生参照蛋白质的改良变体，使得改良变体高于目标性质域的最小值。在一些优选的实施方案中，参照蛋白质和测试蛋白质是不同的。在一些实施方案中，该方法进一步包括确定性能指数的步骤，其中所述性能指数是通过改良的蛋白质变体所获得的值除以参照蛋白质所获得的值来确定的。在一些实施方案中，所述测试蛋白质和参照蛋白质是酶。在一些特别优选的实施方案中，所述酶选自蛋白酶、转移酶、金属蛋白酶、酯酶、淀粉酶、纤维素酶、氧化酶、角质酶和脂肪酶。在一些可选的实施方案中，所述测试和参照蛋白质选自抗体和生长因子。在其他的优选的实施方案中，参照蛋白质是酶的成熟形式，所述酶选自蛋白酶、转移酶、 金属蛋白酶、酯酶、淀粉酶、纤维素酶、氧化酶、角质酶和脂肪酶。在一些优选的实施方案中， 目标性质选自电荷、洗涤性能、硬表面清洁性能、热稳定性、储藏稳定性、去垢剂稳定性、底物结合、酶抑制、表达水平、反应速率，和底物降解。在一些实施方案中，测试和参照蛋白质是至少一种去垢剂组合物的组分。在一些可选的实施方案中，改良的蛋白质变体是去垢剂组合物的组分。在一些优选的实施方案中，在配制成粉末状或液体去垢剂的去垢剂组合物中测试洗涤性能，所述粉末状或液体去垢剂具有在约5和约12. 0之间的pH。
在一些实施方案中，本发明提供了包含至少一种本文所述丝氨酸蛋白酶变体的清洁组合物。在一些优选的实施方案中，清洁组合物是衣物洗涤去垢剂。在这类实施方案的子集中，衣物洗涤去垢剂是冷水型去垢剂、低PH型去垢剂，或压缩型去垢剂。在其他实施方案中，清洁组合物是餐具洗涤去垢剂。在一些实施方案中，餐具洗涤去垢剂是无磷去垢剂， 而在其他实施方案中，餐具洗涤去垢剂是含磷去垢剂。在一些优选的实施方案中，清洁组合物进一步包含至少一种其他的酶，在特别优选的实施方案中，所述酶选自中性金属蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶(marmanase)、阿拉伯糖酶 (arabinase)、半乳聚糖酶(galactanase)、木聚糖酶、氧化酶和过氧化物酶。本发明还提供了编码丝氨酸蛋白酶变体的分离的核酸，包含所述核酸的表达载体，和包含所述表达载体的宿主细胞。
此外，本发明提供了产生芽孢杆菌属(Bacillus)丝氨酸蛋白酶的丝氨酸蛋白酶变体的方法，其包括用包含编码丝氨酸蛋白酶变体的核酸的表达载体转化宿主细胞；和在适合丝氨酸蛋白酶变体产生的条件下培养转化的宿主细胞。在一些实施方案中，该方法进一步包括收获所产生的丝氨酸蛋白酶变体的步骤。在一些实施方案中，宿主细胞是芽孢杆菌属物种，而在这类实施方案的子集中，芽孢杆菌属物种是枯草芽孢杆菌(B. subtilis)。 进一步的，本发明提供了清洁的方法，其包括将包含织物的表面和/或物品与清洁组合物接触的步骤，所述清洁组合物包含分离的丝氨酸蛋白酶变体。在一些可选的方法中，本发明提供了清洁的方法，其包括将包含餐具的表面和/或物品与清洁组合物接触的步骤，所述清洁组合物包含分离的丝氨酸蛋白酶变体。
此外，本发明提供了用于蛋白质改造的方法，其包括步骤a)提供复数的位点评估文库(SEL)，每个文库包含复数的蛋白酶变体，所述蛋白酶变体在与蛋白酶相同的氨基酸位置上具有不同的取代；b)在目标性质的测试中，测试SEL的蛋白酶变体和标准蛋白酶；c) 确定所测试的每种蛋白酶变体的性能指数(PI) ；d)鉴别两个或多个氨基酸位置作为非限制性位置，其中复数的蛋白酶变体中的至少一个在2个SEL中的每一个都具有大于约0. 5 的PI ；和f)提供多个突变文库，所述文库包含复数的多取代蛋白酶变体，每个所述变体在两个或多个非限制性位置上包含取代。在一些实施方案中，该测试包括两个或多个选自菌株去除测定(微样品)、LAS稳定性测定、去垢剂稳定性测定和比活测定的不同测定。在一些其他实施方案中，可使用其他的和/或可选的测定方法。
在一些其他实施方案中，本发明提供了这样的方法，所述方法用于产生芽孢杆菌属丝氨酸蛋白酶的多取代丝氨酸蛋白酶变体，其包括在第一种性质的第一测试和第二种性质的第二测试中，测试复数的单取代丝氨酸蛋白酶变体，其中，参照丝氨酸蛋白酶的性质在每种测试中给定为值1.0，有利的第一或第二性质具有大于1. 0的值，而非常不利的第一或第二性质具有小于0. 80的值，或者在一些优选的实施方案中，小于约0. 60 ；鉴别至少一个在单取代的丝氨酸蛋白酶变体中的取代，所述变体是与有利的第一性质相关的，并且不与非常不利的第二性质相关；鉴别至少一个单取代丝氨酸蛋白酶变体中的取代，所述变体是与有利的第二性质相关的，并且不与非常不利的第一性质相关；将来自在先步骤中的取代导入丝氨酸蛋白酶中，产生多取代的丝氨酸蛋白酶变体。在一些实施方案中，该方法进一步包括在第一测试和第二测试中测试多取代的丝氨酸蛋白酶变体，其中，改良的丝氨酸蛋白酶变体在第一和第二测试中都获得大于约1. 0的值，或者在第一测试中获得大于约1. 0 的值，而在第二测试中获得在约0.80至约1.0的值。在一些实施方案中，该方法进一步包括产生改良的丝氨酸蛋白酶变体在一些实施方案中，第一和第二性质是阴性相关的。在一些实施方案中，有利的第一或第二性质具有大于约1. 2的值。在一些实施方案中，非常不利的第一或第二性质具有小于约0.40的值。在一些实施方案中，第一性质是稳定性，而第二性质是洗涤性能。在这类的子集中，稳定性包括在去垢剂中的稳定性，而洗涤性能包括在去垢剂中的血液、奶渍、墨水(BMI)洗涤性能。在一些实施方案中，参照细菌丝氨酸蛋白酶是解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)丝氨酸蛋白酶BPN’的野生型的成熟形式，具有 SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列。在其他实施方案中，参照细菌丝氨酸蛋白酶是GG36丝氨酸蛋白酶的野生型，具有SEQ ID NO :2提出的氨基酸序列(即，用于产生“GG36变体”的参照细菌丝氨酸蛋白酶)。在本发明的一些实施方案中，在具有在约5和约12. 0之间的pH 的粉末状或液体去垢剂组合物中测试洗涤性能。不旨在将这些步骤限定到上面列出的精确的顺序，因为发现在本发明中使用任何合适的顺序。但是，在一些优选的实施方案中，取代位于这样的参照丝氨酸蛋白酶的位置上，所述参照丝氨酸蛋白酶具有大于约50%或大于约 65%的溶剂可及表面(SAS)。
此外，本发明提供了枯草杆菌蛋白酶变体，其中变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且在一个或多个(优选，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个)位置上包含取代，所述位置选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18，19，20，21，22，24，25，26，27，28，29，30，31，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50， 51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，66，67，68，69，71，72，73，74，75，76，77，78， 79，80，81，82，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103， 104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122， 123，124，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142， 143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161， 162，163，164，165，166，167，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181， 182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199,200, 201，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220， 222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240， 241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257、258、259、 260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274 和 275，其中所述位置对照SEQ IDNO 1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
在一些优选的实施方案中，取代包括一个或多个的:X001A,X001C,X001E,X001F,X001G,X001H,X001I,X001K,X001L,X001N,X001P,X001Q,X001R,X001S,X001T,X001V,X001Y,X002A,X002C,X002E,X002G,X002K,X002L,X002M,X002N,X002P,X002Q,X002R,X002S,X002T,X002V,X002W,X002Y,X003D,X003E,X003F,X003G,X003H,X003I,X003L,X003M,X003N,X003P,X003R,X003S,X003T,X003V,X003W,X003Y,X004A,X004C,X004D,X004E,X004F,X004G,X004H,X004K,X004L,X004N,X004P,X004R,X004S,X004T,X004V,X004W,X005A,X005C,X005D,X005E,X005G,X005I,X005M,X005P,X005Q,X005S,X005T,X005W,X005Y,X006A,X006D,X006E,X006M,X006W,X007A,X007C,X007D,X007G,X007H,X007N,X007P,X007Q,X007S,X007T,X008A,X008F,X008G,X008I,X008L,X008M,X008Q,X008T,X008V,X008W,X008Y,X009A,X009C,X009D,X009E,X009F,X009G,X009H,X009L,X009N,X009P,X009Q,X009R,X009S,X009T,X009V,X009W,X009Y,X010A,X010C,X010F,X010G,X010H,X010I,X010K,X010L,X010M,X010N,X010Q,X010R,X010S,X010T,X010V,X010W,X010Y,X011A,X011C,X011D,X011G,X011I,X011M,X011R,X011S,X011T,X011V,X011Y,X012D,X012F,X012G,X012H,X012I,X012K,X012L,X012M,X012N,X012P,X012Q,X012R,X012S,X012T,X012V,X012W,X012Y,X013A,X013G,X013I,X013M,X013Q,X013T,X013V,X014A,X014C,X014D,X014E,X014F,X014G,X014H,X014I,X014K,X014L,X014P,X014Q,X014S,X014T,X014V,X014Y,X015A,X015D,X015F,X015G,X015I,X015K,X015L,X015M,X015P,X015Q,X015R,X015S,X015V,X015W,X016A,X016D,X016E,X016G,X016L,X016N,X016P,X016Q,X016R,X016S,X016T,X016V,X017A,X017D,X017E,X017F,X017G,X017H,X017I,X017K,X017M,X017N,X017R,X017S,X017T,X017V,X017W,X017Y,X018A,X018C,X018D,X018E,X018F,X018G,X018H,X018I,X018K,X018L,X018M,X018N,X018P,X018Q,X018R,X018S,X018T,X018V,X018W,X018Y,X019A,X019C,X019D,X019E,X019F,X019G,X019H,X019K,X019L,X019M,X019N,X019P,X019R,X019S,X019T,X019V,X019W,X019Y,X020A,X020C,X020D,X020F,X020G,X020I,X020K,X020L,X020M,X020P,X020Q,X020R,X020S,X020T,X020V,X020W,X020Y,X021A,X021C,X021D,X021E,X021G,X021H,X021I,X021K,X021L,X021M,X021N,X021P,X021Q,X021R,X021S,X021T,X021V,X021W,X022A,X022C,X022G,X022I,X022K,X022L,X022T,X022V,X022W,X022Y,X023A,X023G,X024H,X024L,X024M,X024N,X024P,X024Q,X025D,X025E,X025F,X025G,X025H,X025K,X025T,X025V,X025W,X026C,X026F,X026G,X026S,X026T,X026V,X027A,X027C,X027D,X027N,X027P,X027R,X027S,X027T,X027V,X028I,X028L,X028M,X028N,X028P,X028S,X029K,X029S,X029T,X029V,X030A,X030C,X030Q,X030S,X030T,X030V,X031A,X031F,X032A,X032C,X032D,X032E,X032G,X032V,X033H,X033I,X033L,X033M,X033N,X033Q,X034G,X034H,X034L,X034Q,X034S,X035A,X035P,X035Q,X035R,X035S,X035A,X035C,X035M,X035N,X035P,X035Q,X035R,X035T,X038H,X038I,X038K,X038L,X038M,X038N,X039A,X039E,X039G,X039H,X039L,X039M,X040A,X040C,X040D,X040E,X040G,X040H,X040R,X040S,X040T,X040V,X040W,X040Y,X041S,X042A,X042C,X042F,X042G,X042H,X042T,X042V,X042Y,X043A,X043C,X043D,X043N,X043P,X043R,X043S,X043T,X043V,X044G,X044I,X044K,X044L,X044M,X044N,X044W,X044Y,X045A,X045D,X045F,X045G,X045P,X045Q,X045R,X045S,X045T,X045V,X046G,X046H,X046I,X046K,X046L,X046M,X046V,X046W,X047A,X047C,X047E,X047F,X047P,X047Q,X047R,X047S,X047T,X047W,X048I,X048K,X048L,X048M,X048N,X048P,X049A,X049E,X049F,X049G,X049H,X049K,X049T,X050C,X050F,X050G,X050H,X050I,X051G,X051H,X051K,X051L,X051N,X051P,X052C,X052E,X052F,X052G,X052H,X052I,X052T,X052V,X052W,X052Y,X053A,X053C,X053L,X053M,X053P,X053Q,X053R,X053S,X054D,X054E,X054F,X054G,X054H,X054I,X054R,X054S,X054V,X054W,X054Y,X055A,X055K,X055L,X055M,X055N,X055P,X055Q,X056C,X056D,X056E,X056H,X056L,X056M,
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X204G,X204I,X204K,X204L,X204N,X204P,X205F,X205G,X205I,X205L,X205M,X205Q,X206F,X206G,X206H,X206I,X206K,X206L,X206V,X206W,X206Y,X207A,X207G,X207H,X208S,X208T,X208V,X209A,X209C,X209D,X209L,X209M,X209N,X209R,X209S,X209T,X210E,X210F,X210G,X210H,X210I,X210L,X210V,X210W,X210Y,X211A,X211C,X211E,X211P,X211Q,X211R,X211T,X211V,X211W,X212M,X212N,X212P,X212R,X212S,X212T,X213F,X213G,X213I,X213K,X213L,X213M,X213V,X213W,X213Y,X214A,X214C,X214E,X214M,X214N,X214P,X214Q,X214R,X214S,X215D,X215E,X215F,X215G,X215H,X215I,X215T,X215V,X215W,X215Y,X216A,X216C,X216K,X216L,X216M,X216N,X216P,X216Q,X217C,X217D,X217E,X217F,X217G,X217I,X217T,X217V,X217Y,X218C,X218D,X218E,X218N,X218P,X218Q,X218R,X218S,X218T,X220A,X220C,X220G,X220H,X220N,X220S,X222C,X222E,X222F,X222G,X222I,X222K,X222S,X222T,X222V,X222W,X223A,X223C,X224E,X224G,X224I,X224L,X224M,X224N,X225I,X225N,X225P,X225S,X225T,X225V,X226M,X226N,X226R,X226S,X226T,X226V,X227L,X227M,X227P,X227Q,X227S,X227T,X228L,X228M,X228P,X228S,X228V,X229A,X230F,X230G,X230H,X230I,X230L,X230N,X230Y,X231A,X231C,X231F,X231G,X231H,X232A,X232G,X232H,X232K,X232L,X232M,X233F,X233G,X233I,X233L,X233M,X233N,X233Y,X234D,X234F,X234G,X234H,X234L,X234V,X234Y,X235C,X235D,X235E,X235F,X235N,X235Q,X235R,X235S,X235V,X235W,X236H,X236K,X236L,X236N,X236P,X236Q,X237A,X237C,X237F,X237G,X237H,X237I,X237S,X237T,X237V,X237W,X237Y,X238C,X238K,X238L,X238M,X238N,X238Q,X238R,X239F,X239G,X239H,X239I,X239K,X239L,X239M,X239N,X239P,X239Q,X239R,X239S,X239T,X239V,X239W,X239Y,X240A,X240C,X240E,X240F,X240I,X240K,X240L,X240M,X240N,X240Q,X240R,X240S,X240T,X240W,X240Y,X241A,X241C,X241D,X241E,X241F,X241G,X241H,X241I,X241K,X241L,X241M,X241N,X241P,X241Q,X241R,X241S,X241T,X241V,X241W,X241Y,X242A,X242C,X242D,X242F,X242G,X242H,X242I,X242L,X242M,X242P,X242Q,X242R,X242S,X242T,X242V,X242W,X243C,X243D,X243E,X243F,X243G,X243H,X243I,X243K,X243L,X243M,X243N,X243P,X243Q,X243R,X243S,X243T,X243V,X243W,X244A,X244D,X244E,X244F,X244H,X244I,X244L,X244M,X244N,X244P,X244Q,X244R,X244S,X244T,X244V,X244W,X244Y,X245A,X245C,X245E,X245G,X245H,X245K,X245L,X245P,X245Q,X245R,X245S,X245V,X245W,X245Y,X246A,X246C,X246E,X246F,X246G,X246H,X246I,X246L,X246M,X246N,X246P,X246Q,X246R,X246S,X246T,X246V,X246W,X246Y,X247A,X247C,X247D,X247E,X247F,X247G,X247H,X247I,X247K,X247L,X247M,X247N,X247P,X247Q,X247R,X247S,X247T,X247V,X247W,X247Y,X248C,X248D,X248E,X248G,X248H,X248I,X248K,X248L,X248M,X248N,X248P,X248R,X248S,X248T,X248V,X248W,X248Y,X249A,X249D,X249E,X249F,X249G,X249H,X249I,X249K,X249L,X249M,X249N,X249Q,X249R,X249S,X249T,X249V,X249W,X249Y,X250A,X250C,X250E,X250F,X250G,X250H,X250I,X250L,X250M,X250N,X250Q,X250S,X250V,X250Y,X251A,X251D,X251E,X251F,X251G,X251K,X251L,X251M,X251P,X251Q,X251R,X251S,X251T,X251V,X251Y,X252A,X252C,X252D,X252F,X252G,X252H,X252I,X252K,X252L,X252M,X252N,X252P,X252R,X252S,X252V,X252W,X252Y,X253A,X253D,X253E,X253F,X253G,X253H,X253I,X253K,X253M,X253R,X253S,X253T,X253V,X253W,X254A,X254C,X254D,X254E,X254G,X254N,X254P,X254S,X254T,X254V,X255A,X255C,X255D,X255E,X255F,X255H,X255I,X255L,X255N,X255P,X255Q,X255R,X255S,X255T,X255V,X255W,X255Y,X256A,X256C,X256D,X256E,X256G,X256H,X256I,X256K,X256L,X256M,X256N,X256P,X256R,X256S,X256T,X256V,X256W,X256Y,X257A,X257C,X257E,X257F,X257G,X257H,X257I,X257K,X257L,X257M,X257P,X257S,X257T,X257V,X257W,X257Y,X258A,X258C,X258D,X258E,X258F,X258G,X258H,X258I,X258L,X258M,X258P,X258Q,X258R,X258S,X258T,X258V,X258W,X258Y,X259A,X259C,X259E,X259G,X259I,X259L,X259M,X259P,X259Q,X259R,X259S,X259T,X259V,X260A,X260D,X260E,X260F,X260H,X260I,X260L,X260M,X260N,X260P,X260R,X260S,X260T,X260V,X260Y,X261A,X261C,X261E,X261F,X261G,X261I,X261K,X261L,X261N,X261P,X261Q,X261R,X261S,X261T,X261V,X261W,X261Y,X262A,X262C,X262D,X262F,X262G,X262H,X262I,X262K,X262L,X262M,X262P,X262Q,X262R,X262S,X262T,X262V,X262W,X262Y,X263A,X263C,X263D,X263F,X263G,X263H,X263I,X263K,X263L,X263M,X263N,X263P,X263Q,X263R,X263W,X263Y,X264A,X264C,X264E,X264F,X264G,X264H,X264I,X264L,X264P,X264Q,X264S,X264T,X264V,X264Y,X265A,X265C,X265D,X265F,X265G,X265H,X265I,X265K,X265L,X265M,X265N,X265P,X265Q,X265R,X265S,X265T,X265V,X265W,X265Y,X266G,X266W,X266Y,X267A,X267C,X267D,X267E,X267F,X267G,X267H,X267I,X267K,X267L,X267M,X267N,X267S,X267T,X267V,X267Y,X268A,X268D,X268E,X268G,X268H,X268K,X268L,X268M,X268N,X268P,X268Q,X268R,X268S,X268V,X268W,X268Y,X269C,X269D,X269F,X269G,X269H,X269I,X269L,X269M,X269N,X269Q,X269R,X269S,X269T,X269V,X270A,X270C,X270D,X270E,X270F,X270G,X270H,X270I,X270L,X270M,X270N,X270P,X270Q,X270S,X270T,X270V,X271A,X271C,X271E,X271F,X271G,X271H,X271I,X271K,X271L,X271M,X271N,X271P,X271T,X271V,X271Y,X272A,X272C,X272D,X272E,X272F,X272G,X272H,X272K,X272L,X272M,X272N,X272P,X272R,X272S,X272T,X272W,X272Y,X273A,X273C,X273D,X273E,X273F,X273G,X273H,X273I,X273K,X273L,X273R,X273S,X273T,X273V,X273W,X273Y,X274A,X274C,X274D,X274E,X274G,X274H,X274K,X274L,X274M,X274N,X274P,X274Q,X274R,X274S,X274T,X274W,X275A,
X275C, X275D, X275E, X275F, X275G, X275H, X275K, X275L, X275M, X275P, X275Q、X275R、X275V 和 X275W。
本发明还提供了包含枯草杆菌蛋白酶变体的餐具洗涤组合物，和包含枯草杆菌蛋白酶变体的衣物去垢剂。在一些优选的实施方案中，餐具洗涤和衣物去垢剂进一步包含至少一种其他的酶。在一些优选的实施方案中，其他的酶选自蛋白酶(例如，中性金属蛋白酶、野生型丝氨酸蛋白酶或第二变体丝氨酸蛋白酶)、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶和过氧化物酶。此外， 本发明提供了餐具洗涤方法，其包括步骤提供i)包含枯草杆菌蛋白酶变体的餐具洗涤组合物，和ii)需要清洁的餐具；和在有效提供餐具清洁的条件下，将餐具与餐具洗涤组合物接触。相似的，本发明提供了织物清洁方法，其包括步骤提供i)包含枯草杆菌蛋白酶变体的衣物去垢剂，和ii)需要清洁的衣物；和在有效提供衣物清洁的条件下，将衣物与衣物去垢剂接触。在其他的实施方案中，本发明提供了编码变体的分离的核酸，还提供了包含所述分离的核酸与启动子的有效组合的表达载体，和/或包含所述表达载体的宿主细胞。
本发明还提供了芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且在三个或更多个位置上包含取代，所述位置选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48， 49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，71，72，73，74， 75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99， 100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118， 119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137， 138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156， 157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，169，170，171，172，173，174，175，176， 177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195， 196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214， 215，216，217，218，219，220，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234， 235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253， 254，255，256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、 273、274和275，其中所述位置对照SEQ ID NO :1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶 BPN'的氨基酸序列编号。在一些实施方案中，枯草杆菌蛋白酶变体包含4、5、6、7、8、9、10、 11、12或更多个上述位置。
在一些实施方案中，枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且在三个或更多个位置上包含取代，所述位置选自:1、3、4、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18， 19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，33，35，36，38，40，43，44，45，46，47，48，49， 50，51，52，53，54，55，56，57，59，61，62，68，69，72，73，76，78，84，86，87，88，89，90，91，92， 93,94,95,96,97,98,99,100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，114， 115，116，117，118，119，120，121，122，124，126，128，129，130，131，132，133，134，135，136， 137，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，156，158，159，160， 165，166，167，170，171，172，173，174，175，176，177，180，182，183，184，185，186，187，188， 191，194，195，198，199，203，204，206，209，210，211，212，213，215，216，217，218，222，223， 224，227，228，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245， 246，247，248，249，250，251，252，253，255，256，258，259，260，261，262，265、267、268、269、 270、271、272、273、274和275，其中所述位置对照SEQ ID NO :1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。在一些实施方案中，枯草杆菌蛋白酶变体包含4、5、 6、7、8、9、10、11、12或更多个上述位置。
本发明还提供了分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且在三个或更多个位置上包含取代，所述位置选自1、2、 3、4、5、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、3031， 33，35，36，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，59，60， 61，62，63，66，68，69，71，72，73，74，75，76，77，78，79，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90， 91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111， 112，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131， 132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150， 151，152，153，156，158，159，160，165，166，167，169，170，171，172，173，174，175，176，177， 178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，191，192，194，195,196,197，198，199， 200，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，220，222， 223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241， 242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260、 261、262、263、264、265、267、268、269、270、271、272、273、274 和 275，其中所述位置对照 SEQ ID NO :1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。在一些实施方案中，枯草杆菌蛋白酶变体包含4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个上述位置。
本发明进一步包括分离的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含在三个或更多个位置上的取代，所述取代选自.:X001A、X001C,X001E,X001F,X001G,X001H、X001I,X001K,X001L,X001N,X001P,X001Q,X001R,X001S,X001T,X001V,X001Y,X002A,X002C,X002E,X002G,X002K,X002L,X002M,X002N,X002P,X002Q,X002R,X002S,X002T,X002V,X002W,X002Y,X003D,X003E,X003F,X003G,X003H,X003I,X003L,X003M,X003N,X003P,X003R,X003S,X003T,X003V,X003W,X003Y,X004A,X004C,X004D,X004E,X004F,X004G,X004H,X004K,X004L,X004N,X004P,X004R,X004S,X004T,X004V,X004W,X005A,X005C,X005D,X005E,X005G,X005I,X005M,X005P,X005Q,X005S,X005T,X005W,X005Y,X006A,X006D,X006E,X006M,X006W,X007A,X007C,X007D,X007G,X007H,X007N,X007P,X007Q,X007S,X008A X009C X009T X010M XOllG X012I X012Y X014F X015A X015V X016T X017R X018H X018W X019N X020G X020Y X021P X022L X023G X024Q X025K X026G X027D X027V X028S X030C X031F X032V X033Q X035A X035C X035T X038N, X039N X040I X041C X042I X043E
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X223C,X223G,X223M,X223S,X223T,X224A,X224N,X224P,X224S,X224T,X225A,X225C,X225V,X226C,X226F,X226G,X226H,X226I,X226V,X226Y,X227A,X227C,X227F,X227G,X227T,X227V,X227Y,X228A,X228C,X228G,X229A,X229G,X229P,X229S,X230A,X230D,X230N,X230P,X230Q,X230S,X230T,X230V,X231H,X231I,X231L,X231S,X231T,X231W,X232M,X232P,X232S,X232V,X233A,X233C,X233N,X233P,X233Q,X233R,X233S,X233T,X234L,X234M,X234N,X234P,X234Q,X234S,X235F,X235G,X235H,X235I,X235K,X235L,X235W,X235Y,X236A,X236C,X236E,X236F,X236Q,X236R,X236S,X236T,X236V,X236W,X237I,X237K,X237L,X237M,X237P,X237Q,X238C,X238D,X238E,X238F,X238G,X238H,X238R,X238S,X238T,X238V,X238Y,X239C,X239L,X239M,X239N,X239P,X239Q,X239R,X240C,X240E,X240F,X240I,X240K,X240L,X240W,X240Y,X241A,X241C,X241D,X241E,X241M,X241N,X241P,X241Q,X241R,X241S,X242D,X242F,X242G,X242H,X242I,X242L,X242V,X242W,X243C,X243D,X243E,X243F,X243N,X243P,X243Q,X243R,X243S,X243T,X244H,X244I,X244L,X244M,X244N,X244P,X244Y,X245A,X245C,X245E,X245G,X245H,X245V,X245W,X245Y,X246A,X246C,X246E,X246N,X246P,X246Q,X246R,X246S,X246T,X247E,X247F,X247G,X247H,X247I,X247K,X247S,X247T,X247V,X247W,X247Y,X248C,X248L,X248M,X248N,X248P,X248R,X248S,X249E,X249F,X249G,X249H,X249I,X249K,X249T,X249V,X249W,X249Y,X250A,X250C,X250M,X250N,X250Q,X250S,X250V,X250Y,X251L,X251M,X251P,X251Q,X251R,X251S,X252F,X252G,X252H,X252I,X252K,X252L,X252W,X252Y,X253A,X253D,X253E,X253F,X253S,X253T,X253V,X253W,X254A,X254C,X254T,X254V,X255A,X255C,X255D,X255E,X255F,X255H,X255I,X255L,X255N,X255P,X255Q,X255R,X255S,X255T,X255V,X255W,X255Y,X256A,X256C,X256D,X256E,X256G,X256H,X256I,X256K,X256L,X256M,X256N,X256P,X256R,X256S,X256T,X256V,X256W,X256Y,X257A,X257C,X257E,X257F,X257G,X257H,X257I,X257K,X257L,X257M,X257P,X257S,X257T,X257V,X257W,X257Y,X258A,X258C,X258D,X258E,X258F,X258G,X258H,X258I,X258L,X258M,X258P,X258Q,X258R,X258S,X258T,X258V,X258W,X258Y,X259A,X259C,X259E,X259G,X259I,X259L,X259M,X259P,X259Q,X259R,X259S,X259T,X259V,X260A,X260D,X260E,X260F,X260H,X260I,X260L,X260M,X260N,X260P,X260R,X260S,X260T,X260V,X260Y,X261A,X261C,X261E,X261F,X261G,X261I,X261K,X261L,X261N,X261P,X261Q,X261R,X261S,X261T,X261V,X261W,X261Y,X262A,X262C,X262D,X262F,X262G,X262H,X262I,X262K,X262L,X262M,X262P,X262Q,X262R,X262S,X262T,X262V,X262W,X262Y,X263A,X263C,X263D,X263F,X263G,X263H,X2631,X263K,X263L,X263M,X263N,X263P,X263Q,X263R,X263W,X263Y,X264A,X264C,X264E,X264F,X264G,X264H,X264I,X264L,X264P,X264Q,X264S,X264T,X264V,X264Y,X265A,X265C,X265D,X265F,X265G,X265H,X265I,X265K,X265L,X265M,X265N,X265P,X265Q,X265R,X265S,X265T,X265V,X265W,X265Y,X266G,X266W,X266Y,X267A,X267C,X267D,X267E,X267F,X267G,X267H,X267I,X267K,X267L,X267M,X267N,X267S,X267T,X267V,X267Y,X268A,X268D,X268E,X268G,X268H,X268K,X268L,X268M,X268N,X268P,X268Q,X268R,X268S,X268V,X268W,X268Y,X269C,X269D,X269F,X269G,X269H,X269I,X269L,X269M,X269N,X269Q,X269R,X269S,X269T,X269V,X270A,X270C,X270D,X270E,X270F,X270G,X270H,X270I,X270L,X270M,X270N,X270P,X270Q,X270S,X270T,X270V,X271A,X271C,X271E,X271F,X271G,X271H,X271I,X271K,X271L,X271M,X271N,X271P,X271T,X271V,X271Y,X272A,X272C,X272D,X272E,X272F,X272G,X272H,X272K,X272L,X272M,X272N,X272P,X272R,X272S,X272T,X272W,X272Y,X273A,X273C,X273D,X273E,X273F,X273G,X273H,X273I,X273K,X273L,X273R,X273S,X273T,X273V,X273W,X273Y,X274A,X274C,X274D,X274E,X274G,X274H,X274K,X274L,X274M,X274N,X274P,X274Q,X274R,X274S,X274T,X274W,X275A,X275C,X275D,X275E,X275F,X275G、X275H、X275K,X275L、:X275M, X275P、X275Q、X275R、X275V 和X275W，其中所述位置对照SEQID NO:1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。在一-些实施方案中，枯草杆菌蛋白酶变体包含4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个上述位置。
在一些优选的实施方案中，本发明提供了分离的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体在选自BMI测定、蛋黄微样品测定和/或AAPF活性测定的至少一种测定中具有大于1的性能指数(performance index)，以及在LAS稳定性或TCA测定中具有大于0. 8的性能指数，其中所述变体在一个或多个位置上包含至少一个取代，所述位置选自1、2、3、4、5、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26，27，28，29，30，31，33，35， 36，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，59，60，61，62， 63，66，68，69，71，72，73，74，75，76，77，78，79，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92， 93,94,95,96,97,98,99,100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，114， 115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133， 134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，
56153，156，158，159，160，165，166，167，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179， 180，181，182，183，184，185，186，187，188，191，192，194，195，196，197，198，199,200,203, 204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，220，222，223，224， 225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243， 244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256、257、258、259、260、261、262、 263、264、265、267、268、269、270、271、272、273、274 和 275，其中所述位置对照 SEQ ID NO 1 所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。在一些实施方案中，枯草杆菌蛋白酶变体包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个上述位置。
在一些优选的实施方案中，本发明提供了分离的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体在选自BMI测定、蛋黄微样品测定和/或AAPF活性测定的至少一种测定中具有大于1的性能指数，以及在LAS稳定性或TCA测定中具有大于0. 8的性能指数，其中所述变体在一个或多个位置上包含至少一个取代，所述位置选自:1、2、3、4、5、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26，27，28，29，30，31，33，35，36，38，39，40，41，42，43，44， 45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，59，60，61，62，63，66，68，69，71，72，73，74， 75，76，77，78，79，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100， 101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，114，115，116，117，118，119，120， 121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139， 140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，156，158，159，160，165， 166，167，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185， 186，187，188，191，192，194，195，196，197，198，199，200，203，204，205，206，207，208，209， 210，211，212，213，214，215，216，217，218，220，222，223，224，225，226，227，228，229，230， 231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249， 250，251，252，253，254，255，256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、267、268、269、 270、271、272、273、274和275，其中所述位置对照SEQ ID NO :1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。在一些实施方案中，枯草杆菌蛋白酶变体包含2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个上述位置。
在一些其他实施方案中，本发明提供了分离的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体在选自BMI测定、蛋黄微样品测定和/或AAPF活性测定的至少一种测定中具有大于0. 8的性能指数，以及在LAS稳定性或TCA测定中具有大于0.8的性能指数，其中所述变体在一个或多个位置上包含至少一个取代，所述位置选自:1、3、4、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29，30，31，33，35，36，38，40，43，44，45，46，47，48，49， 50，51，52，53，54，55，56，57，59，61，62，68，69，72，73，76，78，84，86，87，88，89，90，91，92， 93,94,95,96,97,98,99,100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，114， 115，116，117，118，119，120，121，122，124，126，128，129，130，131，132，133，134，135，136， 137，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，156，158，159，160， 165，166，167，170，171，172，173，174，175，176，177，180，182，183，184，185，186，187，188， 191，194，195，198，199，203，204，206，209，210，211，212，213，215，216，217，218，222，223， 224，227，228，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245， 246，247，248，249，250，251，252，253，255，256，258，259，260，261，262，265，267，268，269，270, 271, 272, 273, 274,^P 275，其中所述位置对照SEQ ID NO 1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。在一些实施方案中，枯草杆菌蛋白酶变体包含2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个上述位置。
在一些其他实施方案中，本发明提供了分离的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体在选自BMI测定、蛋黄微样品测定和/或AAPF活性测定的至少一种测定中具有大于1的性能指数，以及在LAS稳定性或TCA测定中具有大于0. 8的性能指数，其中所述变体包含至少3
个取代，所述取代选自=XOOlA、X001C, X001E, X001F, X001G, X001H, X001I, 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粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。在一些实施方案中，枯草杆菌蛋白酶变体包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个上述位置。
在一些实施方案中，本发明提供了分离的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体在选自 BMI测定、蛋黄微样品测定和/或AAPF活性测定的至少一种测定中具有大于1的性能指数， 以及在LAS稳定性或TCA测定中具有大于0. 8的性能指数，其中所述变体包含至少3个取代，所述取代选自X001A，X001E, X001G, X001H, X001Q, X001V, X003E, X003H, X003I，X003M，X003S,X003T,X003V,X004T,X004V,X008I,X008V,X009E,X009H,X009N,X009Q,X009S,X009T,X010A,X010C,X010G,X010H,X010K,X010M,X010N,X010R,X010S,X010T,X011I,X011V,X012G,X012I,X012N,X012Q,X012S,X012T,X012V,X013A,X013G,X015A,X015D,X015F,X015G,X015I,X015L,X015M,X015P,X015Q,X015S,X015V,X015W,X016A,X016G,X016N,X016P,X016S,X016T,X016V,X017H,X017I,X017M,X017N,X018A,X018C,X018D,X018E,X018G,X018H,X018L,X018M,X018N,X018P,X018Q,X018S,X018T,X018V,X018Y,X019A,X019C,X019D,X019E,X019F,X019G,X019H,X019K,X019L,X019M,X019N,X019R,X019S,X019V,X019W,X019Y,X020A,X020C,X020D,X020F,X020G,X020I,X020K,X020L,X020M,X020P,X020Q,X020R,X020S,X020T,X020V,X020W,X020Y,X021A,X021C,X021E,X021G,X021H,X021I,X021K,X021L,X021M,X021N,X021P,X021Q,X021S,X021T,X021V,X021W,X022A,X022C,X022G,X022I,X022L,X022M,X022N,X022P,X022Q,X022T,X022V,X022W,X023A,X023G,X023S,X024A,X024C,X024D,X024F,X024G,X024H,X024L,X024M,X024N,X024P,X024Q,X024R,X024S,X024T,X024V,X024W,X025C,X025D,X025E,X025F,X025G,X025K,X025L,X025M,X025Q,X025R,X025S,X025T,X025V,X025W,X026C,X026F,X026G,X026M,X026N,X026R,X026S,X026T,X026V,X027A,X027C,X027D,X027F,X027G,X027K,X027L,X027M,X027N,X027P,X027R,X027S,X027T,X027W,X028A,X028I,X028L,X028M,X028V,X029A,X029C,X029G,X029S,X029V,X030A,X030C,X030L,X030M,X030T,X030V,X031A,X031F,X031I,X031L,X031M,X031S,X031V,X033C,X033M,X033S,X033T,X035I,X035L,X035M,X035P,X036A,X036E,X036S,X036T,X036V,X038C,X038F,X038H,X038I,X038K,X038L,X038M,X038N,X038Q,X038R,X038T,X038V,X038Y,X040A,X040D,X040E,X040I,X040L,X040P,X040V,X043A,X043C,X043D,X043E,X043F,X043G,X043I,X043L,X043M,X043N,X043R,X043S,X043T,X043W,X043Y,X044A,X044C,X044D,X044F,X044G,X044I,X044K,X044L,X044M,X044N,X044Q,X044R,X044S,X044T,X044V,X044Y,X045A,X045D,X045F,X045G,X045H,X045I,X045K,X045L,X045M,X045N,X045P,X045Q,X045R,X045S,X045T,X045V,X045W,X045Y,X046C,X046D,X046E,X046G,X046H,X046I,X046K,X046L,X046M,X046N,X046P,X046Q,X046R,X046S,X046T,X046V,X047G,X047R,X048A,X048C,X048E,X048F,X048H,X048I,X048K,X048L,X048M,X048N,X048P,X048Q,X048R,X048S,X048T,X048V,X048Y,X049A,X049G,X049H,X049S,X049T,X050F,X050H,X050I,X050L,X050T,X050V,X050Y,X051F,X051H,X051K,X051L,X051R,X051S,X051T,X051V,X051W,X052A,X052C,X052E,X052F,X052G,X052H,X052I,X052L,X052M,X052N,X052P,X052Q,X052R,X052T,X052V,X052W,X052Y,X053A,X053C,X053D,X053E,X053G,X053H,X053K,X053L,X053M,X053Q,X053R,X053S,X053T,X053W,X053Y,X054A,X054C,X054D,X054E,X054F,X054H,X054M,X054N,X054Q,X054S,X055C,X055E,X055G,X055H,X055K,X055L,X055P,X055Q,X055S,X055T,X055W,X056A,X056C,X056D,X056E,X056H,X056L,X056M,X056N,X056P,X056Q,X056S,X056T,X057C,X057E,X057F,X057G,X057H,X057IX057L, 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1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。在一些实施方案中， 枯草杆菌蛋白酶变体包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个上述位置。
在一些实施方案中，本发明提供了分离的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体在选自 BMI测定、蛋黄微样品测定和/或AAPF活性测定的至少一种测定中具有大于1的性能指数， 以及在LAS稳定性或TCA测定中具有大于0. 8的性能指数，其中所述变体包含至少3个取代，所述取代选自X001A，X001E, X001G, X001H, X001Q, X001V, X003E, X003H, X003I，X003M， X003S, X003T, X003V, X004T, X004V, X008I, X008V, X009E, X009H, X009N, X009Q, X009S, X009T, X010A, X010C, X010G, X010H, X010K, X010M, X010N, X010R, X010S, X010T, X011I, X011V, X012G, X012I, X012N, X012Q, X012S, X012T, X012V, X013A, X013G, X015A, X015D, X015F, X015G, X015I, X015L, X015M, X015P, X015Q, X015S, X015V, X015W, X016A, X016G, X016N, X016P, X016S, X016T, X016V, X017H, X017I, X017M, X017N, X018A, X018C, X018D,X018E,X018G,X018H,X018L,X018M,X018N,X018P,X018Q,X018S,X018T,X018V,X018Y,X019A,X019C,X019D,X019E,X019F,X019G,X019H,X019K,X019L,X019M,X019N,X019R,X019S,X019V,X019W,X019Y,X020A,X020C,X020D,X020F,X020G,X020I,X020K,X020L,X020M,X020P,X020Q,X020R,X020S,X020T,X020V,X020W,X020Y,X021A,X021C,X021E,X021G,X021H,X021I,X021K,X021L,X021M,X021N,X021P,X021Q,X021S,X021T,X021V,X021W,X022A,X022C,X022G,X022I,X022L,X022M,X022N,X022P,X022Q,X022T,X022V,X022W,X023A,X023G,X023S,X024A,X024C,X024D,X024F,X024G,X024H,X024L,X024M,X024N,X024P,X024Q,X024R,X024S,X024T,X024V,X024W,X025C,X025D,X025E,X025F,X025G,X025K,X025L,X025M,X025Q,X025R,X025S,X025T,X025V,X025W,X026C,X026F,X026G,X026M,X026N,X026R,X026S,X026T,X026V,X027A,X027C,X027D,X027F,X027G,X027K,X027L,X027M,X027N,X027P,X027R,X027S,X027T,X027W,X028A,X028I,X028L,X028M,X028V,X029A,X029C,X029G,X029S,X029V,X030A,X030C,X030L,X030M,X030T,X030V,X031A,X031F,X031I,X0311,X031M,X031S,X031V,X033C,X033M,X033S,X033T,X035I,X035L,X035M,X035P,X036A,X036E,X036S,X036T,X036V,X038C,X038F,X038H,X038I,X038K,X038L,X038M,X038N,X038Q,X038R,X038T,X038V,X038Y,X040A,X040D,X040E,X040I,X040L,X040P,X040V,X043A,X043C,X043D,X043E,X043F,X043G,X043I,X043L,X043M,X043N,X043R,X043S,X043T,X043W,X043Y,X044A,X044C,X044D,X044F,X044G,X044I,X044K,X044L,X044M,X044N,X044Q,X044R,X044S,X044T,X044V,X044Y,X045A,X045D,X045F,X045G,X045H,X045I,X045K,X045L,X045M,X045N,X045P,X045Q,X045R,X045S,X045T,X045V,X045W,X045Y,X046C,X046D,X046E,X046G,X046H,X046I,X046K,X046L,X046M,X046N,X046P,X046Q,X046R,X046S,X046T,X046V,X047G,X047R,X048A,X048C,X048E,X048F,X048H,X048I,X048K,X048L,X048M,X048N,X048P,X048Q,X048R,X048S,X048T,X048V,X048Y,X049A,X049G,X049H,X049S,X049T,X050F,X050H,X050I,X050L,X050T,X050V,X050Y,X051F,X051H,X051K,X051L,X051R,X051S,X051T,X051V,X051W,X052A,X052C,X052E,X052F,X052G,X052H,X052I,X052L,X052M,X052N,X052P,X052Q,X052R,X052T,X052V,X052W,X052Y,X053A,X053C,X053D,X053E,X053G,X053H,X053K,X053L,X053M,X053Q,X053R,X053S,X053T,X053W,X053Y,X054A,X054C,X054D,X054E,X054F,X054H,X054M,X054N,X054Q,X054S,X055C,X055E,X055G,X055H,X055K,X055L,X055P,X055Q,X055S,X055T,X055W,X056A,X056C,X056D,X056E,X056H,X056L,X056M,X056N,X056P,X056Q,X056S,X056T,X057C,X057E,X057F,X057G,X057H,X057I,X057L,X057M,X057N,X057P,X057Q,X057R,X057S,X057T,X057V,X057W,X057Y,X059A,X059D,X059G,X059I,X059L,X059M,X059N,X059Q,X059R,X059S,X059T,X059V,X059W,X061A,X061C,X061D,X061F,X061G,X061H,X061I,X061L,X061M,X061N,X061P,X061R,X061S,X061T,X061V,X061Y,X062C,X062E,X062F,X062H,X062I,X062K,X062L,X062M,X062N,X062Q,X062R,X062S,X062T,X062V,X068I,X068L,X068V,X069A,X069G,X069S,X069T,X072I,X072L,X072T,X072V,X073A,X073C,X073S,X076D,X076N,X078A,X078C,X078E,X078H,X078L,X078M,X078N,X078Q,X078S,X078T,X084C,X084G,X084I,X084M,X084V,X086C,X086P,X087A,X087C,X087D,X087E,X087G,X087K,X087L,X087N,X087S,X087V,X088A,X088C,X088G,X088S,X089A,X089D,X089E,X089G,X089H,X089I,X089N,X089Q,X089R,X089S,X089T,X089W,X090V,X091D,X091F,X091I,X091N,X091S,X092R,X092V,X093A,X093C,X093G,X093L,X095C,X095I,X095S,X095V,X096F,X096I,X097G,X097H,X097K,X097L,X097M,X097N,X097W,X097Y,X098A,X098C,X098D,X098E,X098Q,X098R,X098S,X098T,X098V,X098Y,X099P,X099Q,X099R,X099S,X099T,X099V,X100N,X100R,X100S,X100T,X100V,X100Y,X101H,X101I,X101K,X101N,X101P,X101Q,X102G,X102T,X103A,X103C,X103D,X103F,X103R,X103S,X103T,X103V,X103W,X104C,X104T,X104V,X104W,X104Y,X105A,X105C,X105N,X105Q,X105R,X105S,X105T,X105V,X106R,X106S,X106T,X106V,X106W,X107A,X107S,X107T,X107V,X108A,X108C,X108I,X109G,X109H,X109I,X109K,X109L,X109M,X109Y,X110A,X110G,X111F,X111I,X111L,X114A,X114C,X115C,X115E,X115G,X115L,X115Y,X116A,X116C,X116D,X116F,X116G,X116S,X116T,X116V,X116W,X117A,X117C,X118C,X118D,X118E,X118F,X118G,X118K,X119A,X119F,X119M,X119T,X120A,X120C,X120M,X120N,X120R,X120S,X120T,X120W,X121S,X121T,X121V,X122A,X122G,X122S,X126I,X126L,X126M,X126V,X128A,X128F,X128Q,X128R,X128S,X128T,X128W,X129A,X129R,X129S,X129Y,X130C,X130K,X130L,X130Y,X131A,X131D,X131E,X131F,X131G,X132N,X132Q,X132R,X132S,X132T,X133A,X133V,X133Y,X134A,X134S,X134T,X134V,X137C,X137E,X137H,X137K,X137L,X137M,X139V,X140D,X140E,X140N,X141D,X141E,X141Q,X141R,X141S,X141V,X141Y,X142A,X143N,X143T,X144A,X144C,X144D,X144G,X144S,X144T,X144V,X144Y,X145A,X145C,X145R,X146D,X146G,X147I,X147L,X147T,X148V,X149C,X149I,X149L,X149V,X150A,X152S,X156D,X156E,X156L,X156N,X156S,
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60I,X260N,X260P,X260S,X260T,X260V,X261A,X26IC,X261E,X261F,X261I,X261K,X261L,X261N,X261P,X261Q,X261S,X261T,X261V,X261W,X261Y,X262A,X262C,X262D,X262F,X262H,X262I,X262L,X262M,X262Q,X262T,X262V,X262Y,X265A,X265D,X265S,X267I,X267L,X268A,X268L,X268V,X269D,X269H,X269N,X269Q,X269S,X270A,X270C,X270G,X270I,X270L,X270N,X270S,X270T,X270V,X271C,X271E,X272A,X272C,X272D,X272E,X272F,X272G,X272H,X272L,X272M,X272N,X272P,X272S,X272T,X272W,X272Y,X273A,X273C,X273G,X273S,X274A,X274C,X274G,X274L,X274M,X274N,X274S,X274T,X275D,
X275E, X275F, X275H、X275K、X275L、X275M、X275P、X275Q 和 X275R，其中所述位置对照 SEQ ID NO :1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。在一些实施方案中，枯草杆菌蛋白酶变体包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个上述位置。
在一些实施方案中，枯草杆菌蛋白酶变体在一个或多个位置上包含进一步的取代，所述位置选自:18、52、72、117、119、127、144、185、209和213，其中所述位置对照SEQ ID NO 1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
在一些特别优选的实施方案中，前文和本文中描述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体是GG36变体。在一些优选的实施方案中，GG36变体是SEQID NO 2的变体。在一些可选的实施方案中，前文和本文中描述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体是BPN’变体。
在一些其他的实施方案中，分离的枯草杆菌蛋白酶变体包含取代的组合，所述取代选自S87N/Q109Q/G118D/SU8L/PU9Q/S130A/S188S/T213E/N248R，S87N/Q109R/G118V/ S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/ T213T/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N, S87N/Q109R/ G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/ S188D/T213T/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248R, S87R/ Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87R/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/ S130A/S188D/T213T/N248R, S87R/Q109R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R, S87N/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/ P129Q/S130A/S188D/T213R/N248R, S87R/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/ N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248N, S87R/Q109Q/G118R/ S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R, S87D/Q109D/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109R/ G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/ S188R/T213T/N248R, S87R/Q109R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87R/ Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118R/S128L/P129Q/ S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/ P129Q/S130A/S188D/T213T/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/ N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248R, S87N/Q109R/G118V/ S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/ T213T/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248D, S87N/Q109R/ G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/ S188S/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248D, S87R/ Q109D/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/ S130A/S188D/T213R/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248N, S87N/Q109Q/G118V/S128L/ P129Q/S130A/S188R/T213E/N248N, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/ N248N, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248R, S87N/Q109Q/G118V/ S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/ T213R/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248N, S87R/Q109Q/ G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/ S188D/T213E/N248R, S87N/Q109D/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248N, S87N/ Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248D, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/ S130A/S188R/T213E/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/ P129Q/S130A/S188D/T213E/N248D, S87R/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/ N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248R, S87N/Q109Q/G118V/ S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248N, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/ T213T/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R, S87N/Q109R/ G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248D,和 S87N/Q109Q/G118V/S128LP129Q/ S130A/S188R/T213E/N248R，其中所述位置对照SEQ ID NO 1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
在一些其他的实施方案中，分离的枯草杆菌蛋白酶变体包含取代的组合，所述取代选自S87N/Q109Q/G118V/SU8L/PU9Q/S130A/S188S/T213T/N248D，S87N/Q109Q/G118V/ S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248N, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/ T213R/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248D, S87R/Q109D/ G118R/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R, S87R/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/ S188D/T213E/N248R, S87N/Q109D/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248D,和 S87N/Q109Q/G118V/SU8L/PU9Q/S130A/S188R/T213E/N248D，其中所述位置对照 SEQ ID NO 1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
在一些其他的实施方案中，分离的枯草杆菌蛋白酶变体包含取代的组合，所述取代选自S87D/Q109D/G118R/SU8L/PU9Q/S130A/S188R/T213E/N248D，S87N/Q109D/G118R/ S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87D/Q109Q/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188S/ T213E/N248D, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248D, S87N/Q109Q/ G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/ S188R/T213T/N248D, S87R/Q109D/G118V/S128L/P129Q/S130L/S188D/T213E/N248R, S87N/ Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130cS188S/T213R/N248D,和 S87R/Q109D/G118R/S128L/ PU9Q/S130A/S188D/T213T/N248R，其中所述位置对照SEQ ID NO :1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
在一些其他的实施方案中，本发明提供了分离的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含选自以下的取代的组合A001C/S0MV/I107L、A001I/R045T/I107R/A172T，A001K/ A172L, A001K/A172W, A001K/I072C/L126F, A001K/I072C/L126F/S164Q, A001K/I072C/ V104I/L126F, A001K/I072C/V104I/L126F/S164Q, A001K/I072V, A001K/I072V/L126F, A001K/I072V/L126F/S 164F, A001K/I072V/V104I, A001K/I072V/V104I/L126F/S164I, A001K/I072V/V104I/S164F, A001K/I072V/V104I/S164Q, A001K/I107T/A172Q, A001K/ I107V/G127Q, A001K/I107V/G127Q/A172Q, A001K/I107V/G127R/A172Q, A001K/L126F, A001K/L126F/S164F, A001K/L126F/S164I， A001K/L126F/S164Q, A001K/R045F/I072C, A001K/R045F/I072C/L126F, A001K/R045E/I072C/V104I/S164F, A001K/R045F/I072V/ L126F/S164I, A001K/R045F/I072V/L126F/S164Q, A001K/R045F/I072V/S164F, A001K/ R045F/I072V/V104G/S164T, A001K/R045F/I107L/A172N, A001K/R045F/I107T, A001K/ R045F/I107V/G127Q, A001K/R045F/L126F/S164F, A001K/R045F/L126F/S164I， A001K/ R045F/S164F, A001K/R045F/V104I/L126F/S164Q, A001K/R045K/I072C/L126F/S164Q, A001K/R045K/I072V/L126F, A001K/R045K/I072V/L126F/S164F, A001K/R045K/I072V/ L126F/S164Q, A001K/R045K/I072V/S164F, A001K/R045K/I072V/S164Q, A001K/R045K/ I072V/V104I/L126F/S164F, A001K/R045K/I072V/V104I/L126F/S164I, A001K/R045K/ I072V/V104I/L126F/S164Q, A001K/R045K/I107A/A172T, A001K/R045K/I107R/G127A/ A172N, A001K/R045K/I107T/G127R, A001K/R045K/I107T/G127R/A172Q, A001K/R045K/ L126F, A001K/R045K/L126F/S164I, A001K/R045K/L126F/S164P, A001K/R045K/L126F/ S164Q, A001K/R045K/S164F, A001K/R045K/V104I/S164Q, A001K/R045K/V104L/S164A, A001K/R045N/I107T/G127Q, A001K/R045S/V104C/L126Y/S164F, A001K/S024H/I107T/ G127Q, A001K/S024H/I107T/G127R, A001K/S024H/I107V, A001K/S024H/R045N/I107T, A001K/S024H/R045N/I107T/G127Q/A172Q, A001K/S024L/R045A, A001K/S024N/I107V/ G127T, A001K/S024N/R045K/A172Y, A001K/S024R/I107T, A001K/S024R/R045N/A172C, A001K/S024R/R045N/I107T, A001K/S024R/R045N/I107T/G127R, A001K/S024T/I107T/ G127Q/A172Q, A001K/S024T/R045N/G127Q/A172Q, A001K/S024W/I107T/G127R, A001K/ S024W/I107V/G127T/A172Q, A001K/S164Q, A001KK/V104E, A001K/V104I/L126F, 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A172S, A001R/S024W/R045F/I107V/G127Q, A001R/S024W/R045F/I107V/G127R, A001R/ S024W/R045K, A001R/S024W/R045K/I107T/A172Q, A001R/S024W/R045N/I107T, A001S/ A172V, A001S/S024L/I107Y/A172S, A001T/S024H/I107L/A172Y, A001V/I107L/A172I, G097P/N185Q/A215I, G097P/Y209W/A215V/S256W, Gl18L/G127R/S132L, G118T/G127Q, I107A/G127K/A172G, I107C/A172S, I107P/A172S, I107Q/A172D, L126A/S164N, L126F/ S164V, M119F/N185R, Ml19F/N185R/Y209W/S256T, Ml19F/N185V/Y209W, M119F/S144T/ N185V/S256I, Ml19F/S144W/N185R/S256L, M119F/Y209W, Ml19F/Y209W/S256I, N018K/ A215I, N018K/A215R, N018K/A215V, N018K/G097P/A215I/S256W, N018K/G097P/N185K/ S256W, N018K/G097P/N185K/Y209W/A215I/S256W, N018K/G097P/N185Q/Y209W/A215V/ S256W, N018K/G097P/N185R/A215R/S256W, N018K/G097P/N185R/A215V/S256W, N018K/ G097P/N185R/S256W, N018K/G097P/N185R/Y209W, N018K/G097P/N185R/Y209W/S256WN018K/ G097P/Y209W/A215V/S256W, N018K/N185K, N018K/N185K/A215V/S256W, N018K/N185K/ S256W, N018K/N185K/Y209W/A215R, N018K/N185Q/A215R/S256W, N018K/N185Q/A215V/ 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S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I/L126F/S164F, S087N/G118V/S128L/P129Q/ S130A/V104I/L126F/S164I, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I/S164I, S087N/ G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I/S164Q, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/Y209W, S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/Y209W/A215I/S256W, S087N/G118V/S128L/P129Q/ S130A/Y209W/S256W, S099H/S103I/G118N, S099K/G118R, S099K/S103N/G118T, S099K/ S103P/G118L/S132N, S099K/S103P/G127Q, S099K/S103P/S132H, S099K/S103R/G118A/ S132P, S099N/S132R, S099Q/G118F/G127R, S099Q/G118T/G127Q, S099Q/S103N/G118R/ S132N, S099Q/S103N/G118T, S099Q/S103N/G118T/S132H, S099Q/S103N/S132H, S099Q/ S103P/G118R, S099Q/S103P/G118R/S132N, S099Q/S103P/S132H, S099Q/S132R, S099T/ G118F, S099T/G118R/S132H, S099T/G118T/S132H, S099T/G118T/S132N, S099T/S103P, S099T/S103P/G118L/S132H, S101E/N117I, S101E/N117Y/N248K, S101F/N117I/N248I， S101F/N117Y/N248I, S101F/N117Y/N24SK, S101F/N248K, S101R/N117I/N248K, SlOlR/ N117Y, S101R/N248K, S101T/N117Y/N248K, S101T/N248I, S101V/N248K, S101Y/N117I/ N248K, S101Y/N117Y, S101Y/N248K, S103G/G118I/G127E/S132E, S103L/S132E, S103R/ S132P, S144T/N185R, S144T/N185R/Y209W/S256I, S144T/N185R/Y209W/S256T, S144T/ N185V, S144V/N185R/S256I, S144V/N185R/Y209W, S144V/N185R/Y209W/S256T, S144V/ S256I, S144V/Y209W, S144W/N185R/Y209W/S256T, S144W/N185V/Y209W/S256I, S144W/ S256I、S144Y/Y209W/S256I、V104E/LU6I/S164L，其中所述位置对照 SEQ ID NO 1 所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
在一些其他的实施方案中，本发明提供了分离的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含选自以下的取代的组合:TS87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24ff/S101L/Q109K, S87N/ G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101L/Q109R/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/ P129Q/S130A/I72V/Q109R/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109R/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101Y/Q109L/N185R/A215R, S87R/ G118R/S128L/P129Q/S130A/S101K/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24W/ S101L/Q109L, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101Y/Q109R/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101L/Q109R/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/ S130A/S101Y/Q109R/S188D/T213E/N248R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/I72V/S164I/ S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/ S24W/S101Y/Q109K, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N43S/P52V/S101R/Q109R, S87N/ G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101Y/Q109R/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/ S101L/Q109L/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/Q109R/S164I/S188D/ N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D/S101L, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/ S24W/S101Y/Q109L, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D/S164I， S87R/G118R/S128L/ P129Q/S130A/N76D/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109L/S188D/ N248R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/V118R/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/ S130A/N76D/S101M, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/N76D/G97P/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101L/S164I, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/ S101L/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109L/S188D/T213E/N248R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/Q109L/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/ N18K/G97P/S101L/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101Y/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/T213E/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/ I72V/S101L/Q109L/S164I, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101V/S188D/N248R, S87N/ G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101Y/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/ S130A/I72V/S101V/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101L/T213E/N248R, S87N/ G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101Y/Q109L/S164I, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/ S101H/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/Q109R/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101H/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/ S101L/Q109R/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101L/Q109L/ N185R/A215R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101M/S188D/N248R, N76D/S87R/G118R/ S128L/P129Q/S130A/S188D, N76D/S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/N248K, S87N/ G118V/G127S/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101H/G118V/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101K/ G118V/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101V/G118V/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101Y/G118V/ S128L/P129Q/S130A, S87N/S101L/G118V/S128L/P129Q/S130A, I72V/S87N/G118V/S128L/ PU9Q/S130A//S164I，其中所述位置对照SEQID NO 1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
本发明还提供了分离的核酸，所述核酸编码前文和本文中提出的枯草杆菌蛋白酶变体。本发明进一步提供了包含所述核酸的表达载体，所述核酸编码前文和本文中提出的枯草杆菌蛋白酶变体。此外，本发明提供了包含所述表达载体的宿主细胞，所述载体编码的核酸编码前文和本文中提出的枯草杆菌蛋白酶变体。
本发明还提供了包含本文提供的枯草杆菌蛋白酶变体的清洁组合物。在一些实施方案中，清洁组合物包含液体的、凝胶的、片剂的、粉末的和/或颗粒状的去垢剂。在一些其他实施方案中，所述清洁组合物选自衣物洗涤去垢剂和餐具去垢剂。在一些优选的实施方案中，清洁组合物包含衣物洗涤去垢剂。在一些特别优选的实施方案中，所述起劲组合物是重垢型去垢剂。在其他一些实施方案中，清洁组合物包含选自手洗餐具去垢剂和自动化餐具洗涤去垢剂的餐具去垢剂。在一些优选的实施方案中，本文提供的清洁组合物进一步包含至少一种漂白试剂。在其他一些实施方案中，本文提供的清洁组合物是无磷的，而在一些可选的实施方案中，本文提供的清洁组合物是含磷的去垢剂。在一些其他的实施方案中， 本文提供的清洁组合物是冷水型去垢剂。在一些其他的实施方案中，本文提供的清洁组合物进一步包含至少一种其他的酶。在一些实施方案中，所述清洁组合物包含至少一种其他的酶，所述酶选自半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、金属蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶(perhydrolasess)、角质酶、果胶酶、果胶裂解酶、甘露聚糖酶、 角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、木质酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、 malanases, β -葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶，或其混合物。
本发明还提供了用于清洁的方法，其包括提供待清洁的物品和包含至少一种本文提供的清洁组合物的组合物，以及在有效提供所述物品的清洁的条件下，将所述物品与所述组合物接触。在一些实施方案中，该方法进一步包括在将所述物品与所述清洁组合物接触后，清洗所述物品的步骤。在一些优选的实施方案中，所述待清洁的物品包括餐具。在一些可选的实施方案中，所述待清洁的的物品包括织物。
附图简介

图1提供了多种参照蛋白酶的比对，所述参照蛋白酶包括BPN，(SEQID NO 1)、GC GCI-P036 (SEQ ID NO :2)、GCI_P037 (SEQ ID NO 3)和 GCI-P038 (SEQ ID NO :4)。除非另外说明，则取代位置相对于BPN’给出。
图 2 提供了 pHPLT-GG36 的图。
图3 提供了 p2JH_GG36ci 的图。
图4描述了使用用于变体蛋白酶的eglin c抑制测定所确定的蛋白酶浓度。
图5描述了变体蛋白酶的洗涤性能(BMI微样品)。
发明详述 本发明提供了用于蛋白质改造的方法，和从所述方法产生的丝氨酸蛋白酶变体。 具体而言，本发明提供相比参照丝氨酸蛋白酶具有一个或多个取代的丝氨酸蛋白酶。此外， 本发明提供包含这类丝氨酸蛋白酶变体的组合物。在一些实施方案中，本发明提供了包含至少一种的这类丝氨酸蛋白酶变体的清洁组合物。
出于实践的目的，为了产生对特定应用最优的蛋白质，通常并非必须发现蛋白质空间中的最佳序列。对于大部分应用，待解决的问题是鉴别至少一种满足或超过多个特性要求的最小值的蛋白质序列。这要求关于对特定特性有益的突变的知识，以及对任何理想的特性不利的突变的知识。本发明提供了满足所述目标的手段，通过鉴别蛋白质中这样的位置，所述位置可以被改变从而改良主要特性，并且保持其他特性的值落入理想的范围内。
本发明提供了针对所有的目标特性，评估蛋白质中所有位置的手段，通过在每个位点建立“位点评估文库”。在优选的实施方案中，这类文库在每个位置含有9-19个突变，并用于评估每个位置在改造蛋白质和构建文库中的用途。相对于参照酶测量每种特性，并计算每种变体对比野生型的表观自由能差异。然后，将这类delta delta G( “即，Δ AG”) 表观值用于确定相加性(additivity)。
分析变体的一种理想方式可以是通过在目标过程中变体对比参照蛋白的自由能差异。过程的GilDbs自由能表示系统可以做的最大的功。相对于参照酶(Δ AG)，自由能的改变如下 Δ Δ G = -RT In (k 变体 /k 参照) 其中，是变体酶的速率常数，k_M是参照酶的速率常数，R是Gas法定常数，而 T是绝对温度。大部分测定并非被构建以允许确定真实的自由能，所以利用了这样的数 Δ Δ Gapp = -RT In (P 变体 /P 参照) 其中，是变体的性能值，而P_M是处于相同条件下的参照酶的性能值。可以预期，关于数据分布和相加性，Δ AGapp值以相似的方式与Δ AG相似的方式行动。然而，由于Δ AG是变体相比参照酶可以做的最大量的功，故一般Δ AGapp的量低估了 Δ AG，导致结果似乎是协同的，因为2个相加位置的特性可能大于通过将它们的Δ AGapp值加在一起所预测的值。
此外，本发明提供了枯草杆菌蛋白酶变体和包含这类变体的组合物。
定义 除非另外指出，本发明的实践涉及分子生物学、蛋白质改造、微生物学和重组DNA 中常用的常规技术，落入本领域技术人员的范围内。此类技术是本领域技术人员已知的，描述在多种本领域技术人员熟知的教科书和参考文献中。本文(不论上下文)提及的所有专利、专利申请、文章和出版物，都通过引用并入本文中。
除非本文中另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域领域普通技术人员通常理解的相同含义。许多技术词典是本领域技术人员已知的。虽然任何与本文所述相似或等价的方法和材料都可用于本发明的实践中，但优选的方法和材料是本文所述的。因而，通过整体的参照说明书更详细的描述了下文直接定义的术语。如本文中使用的，单数“一”、“该”和“这个”也包括了复数的指代，除非语境中另外明确指出。 数值范围包括了定义范围的数。除非另外指出，核酸按从左到右5’至3’方向书写；氨基酸序列按从左到右氨基至羧基方向书写。可以理解，本发明并非意在限于所述特定的方法、规程和试剂，因其可以根据它们被本领域技术人员所使用的环境而改变。
除非另外指出，本发明的实践使用蛋白质纯化、分子生物学、微生物学、重组DNA 技术和蛋白质测序的常规技术，均落入本领域技术人员的知识范围内。
此外，本文提供的小标题不是对本发明的各方面或实施方案的限制，所述限制可以通过整体参照说明书得出。因而，通过整体的参照说明书更详细的定义了下文直接定义的术语。无论如何，为了促进对发明的理解，下文定义的多个术语。
如本文中使用的，术语“蛋白酶”和“蛋白水解活性”指表现出水解肽或具有肽键的底物的能力的蛋白质或肽。存在许多普遍已知的用于测量蛋白水解活性的程序 (Kalisz, "Microbial Proteinases,，，In :Fiechter (编著)，Advances in Biochemical EnRineerinR/BiotechnoloRY, )。例如，可以通过比较性测定来确定蛋白水解活性， 所述测定分析了各种蛋白酶水解商业底物的能力。可用于分析蛋白酶或蛋白水解活性的示例性底物包括但不限于二甲基酪蛋白(Sigma C-9801)、牛胶原蛋白(Sigma C-9879)、牛弹性蛋白(Sigma E-1625)和牛角蛋白(ICN Biomedical 902111)。比色测定利用的这类底物是本领域普遍已知的(见例如，WO 99/34011和U. S.专利号6，376，450，均通过引用并入本文中)。pNA 测定(见例如，Del Mar 等，Anal.Biochem. ,99 :316-320 )也可用于确定在梯度洗脱过程中收集的级分的活性酶浓度。该测定测量了酶水解可溶性的合成底物—— 琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-脯氨酰-苯丙氨酰-对硝基苯胺(suc-AAPF-pNA)——时释放对硝基苯胺的速率。在分光光度计上，测量410nm处从水解反应产生黄色的速率，所述速率与活性酶浓度成正比。此外，280nm处的吸收测量值可以用于确定总蛋白浓度。活性酶/总蛋白比例给出酶纯度。
如本文中使用的，术语“枯草杆菌蛋白酶”指MEROPS——肽酶数据库(Rawlings 等，MEROPS the peptidase database, Nucl Acids Res,34 Database issue, D270-272, 2006)中描述的S8蛋白酶家族的任何成员。如本文中使用的，肽酶家族S8含有丝氨酸内肽酶枯草杆菌蛋白酶及其同源物(Biochem J，290 :205_218，1993)。家族S8也称为subtilase 家族，是丝氨酸肽酶中的第二大家族，可以分为2个亚族，枯草杆菌蛋白酶(S08.001)是亚族S8A的典型例子，keXin(S08.070)是亚族S8B的典型例子。以前认为三肽基肽酶 IKTPP-II ；S08. 090)是第三亚族的典型例子，但已确定为错误分类。家族S8成员的序列中具有顺序为Asp、His和kr的催化三联体，与家族Si、S9和SlO的三联体顺序不同。在亚族S8A中，活性位点残基经常存在于基序Asp-ThrAer-Gly (与集团(Clan)AA中的天冬氨酸内肽酶家族中的序列基序相似)、His-Gly-Thr-His和Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Xaa-Pro 中。在亚族S8 B中，催化残基经常存在于基序Asp-Asp-Gly、His-Gly-Thr-Arg和 Gly-Thr-Ser-Ala/Val-Ala/Ser-Pro中。S8家族的大部分成员是内肽酶，在中性-弱碱性 PH下是活性的。该家族中的许多肽酶是热稳定的。酪蛋白通常用作蛋白质底物，而一般合成底物是suc-AAPF。该家族中的大部分成员是非特异性的肽酶，优先在疏水性残基之后切割。然而，亚族S8 B的成员，例如keXin(S08.070)和弗林蛋白酶(S08.071)，在氨基二元酸之后切割。S8家族的大部分成员被普通的丝氨酸肽酶抑制剂抑制，例如DFP和PMSF。由于家族的大部分成员出于稳定性的目的结合钙，因而用EDTA和EGTA可观察到抑制作用，后两者通常被认为是金属肽酶的特异性抑制剂。蛋白质抑制剂包括火鸡卵粘蛋白第三结构域 (101. 003)、链霉菌属(Sti^ptomyces)枯草杆菌蛋白酶抑制剂(116. 003)，和家族113的成员，例如eglin C(I13. 001)和大麦抑制剂CI_1A(I13. 005)，其中许多也抑制胰凝乳蛋白酶 (SOLOOl)0枯草杆菌蛋白酶前肽自身抑制的，而来自酵母属(Saccharomyces)的同源蛋白酶B抑制剂则抑制cereviSin(S08. 052)。现已确定了家族S8的若干成员的三级结构。一般S8蛋白质结构由3层具有夹在2层螺旋之间的7条链β片层组成。枯草杆菌蛋白酶 (S08.001)是集团SB(SB)的典型结构。尽管结构不同，但枯草杆菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶 (S01. 001)的活性位点可以重叠，提示相似性是趋同进化而非趋异进化的结果。
如本文中使用的，术语“蛋白酶变体，，和“变体蛋白酶”用于指代与参照蛋白酶相似，特别是功能相似，但其氨基酸序列中具有突变的蛋白酶，使它们的序列在从1个至20个位置上与野生型蛋白酶不同。在图1的比对中显示了若干示例性参照蛋白酶的成熟区域的氨基酸序列。在一些优选的实施方案中，本发明提供了 “GG36变体”，其中突变存在于SEQ ID NO 2所示的成熟GG36序列中。
如本文中使用的，“芽孢杆菌属”包括本领域技术人员已知落入“芽孢杆菌”属中的所有物种，包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(B. Iicheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B. Ientus)、短芽孢杆菌(B. brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B. stearothermophilus)、 嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、 耐盐芽孢杆菌(B. halodurans)、巨大芽孢杆菌(B. megaterium)、凝结芽孢杆菌 (B. coagulans)、环状芽孢杆菌(B. circulans)、灿烂芽孢杆菌(B. Iautus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。认识到芽孢杆菌属持续经历着分类学的重新组织。因而，预计所述属包括已重分类的物种，包括但不限于此类生物体，例如嗜热脂肪芽孢杆菌，现称为“嗜热脂肪地芽孢杆菌(GecAacillus stearothermophilus)”。在存在氧的条件下产生耐受性内孢子被认为是芽孢杆菌属的决定性特征，虽然该特征也应用于目前称为脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、解硫胺素芽孢杆菌属 (Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌(Brevibacillus)、 Filobacillus,薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、 类芽孢杆菌属(Paenikicillus)、需盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、耐热芽孢杆菌属 (Thermobacillus)、Ureibacillus 禾口枝芽抱杆菌属(Virgibacillus)。
术语“多核苷酸”和“核酸”，在本文中可互换的使用，指任意长度的核苷酸的聚合形式，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。这类术语包括但不限于单链、双链或三链DNA、基因组DNA、cDNA、RNA, DNA-RNA杂合体，或包含嘌呤和嘧啶碱基，或其他天然的、化学的、生物化学的修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的多聚体。下列是多核苷酸的非限制性实例 基因、基因片段、染色体片段351\外显子、内含子、1^嫩、〖1 嫩、沙嫩、核酶、(^嫩、重组多核苷酸、分支的多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离的DNA、任意序列的分离的RNA、核酸探针，和引物。在一些实施方案中，多核苷酸包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶、其他的糖类和链接基团，例如氟核糖和硫酰，以及核苷酸支链。在可选的实施方案中，通过非核苷酸组分中断核苷酸的序列。
如本文中使用的，术语“DNA构建体”和“转化DNA”可互换的用于指用于将序列导入宿主细胞或生物体中的DNA。可以通过PCR或任何本领域技术人员已知的其他合适的技术，在体外产生DNA。在特别优选的实施方案中，DNA构建体包括目标序列(例如，作为引入序列)。在一些实施方案中，序列与其他元件有效连接，例如控制元件(例如，启动子等)。 DNA构建体可以进一步包含选择性标志物。它可以进一步包含两侧有同源盒的引入序列。 在进一步的实施方案中，转化DNA包含添加在其末端的其他非同源序列(例如，填充序列或侧翼)。在一些实施方案中，引入序列的末端是封闭的，使得转化DNA形成封闭的环。转化序列可以是野生型、突变或修饰的。在一些实施方案中，DNA构建体包含与宿主细胞染色体同源的序列。在其他实施方案中，DNA构建体包含非同源的序列。一旦在体外装配了 DNA构建体，则它可用于1)将异源序列插入到宿主细胞的理想的靶序列中，和/或2)突变宿主细胞染色体的区域(即，用异源序列替换内源序列)，3)删除靶基因，和/或4)将复制质粒导入宿主中。
如本文中使用的，术语“表达盒”和“表达载体”指重组或合成产生的核酸构建体， 具有一系列专门的核酸元件，所述核酸元件允许特定核酸在靶细胞中的转录。可以将重组表达盒整合到质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。一般的，除其他序列外，表达载体的重组表达盒部分包括待转录的核酸序列和启动子。在优选的实施方案中，表达载体具有在宿主细胞中整合和表达异源DNA片段的能力。许多原核和真核表达载体是可商购的。适当的表达载体的选择落入本领域技术人员的知识范围内。术语“表达盒”在本文中可与“DNA构建体”及其语法学的等价体互换的使用。适当表达载体的选择落入本领域技术人员的知识范围内。
如本文中使用的，术语“载体”指涉及用于将核酸导入一种或多种细胞类型中的多核苷酸构建体。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、盒等。在一些实施方案中， 多核苷酸构建体包含编码蛋白酶(例如，前体或成熟的蛋白酶)的DNA序列，所述DNA序列与能够在合适的宿主中进行DNA表达的合适的前序列(例如，分泌性的等)有效连接。
如本文中使用的，术语“质粒”指用作克隆载体的环状双链(ds)DNA构建体，所述构建体在一些真核或原核细胞中形成染色体外的自我复制性遗传元件，或整合到宿主染色体中。
如本文中使用的，在将核酸序列导入到细胞中的语境中，术语“导入”指适合将核酸序列转移到细胞中的任何方法。此类用于导入的方法包括但不限于原生质体融合、转染、 转化、接合和转导(见例如，Ferrari 等，“Genetics，”in Hardwood 等，(编著)，Bacillus, Plenum Publishing Corp.，第 57-72 页， )。
如本文中使用的，术语“转化”和“稳定的转化”指具有这样的非天然(异源的) 多核苷酸序列的细胞，所述序列整合到所述细胞的基因组中，或作为附加体质粒维持至少2 个世代。
如本文中使用的，当核酸置于与另一种核酸序列的功能性关系中时，所述核酸是 “有效连接”的。例如，如果作为参与多肽分泌的前蛋白质表达，则编码分泌性前导子(即， 信号肽)的DNA是与多肽的DNA有效连接的；如果启动子或增强子影响序列的转录，则它们是与编码序列有效连接的；或者如果核糖体结合位点的放置有利于翻译，则它是与编码序列有效连接的。一般而言，“有效连接”意指所连接的DNA序列是连续的，和在分泌性前导子的情况下，是以可读相(reading phase)连续的。然而，增强子不是必须连续的。通过在方便的限制性位点连接而完成连接。如果不存在此类位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
如本文中使用的，术语“基因”指编码多肽的多核苷酸(例如，DNA片段)，并包括在编码区之前和之后的区域，以及在单个的编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
如本文中使用的，“同源基因”指来自不同但通常相关的物种的成对基因，它们彼此对应，并且彼此相同或高度相似。该术语涵盖了被物种形成(即，新物种的产生)分开的基因(例如，直向同源基因)，以及被基因复制分开的基因(例如，旁系同源基因)。
如本文中使用的，如果蛋白质具有相同排列的相同的主要二级结构且具有相同的分类学联系，则所述蛋白质定义为具有共同“折叠(fold)”。具有相同折叠的不同蛋白质通常具有大小和构象不同的二级结构的外周元件和转角区。在一些情况下，这些不同的外周区可以包含一半的所述结构。一起置于相同的折叠类别中的蛋白质不必需具有共同的进化起源(例如，源自蛋白质的物理和化学的、有利于某些压缩排列(packing arrangement)和链拓扑学的结构相似性)。
如本文中使用的，“同源性”指序列的相似性或同一性，优选指同一性。这种同源性是使用本领域已知的标准技术确定的(见例如，Smith和Waterman，Adv. App 1. Math.， 2 :482 ；Needleman 和Wunsch，J. Mol. Biol. ,48 :443 ；Pearson 和 Lipman， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 :2444 ；程序例如 Wisconsin 遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package)中的 GAP、BESTFIT、FASTA 和TFASTA (Genetics Computer Group、Madison、WI)；以及 Devereux 等，Nucl. Acid Res. , 12 :387-395 )。
有效算法的一个实例是PILEUP。PILEUP使用渐进的、成对的比对，从一组相关的序列中产生多重序列比对。它还可以绘制树状图，显示用于产生比对的成簇关系。PILEUP 使用Feng和 Doolittle的渐进比对方法的简化版O^eng和Doolittle，J. Mol. Evol. ,35 351-360 )。所述方法与 Higgins 和 Sharp 所述的方法相似(Higgins 和 Sharp，CABIOS 5 151-153 )。有效的PILEUP参数包括默认的空位权重3. 00，默认的空位长度权重 0. 10，和加权的末端空位。
有效算法的另一个实例是BLAST算法，如Altschul等(Altschul等，J. Mol. Biol.， 215 :403-410, ；和 Karlin 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 :5873-5787 )所述。特别有效的 BLAST 程序是 WU-BLAST-2 程序(见，Altschul 等，Meth. Enzymol.，266 460-480 )。WU-BLAST-2使用若干搜索参数，大部分设定为默认值。可调节的参数用下列值设定重叠跨度=1，重叠分数=0. 125，字节阈值(T) = 11。HSP S和HSP S2参数是动态值，由程序本身根据特定序列的组成和将搜索目标序列的特定数据库的组成而确定的。然而，可以调节所述值以增加灵敏度。通过匹配的相同残基数除以比对区域中“较长” 序列的残基总数，来确定氨基酸序列同一性的值。“较长”序列是在比对区域中具有最多实际残基的序列(忽视WU-Blast-2为了最大化比对分数而导入的空位)。
因而，“百分比(％ )核酸序列同一性”定义为候选序列中，与起始序列(即，目标序列)的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。优选的方法利用WU-BLAST-2的BLASTN 模块，设定为默认参数，具有重叠跨度和重叠分数分别设为1和0. 125。
如本文中使用的，“重组”包括指代细胞或载体，其通过引入异源核酸序列而进行修饰，或者该细胞来源于上述修饰的细胞。因此，例如，由于有意的人为干预，重组细胞表达不以相同形式存在于天然(非重组)形式的细胞中的基因，或者表达本来异常表达、低表达或完全不表达的天然基因。“重组”和产生“重组”核酸一般组装两个或更多个核酸片段，其中这种组装产生嵌合基因。
在一些优选的实施方案中，产生在至少一个密码子处进行位点饱和诱变的突变 DNA序列。在另一优选的实施方案中，对两个或多个密码子进行位点饱和诱变。在进一步的实施方案中，突变DNA序列与野生型序列具有高于约50 %、高于约55 %、高于约60 %、高于约65 %、高于约70 %、高于约75 %、高于约80 %、高于约85 %、高于约90 %、高于约95 % 或高于约98%的同源性。在备选实施方案中，突变DNA使用任何已知的诱变方法在体内产生，例如辐射、亚硝基胍等。接着分离期望的DNA序列并用于本文提供的方法。
如本文中使用的，术语“扩增，，和“基因扩增，，指不成比例的复制特定DNA序列的过程，使得所扩增的基因成为高于其初始存在于基因组中的拷贝数而存在。在一些实施方案中，通过在存在药物(例如，可抑制的酶的抑制剂)的条件下生长，来选择细胞，导致编码基因产物的内源基因的扩增，或者导致编码该基因产物的外源(即，输入的)序列的扩增， 或者两者的扩增，其中所述基因产物是在存在药物的条件下的生长所必需的。
“扩增”是涉及模板特异性的核酸复制的特殊情况。它与非特异性模板复制(即， 是模板依赖性的复制，但并不依赖于特定的模板)相反。模板特异性在此有别于复制的保真性(即，正确的多核苷酸序列的合成)和(核糖或脱氧核糖)核苷酸特异性。模板特异性经常以“靶”特异性来描述。靶序列是这样含义的“靶”，即它们被视为是从其他核酸中挑选出来的。扩增技术主要是出于该挑选而设计的。
如本文中使用的，术语“引物”指当置于引物延伸产物合成的条件下时，能够作为合成起点发挥作用的寡核苷酸，不论是作为纯化的限制性酶消化产物而天然存在的，还是合成产生的，其中所述延伸产物是与诱导的核酸链互补的(即，在存在核苷酸和诱导剂如 DNA聚合酶的条件，以及合适的温度和pH)。出于复制的最大效率，引物优选是单链，但可以可选的是双链的。如果是双链的，则首先处理引物，在用于制备延伸产物前分离它的链。优选的，引物是寡聚脱氧核糖核苷酸。引物必需足够长，以在存在诱导剂的条件下引发延伸产物的合成。引物的实际长度将取决于多种因素，包括温度、引物来源和所使用的方法。
如本文中使用的，术语“探针”指能够与另一种目标寡核苷酸杂交的寡核苷酸(即核苷酸的序列)，不论是作为纯化的限制性酶消化产物而天然存在的，还是合成的、重组的或通过PCR扩增而产生的。探针可以是单链的或双链的。探针可用于检测、鉴别和分离特定的基因序列。可以预期，可以用任何“报告分子”标记用于本发明中的任何探针，使得它在任何检测系统中是可检测的，包括但不限于酶(例如，ELISA，以及基于酶的组织化学测定)、荧光、放射性自显影和化学发光系统。本发明并非意在限于任何特定的检测系统或标记。
如本文中使用的，当用于指代聚合酶链式反应时，术语“靶”指用于聚合酶链式反应的引物所结合的核酸区域。因而，“靶”被认为是从其他核酸序列中挑选出来的。“片段” 定义为靶序列中的核酸区域。
如本文中使用的，术语“聚合酶链式反应(PCR) ”指美国专利号4，683，195、 4，683，202和4，965，188(引入本文作为参考)的方法，其包括在不进行克隆或纯化的条件下，用于增加基因组DNA混合物中靶序列片段浓度的方法。该用于扩增靶序列的过程是本领域普遍已知的。
如本文中使用的，术语“扩增试剂”指这样的试剂(脱氧核糖核苷酸三磷酸、缓冲液，等)，所述试剂是除引物、核酸模板和扩增酶以外，扩增所需要的。一般的，将扩增试剂与其他反应组分一起放置，并包含在反应容器(试管、微孔等)中。
如本文中使用的，术语“限制性内切酶”和“限制性酶”指细菌的酶，每种所述的酶在特定的核苷酸序列处或其附近切割双链DNA。
“限制性位点”指被给定的限制性内切酶识别和切割的核苷酸序列，经常是DNA片段插入物的位点。在本发明的某些实施方案中，将限制性位点改造到选择性标志物中，以及 DNA构建体的5，和3，末端中。
“同源重组”意指在相同或几乎相同的核苷酸序列的位点，两种DNA分子或成对染色体之间的DNA片段的交换。在优选的实施方案中，染色体整合是同源重组。
如本文中使用的，“氨基酸”指肽或蛋白质序列或其部分。术语“蛋白质”、“肽”和 “多肽”可互换的使用。
如本文中使用的，“目标蛋白”和“目标多肽”指理想的和/或正在进行评估的蛋白质/多肽。在一些实施方案中，目标蛋白在胞内表达，而在其他实施方案中，目标蛋白是分泌的多肽。在特别优选的实施方案中，这些酶包括本发明的丝氨酸蛋白酶。在一些实施方案中，目标蛋白是与信号肽(即，待分泌蛋白质的氨基端延伸)融合的分泌多肽。几乎所有的分泌蛋白质都利用氨基端末端的蛋白质延伸，其在前体蛋白跨膜的靶向和转运中发挥关键作用。这种延伸在膜转运过程中或转运后立即被信号肽酶通过蛋白水解切除。
如果多核苷酸的天然状态或当通过本领域技术人员已知的方法操作时，它可以转录和/或翻译成产生RNA、多肽或其片段，则所述多核苷酸被称为“编码”所述RNA或所述多肽。此类核酸的反义链也被称为编码所述序列。如本领域已知的，DNA可以通过RNA聚合酶转录来产生RNA，而RNA可以通过逆转录酶逆转录来产生DNA。因而，DNA可以编码RNA， 反之亦然。
“宿主菌株”或“宿主细胞”指用于表达载体的合适的宿主，所述表达载体包含根据本发明的DNA。
如果酶在细胞中表达的水平高于它在相应的野生型细胞中表达的水平，则所述酶在宿主细胞中是“过表达的”。
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。本公开文本中全篇均使用与 IUPAC-IUB生物化学命名委员会(JCBN) —致的3字母氨基酸代码。可以理解，由于遗传密码的简并性，可以由一种以上的核苷酸序列编码一种多肽。
“前序列，，是在信号序列和成熟蛋白酶之间的氨基酸序列，是蛋白酶的分泌所必需的。前序列的切割导致成熟的活性蛋白酶。
术语“信号序列”或“信号肽”指可参与成熟或前体形式的蛋白质分泌的任何核苷酸和/或氨基酸序列。信号序列的该定义是功能性的，意在包括所有上述的氨基酸序列， 所述信号序列是由蛋白质基因的N端部分编码的，参与蛋白质分泌的实行。它们通常但不总是与蛋白质的N端部分或前体蛋白质的N端部分结合。信号序列可以是内源性的或外源性的。信号序列可以是与所述蛋白质(例如，蛋白酶)正常相关的，或者可以来自编码另一种分泌蛋白质的基因。一个示例性的外源信号序列包含来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的信号序列的前七个氨基酸残基，所述残基与迟缓芽孢杆菌(ATCC 21536)的枯草杆菌蛋白酶的信号序列剩余部分融合。
术语“杂交信号序列，，指这样的信号序列，其一部分是从表达宿主获得的，所述部分与待表达的基因的信号序列融合。在一些实施方案中，利用合成序列。
术语“成熟”形式的蛋白质或肽指蛋白质或肽的最终功能形式。
术语蛋白质或肽的“前体”形式指具有与蛋白质的氨基或羧基端有效连接的前序列的蛋白质的成熟形式。前体也可以具有与前序列的氨基端有效连接的“信号”序列。前体还可以具有涉及翻译后活性(例如，从其切除多核苷酸，留下成熟形式的蛋白质或肽)的其他多核苷酸。
“天然存在的酶”指具有与自然界中相同的未修饰氨基酸序列的酶。天然存在的酶包括天然酶，由特定的微生物表达或存在于其中的那些酶。
术语“来自”和“得自”不仅指由或可由目的生物菌株产生的蛋白酶，还指由从这些菌株中分离的DNA序列编码并在含有此类DNA序列的宿主生物中产生的蛋白酶。此外， 该术语指由合成和/或cDNA来源的DNA序列编码并具有目的蛋白酶的所述鉴定特征的蛋
91白酶。例如，“来自芽孢杆菌的蛋白酶”指具有芽孢杆菌天然产生的蛋白水解活性的酶，以及这样的丝氨酸蛋白酶，其与芽孢杆菌来源所产生的酶相似，但使用遗传工程技术由转化有编码该丝氨酸蛋白酶的核酸的非芽孢杆菌生物产生。
该定义范围内的“衍生物”通常保留野生型、天然或亲本(reference)形式中观察到的特征性蛋白水解活性，其保留程度使得该衍生物可用于与所述野生型、天然或亲本形式相似的目的。丝氨酸蛋白酶的功能性衍生物包括天然存在的、合成或重组产生的肽或肽片段，其具有本发明丝氨酸蛋白酶的一般特征。
术语“功能性衍生物”指核酸的衍生物，其具有编码丝氨酸蛋白酶的核酸的功能性特征。编码本发明丝氨酸蛋白酶的核酸的功能性衍生物包括天然存在的、合成或重组产生的核酸或片段，并编码本发明的特征性丝氨酸蛋白酶。编码本发明丝氨酸蛋白酶的野生型核酸包括天然存在的等位基因以及基于本领域已知的遗传密码简并性的同源物。
术语“相同”在两个核酸或多肽序列的情况下指以最高对应性为目的比对后在两序列中相同的残基，这使用以下序列比较或分析算法之一来测量。
术语“最佳比对”指该比对给出最高的百分比同一性分数。
就两个氨基酸、多核苷酸和/或基因序列(适当地)而言，“百分比序列同一性”、 “百分比氨基酸序列同一性”、“百分比基因序列同一性”和/或“百分比核酸/多核苷酸序列同一性”指所述序列在最佳比对后两序列中相同残基的百分比。因此，80%氨基酸序列同一性表示在两个最佳比对的多肽序列中80 %的氨基酸是相同的。
因而，短语“基本相同”在两个核酸或多肽的情况下指使用程序或算法(例如， BLAST、ALIGN、CLUSTAL)使用标准参数与参考序列比较时包含至少约70%序列同一性、优选至少约75%、优选至少约80%、优选至少约85%、优选至少约90%、优选至少约95%、优选至少约97%、优选至少约98%并优选至少约99%序列同一性的多核苷酸或多肽。两多肽基本相同的一个指标是第一个多肽与第二个多肽具有免疫学交叉反应性。一般地，由于保守性氨基酸替换而不同的多肽具有免疫学交叉反应性。因此，当两多肽仅由于保守性替换而不同时，一个多肽与另一多肽基本相同。两核酸序列基本相同的另一指标是这两个分子在严格条件下(例如，在中至高严格条件下)彼此杂交。
术语“等同的”在本文中指由在中至高严格条件下，能够与具有SEQID N0:1或 SEQ ID NO :5所示序列的多核苷酸杂交的多核苷酸所编码的丝氨酸蛋白酶。例如，等同的表示等同的成熟丝氨酸蛋白酶与具有SEQID NO :1或SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的成熟 BPN，或GG36丝氨酸蛋白酶包含至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90 %、至少约91%、至少约92 %、至少约93 %、至少约94 %、至少约95 %、至少约96 %、至少约97%、至少约98%和/或至少约99%序列同一性。
术语“分离的”或“纯化的”指从其原始环境(例如，如果是天然存在的，则为其天然环境)从移出的材料。例如，如果材料在特定组合物中以高于天然或野生型生物中的浓度存在，或者与在天然或野生型生物中表达后通常不存在的组分组合，则它是“纯化的“。例如，存在于活动物中的天然多核苷酸或多肽不是分离的，但相同的多核苷酸或多肽在与该天然系统中的一些或所有共存材料分开后则是分离的。这样的多核苷酸可以是载体的一部分，和/或这样的多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，但仍然是分离的，因为此类载体或组合物不是其天然环境的一部分。例如，在优选的实施方案中，如果核酸或蛋白质在电泳凝胶或印迹中基本给出一条带，则称其是纯化的。
在涉及DNA序列使用时，术语“分离的”指这样的DNA序列，其从其天然遗传环境中移出，因此不含有其他外来的或不想要的编码序列，并且为适于在经遗传改造的蛋白质产生系统中使用的形式。这样的分离的分子是从其天然环境中分离的分子，包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离的DNA分子不含有与其通常相关联的其他基因，但可能包含天然存在的5’和3’非翻译区，例如启动子和终止子。相关区域的鉴定对于本领域普通技术人员而言是很明显的(见例如，Dynan和Tijan, Nature 316 :774-78 )。术语“分离的 DNA序列”也称为“克隆的DNA序列”。
在涉及蛋白质使用时，术语“分离的”指在其天然环境以外的条件下存在的蛋白质。在一种优选形式中，分离的蛋白质基本不含其他蛋白质，特别是其他同源蛋白质。通过 SDS-PAGE测定时，分离的蛋白质的纯度高于约10%，优选高于约20%，甚至更优选高于约 30%。本发明的另一些方面包括通过SDS-PAGE测定为高纯化形式(即纯度高于约40%、高于约60 %、高于约70 %、高于约80 %、高于约90 %、高于约95 %、高于约97 %，甚至高于约 99% )的蛋白质。
如本文中使用的，术语“组合诱变”指产生起始序列的变体文库的方法。在这些文库中，变体含有选自预定突变组的一个或多个突变。此外，该方法提供了引入不在预定突变组中的随机突变的方法。在一些实施方案中，该方法包括2000年10月沈日提交的美国专利申请序列号09/699. 250中公开的方法，该申请并入本文作为参考。在备选实施方案中， 组合诱变方法包括市售的试剂盒Gfi^n，QUIKCHANGE MUltisite(Mratagene))。
如本文中使用的，术语“突变体文库”指基因组大部分相同但包含一个或多个基因的不同同源物的细胞群。这样的文库可用于例如鉴定具有改进性状的基因或操纵子。
如本文中使用的，术语“起始基因”指编码待使用本发明进行改进和/或改变的目的蛋白的目的基因。
如本文中使用的，术语“多重序列比对” (“MSA”)指使用算法(例如，Clustal W) 比对的起始基因的多个同源物的序列。
如本文中使用的，术语“共有序列”和“范例序列”指将特定蛋白质或目的序列的所有变体与其进行比较的原型氨基酸序列。该术语还指显示目的DNA序列中最常存在的核苷酸的序列。对基因的每个位置而言，共有序列给出在MSA中该位置上丰度最高的氨基酸。
如本文中使用的，术语“共有突变”指起始基因与共有序列之间的序列差异。共有突变通过将起始基因的序列与从MSA所得共有序列进行比较来鉴定。在一些实施方案中， 将共有突变引入起始基因中，以使其与共有序列更为相似。共有突变还包括这样的氨基酸改变该改变将起始基因中的氨基酸改变成MSA中发现的在该位置上频率高于起始基因中氨基酸的频率的氨基酸。因此，术语共有突变包括将起始基因中的氨基酸替换为比MSA中氨基酸更丰富的氨基酸的所有单个氨基酸改变。
如本文中使用的，术语“初始命中”指通过筛选组合共有诱变文库而鉴定的变体。 在优选的实施方案中，初始命中与起始基因相比具有改进的性能特征。
如本文中使用的，术语“改进命中”指通过筛选增强的组合共有诱变文库而鉴定的变体。
如本文中使用的，术语“改进突变”和“性能增强突变”指在引入起始基因时导致性能改善的突变。在一些优选的实施方案中，通过在所述方法的筛选步骤过程中鉴别的测序命中来鉴别这类突变。在多数实施方案中，与未筛选的组合共有诱变文库相比，命中中更频繁出现的突变很可能是改善的突变。
如本文中使用的，术语“增强的组合共有诱变文库”指基于之前轮次的CCM诱变和筛选的筛选和/或测序结果而设计和构建的CCM文库。在一些实施方案中，增强的CCM文库是基于之前轮次的CCM所得初始命中的序列。在另一些实施方案中，设计增强的CCM以有利于在之前轮次的诱变和筛选中的初始命中中更常见的突变。在一些优选的实施方案中， 这通过省略编码性能降低突变的引物来实现，或者通过相对于之前的CCM文库中所使用其他引物提高编码性能增强突变的引物的浓度来实现。
如本文中使用的，术语“性能降低突变”指在组合共有诱变文库中的突变，其在筛选所得命中中的频率与未筛选的组合共有诱变文库相比更低。在优选的实施方案中，筛选方法除去和/或降低含有“性能降低突变”的变体的丰度。
如本文中使用的，术语“功能性测定”指提供蛋白质活性的指标的测定。在特别优选的实施方案中，该术语指分析蛋白质以其通常的能力发挥功能的测定系统。例如，对于酶的情况，功能性测定包括测定该酶在催化反应方面的有效性。
如本文中使用的，术语“靶特性”指待改变的起始基因的特性。本发明并不意在仅限于任何特定的靶特性。然而，在一些优选的实施方案中，靶特性为基因产物的稳定性(例如，对变性、蛋白水解或其他降解因素的抗性)，而在另一些实施方案中，改变了在产生宿主中的产生水平。事实上，起始基因的任何特性均可用于本发明。
如本文中使用的，在核酸的情况下，术语“特性”或其语法等同语指核酸的任何可以选择或检测的特性或属性。这些特性包括但不限于影响与多肽结合的特性、赋予包含特定核酸的细胞的特性、影响基因转录的特性(如启动子强度、启动子识别、启动子调节、增强子功能)、影响RNA加工的特性(例如，RNA剪接、RNA稳定性、RNA构象和转录后修饰)、 影响翻译的特性(例如，水平、调节、mRNA与核糖体蛋白的结合、翻译后修饰)。例如，可以改变核酸的转录因子、聚合酶、调节因子等的结合位点，以产生期望的特征或鉴定不期望的特征。
如本文中使用的，在多肽的情况下，术语“特性”或其语法等同语指多肽的任何可选择或检测的特征或属性。这些特性包括但不限于氧化稳定性、底物特异性、催化活性、热稳定性、碱稳定性、PH活性谱、对蛋白水解降解的抗性、KM、k。at、k。at/kM比、蛋白质折叠、诱导免疫应答、结合配体的能力、结合受体的能力、分泌能力、展示于细胞表面的能力、寡聚化能力、信号能力、刺激细胞增殖的能力、抑制细胞增殖的能力、诱导凋亡的能力、通过磷酸化或糖基化进行修饰的能力，和/或治疗疾病的能力等。
如本文中使用的，术语“筛选”具有本领域的通常含义，一般为多步骤过程。在第一步中，提供突变核酸或其变体多肽。在第二步中，测定该突变核酸或变体多肽的特性。在第三步中，将所测特性与相应的前体核酸的特性、相应天然多肽的特性或产生该突变核酸的起始材料(例如，初始序列)的特性进行比较。
对于本领域技术人员而言很明显的是，用于获得具有改变特性的核酸或蛋白质的筛选方法取决于起始材料的特性，将通过产生该突变核酸来促进其修饰。因此，本领域技术人员会理解，本发明不受限于任何待筛选的具体特性，以下特性描述仅列出了说明性的实例。用于筛选任何特定特性的方法已在本领域中有一般性描述。例如，可以在突变前后测量结合、pH、特异性等，其中的变化表明产生了改变。优选地，以高通量方式进行筛选，包括同时筛选多个样品，包括但不限于使用芯片、噬菌体展示和多种底物和/或指示剂进行的测定。
在一些实施方案中，本文使用的筛选涵盖了选择步骤，其中从变体群中富集目的变体。这些实施方案的实例包括选择赋予宿主生物生长优势的变体，以及噬菌体展示或任何其他展示方法，其中变体可基于其结合或催化特性而从变体群中被捕获。在优选的实施方案中，使变体文库暴露于胁迫(例如，热、蛋白酶、变性等)，其后在筛选中鉴定仍完整的变体或通过选择来富集所述变体。该术语旨在涵盖任何合适的选择方法。事实上，本发明并非意在限于任何特定的筛选方法。
如本文中使用的，术语“靶向随机化”指产生其中一个或多个位置已被随机化的复数序列的方法。在一些实施方案中，随机化是完全随机化(即，所有的四种碱基A、T、G和 C都可出现在随机化位置)。在备选实施方案中，核苷酸的随机化仅限于这四种核苷酸的一个亚组。靶向随机化可应用于序列的一个或多个密码子，编码一种或多种目的蛋白。表达时，所得的文库产生蛋白质群，其中一个或多个氨基酸位置可含有所有20种氨基酸或氨基酸亚组的混合物，这是由随机化密码子的随机化方案决定。在一些实施方案中，靶向随机化所得群体中的个体成员由于密码子的靶向或随机插入或缺失而存在氨基酸数目的差异。在另一些实施方案中，所产生的蛋白质群中包括合成的氨基酸。在一些优选的实施方案中，靶向随机化所得群体中的多数成员与起始基因相比与共有序列显示更高的序列同源性。在一些实施方案中，所述序列编码一种或多种目的蛋白。在备选实施方案中，所述蛋白质具有不同的生物功能。在一些优选的实施方案中，引入序列包含至少一个选择性标志物。该序列可以编码一种或多种目的蛋白。它可以具有其他的生物学功能。在许多情况下，引入序列可包括选择性标志物，例如产生对抗生素抗性的基因。
术语“修饰序列，，和“修饰基因”在本文中可互换使用，指包含天然核酸序列的缺失、插入或中断的序列。在一些优选的实施方案中，修饰序列的表达产物是截短的蛋白质 (例如，如果修饰是序列的缺失或中断的话)。在一些特别优选的实施方案中，所述截短的蛋白质保留生物活性。在备选实施方案中，修饰序列的表达产物是延长的蛋白质(例如，包含核酸序列中的插入的修饰)。在一些实施方案中，插入导致截短的蛋白质(例如，当插入导致形成终止密码子时)。因此，插入可产生截短蛋白或延长的蛋白作为表达产物。
如本文中使用的，术语“突变序列”和“突变基因”可互换使用，指在宿主细胞的野生型序列的至少一个密码子处含有改变的序列。突变序列的表达产物是相对于野生型含有改变的氨基酸序列的蛋白质。表达产物可具有改变的功能能力(例如增强的酶活性)。
术语“诱变引物”或“诱变寡核苷酸”(在本文中可互换使用)意在表示对应于模板序列的一部分并能与其杂交的寡核苷酸组合物。就诱变引物而言，该引物可以不与模板核酸精确匹配，引物中的错配用于将期望的突变引入核酸文库中。如本文中使用的，“非诱变引物”或“非诱变寡核苷酸”指与模板核酸精确匹配的寡核苷酸组合物。在本发明的一个实施方案中，仅使用诱变引物。在本发明的另一优选实施方案中，将引物设计成使得对于至少一个包含诱变引物的区域而言，寡核苷酸混合物中还包括了非诱变引物。通过加入诱变引物和对应于至少一个诱变引物的非诱变引物的混合物，有可能产生存在多种组合诱变模式的核酸文库。例如，如果期望突变核酸文库中的一些成员在某些位置保留其前体序列，而其他成员在这些位点处是突变的，则非诱变引物提供了在核酸文库中对于给定残基获得特定水平的非突变体成员的能力。本发明的方法利用诱变及非诱变寡核苷酸，它们一般长度为约10至50个碱基，更优选长度为约15至45个碱基。然而，可能有必要使用小于约10 个碱基或大于约50个碱基的引物来获得期望的诱变结果。对于相应的诱变及非诱变引物而言，相应的寡核苷酸不一定长度相同，而是在对应于待加入的突变的区域中有重叠。可以根据本发明以预定的比例加入引物。例如，如果期望所得的文库含有显著水平的某特定突变以及相同或不同位点处较少量的不同突变，则通过调节所添加引物的量，有可能产生期望的偏好文库。或者，通过加入更少或更多量的非诱变引物，有可能调整突变核酸文库中产生相应突变的频率。
如本文中使用的，术语“连续突变”指存在于同一寡核苷酸引物中的突变。例如， 连续突变可彼此毗邻或接近，然而，它们将通过同一引物引入所得的突变体模板核酸中。
如本文中使用的，术语“不连续突变”指存在于不同寡核苷酸引物中的突变。例如， 不连续突变将通过分别制备的寡核苷酸引物引入所得的突变体模板核酸中。
术语“野生型序列”或“野生型基因”在本文中可互换使用，指宿主细胞中天然或天然存在的序列。在一些实施方案中，野生型序列指作为蛋白质改造计划的起点的目的序列。野生型序列可编码同源或异源的蛋白质。同源蛋白是宿主细胞无需干预即产生的蛋白质。异源蛋白是宿主细胞没有干预将不产生的蛋白质。
如本文中使用的，术语“抗体”指免疫球蛋白。抗体包括但不限于直接得自期望产生抗体的任何物种的免疫球蛋白。此外，本发明涵盖了修饰的抗体。该术语还指保留与完整抗体所结合表位结合的能力的抗体片段，并包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、抗独特型(抗ID)抗体。抗体片段包括但不限于互补性决定区(CDR)、单链片段可变区(scFv)、 重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)。多克隆抗体和单克隆抗体也包括在本发明之内。优选地，所述抗体为单克隆抗体。
如本文中使用的，短语“底物特异性的改变”指酶的底物特异性的变化。在一些实施方案中，底物特异性的变化定义为由于酶的突变或反应条件的改变而导致的，针对特定的底物的k-和/或&的变化。通过比较使用不同底物时表现出的催化效率来确定酶的底物特异性。这类确定可特别的用于评估突变酶的效率，因其一般预期产生针对目的底物，表现出更大比例的k。at/Km的变体酶。然而，本发明并非意在限于任何特定的底物组合物或底物特异性。
如本文中使用的，“表面特性”用于指代蛋白质表面表现出来的静电电荷以及特性，例如疏水性和亲水性。
如本文中使用的，短语“独立的选自......”意指选自所指代的马库什组的所述部分或元素可以与下列例子所示的元素相同、不同或者是其任意的混合物 具有3个R基团的分子，其中每个R基团独立的选自基团A、B和C。在此，R基团可以是 AAA、BBB、CCC、AAB、AAC、BBA、BBC、CCA、CCB 或 ABC。
指代化学组合物时，本文使用的术语“取代”意指应用所述术语的有机组合物或基团是 (a)通过消除至少一个元素或基团而产生不饱和的；或 (b)化合物或基团中的至少一个氢原子被含有一个或多个(i)碳、(ii)氧、(iii) 硫、(iv)氮或(V)卤素原子的部分替换；或 (c)(a)*(b)。
只含碳和氢原子的、可以如上文(b)中所述替换氢的部分是碳氢化合物部分，包括但不限于烷基、烯基、炔基、亚烃基、环烷基、苯基、烷基苯基、萘基、蒽基、菲基、氟基、类固醇基团，及这类基团相互之间以及与多价碳氢化合物基团的组合，例如亚烃基、亚烷基和 alkylidyne基团。可如上文(b)中所述替换氢的含有氧原子的部分包括但不限于含有羟基、酰基或酮基、醚、环氧、羧基和酯的基团。可如上文(b)中所述替换氢的含有硫原子的部分包括但不限于含硫的酸和酸酯基团、硫醚基团、巯基基团和硫酮基团。可如上文(b) 中所述替换氢的含有氮原子的部分包括但不限于氨基基团、硝基基团、偶氮基团、铵基基团、酰胺基团、叠氮基团、异氰酸基团、氰酸基团和腈基基团。可如上文(b)中所述替换氢的含有卤素原子的部分包括但不限于氯、溴、氟、碘基团，和任意前述部分，其中氢或悬挂的 (pendant)烷基被卤素基团取代，形成稳定的取代部分。
可以理解，任意上述部分(b) (i)至(b) (ν)都可以彼此取代，以单价取代或通过丢失氢的多价取代的形式，形成另一种单价部分，所述部分可以替换有机化合物或基团中的氢。
术语“氧化稳定的”指本发明的蛋白酶，其在蛋白水解、水解、清洁或其他本发明过程中常见条件(如暴露于或接触漂白剂或氧化剂)下保持一段时间后保留特定的酶活性量。在一些实施方案中，蛋白酶在接触漂白剂或氧化剂一段时间(例如，至少约1分钟、约 3分钟、约5分钟、约8分钟、约12分钟、约16分钟、约20分钟，等)后保留至少约50%、约 60%、约 70%、约 75%、约 80%、约 85%、约 90%、约 92%、约 95%、约 96%、约 97%、约 98% 或约99%的蛋白水解活性。在一些实施方案中，如实施例所述测定稳定性。
术语“螯合剂稳定的”指本发明的蛋白酶，其在蛋白水解、水解、清洁或其他本发明过程中常见条件(如，暴露于或接触螯合剂)下保持给定的一段时间后保留指定的酶活性量。在一些实施方案中，蛋白酶在接触螯合剂给定的一段时间(例如，至少约10分钟、约20 分钟、约40分钟、约60分钟、约100分钟等)后保留至少约50 %、约60 %、约70 %、约75 %、 约80%、约85%、约90%、约92%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%的蛋白水解活性。在一些实施方案，如实施例所述测定螯合剂稳定性。
术语“热稳定的”和“热稳定”指本发明的蛋白酶，其在蛋白水解、水解、清洁或其他本发明过程中常见条件(如暴露于改变的温度)下暴露于指定温度一段时间后，保留指定的酶活性量。改变的温度包括升高或降低的温度。在一些实施方案中，蛋白酶在暴露于改变的温度一段时间(例如，至少约60分钟、约120分钟、约180分钟、约240分钟、约300分钟，等)后保留至少约50%、约60%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约92%、 约95 %、约96 %、约97 %、约98 %或约99 %的蛋白水解活性。在一些实施方案中，如实施例所述测定热稳定性。
术语“增强的稳定性”在氧化、螯合剂、热和/或PH稳定性蛋白酶的情况中，指与其他丝氨酸蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶)和/或野生型酶相比，随着时间的流逝而保留的蛋白水解活性更高。
术语“降低的稳定性”在氧化、螯合剂、热和/或PH稳定性蛋白酶的情况中，指与其他丝氨酸蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶)和/或野生型酶相比，随着时间的流逝而保留的蛋白水解活性更低。
术语“清洁活性”指蛋白酶在蛋白水解、水解、清洁或本发明的其他过程中常见的条件下获得的清洁性能。在一些实施方案中，通过应用多种涉及酶敏感性污渍(例如，草、 血、乳或卵蛋白质)的清洁测定来确定清洁性能，通过将污渍置于标准洗涤条件后进行多种层析、分光光度或其他定量方法进行测定。示例性测定法包括但不限于WO 99/34011和美国专利6，605，458(均并入本文作为参考)中所述的测定，以及实施例中包括的那些方法。
术语蛋白酶的“清洁有效量”指在特定的清洁组合物中，实现期望的酶活性水平的上述蛋白酶的量。这样的有效量易于为本领域技术人员所确定，并取决于许多因素，例如所使用的具体蛋白酶、清洁应用、清洁组合物的具体组成，以及需要液体组合物还是干燥(例如，颗粒、条形)组合物等。
本文使用的术语“清洁附加材料”意指为理想的清洁组合物的具体类型和产品形式(例如，液体、颗粒、粉末、条形、糊状、喷雾、片剂、凝胶；或泡沫组合物)而选择的任何液体、固体或气体材料，所述材料还优选地与该组合物中所使用的蛋白酶相容。在一些实施方案中，颗粒组合物为“致密”形式，而在另一些实施方案中，液体组合物为“浓缩”形式。
术语“增强的性能”在清洁活性的情况中指对某些酶敏感性污渍，例如卵、乳、草或血，增加的或更高的清洁活性，通过标准洗涤循环和/或多个洗涤循环后的常用评估来确定。
术语“减弱的性能”在清洁活性的情况中指对某些酶敏感性污渍，例如卵、乳、草或血，减少的或更低的清洁活性，通过标准洗涤循环后的常用评估来确定。
术语“相当的性能”在清洁活性的情况中指比较的或参照蛋白酶(例如，市售的蛋白酶)的清洁活性的至少约60 %，至少约70 %，至少约80 %，至少约90 %，至少约 95 %，所述蛋白酶包括但不限于0PTIMASE 蛋白酶(Genencor)、PURAFECT 蛋白酶产品 (Genencor)、SAVINASE 蛋白酶(Novozymes)、BPN，变体(见例如，美国专利申请号Re 34，606)、RELASE 、DURAZYME 、EVERLASE 、KANNASE 蛋白酶(Novozymes)、MAXACAL 、 MAXAPEM 、PR0PERASE 蛋白酶(Genencor ；还参见美国专利申请号Re 34，606，和美国专利号5，700，676,5, 955，340,6, 312，936和6，482，628)，以及迟缓芽孢杆菌变体蛋白酶产品 (例如，WO 92/21760,WO 95/23221和/或WO 97/07770中所述)。可通过将本发明蛋白酶与上述枯草杆菌蛋白酶在多种清洁测定中进行比较，来确定清洁性能，所述清洁测定涉及酶敏感性污渍(如草、血或乳)，在标准洗涤循环条件后通过分光光度法或分析性方法来测定。
如本文使用的，“清洁组合物”和“清洁配方”指可用于从待清洁的物品上去除不理想的化合物的组合物，所述物品例如织物、餐具、隐形眼镜、其他固体物质、头发(香波)、皮肤(香皂和乳霜)、牙齿(漱口水、牙膏)等。术语涵盖了为理想的清洁组合物的具体类型和产品形式(例如，液体、凝胶、颗粒或喷雾组合物)而选择的任何材料/化合物，只要所述组合物与组合物中使用的蛋白酶和其他的酶相容。通过考虑待清洁的表面、物品或织物，以及在使用过程中用于清洁条件的组合物的理想形式，可以方便的确定清洁组合物材料的具体选择。
该术语进一步指适合清洁、漂白、消毒和/或灭菌任何对象和/或表面的任何组合物。术语意在包括但不限于去垢剂组合物(例如，液体和/或固体的衣物去垢剂和精细织物去垢剂；硬表面清洁配方、如用于玻璃、木头、陶瓷和金属柜台顶部和窗户；地毯清洁剂； 烤箱清洁剂；织物清新剂(freshener)；织物软化剂；和织物和衣物去渍剂(pre-spotter)， 以及餐具去垢剂)。
实际上，除非另外指出，本文使用的术语“清洁组合物”包括颗粒或粉末状形式的全用途或重垢型洗涤剂，特别是清洁去垢剂；液体、凝胶或糊状形式的全用途洗涤剂，特别是所谓的重垢型液体(HDL)类型；液体的精细织物去垢剂；手洗餐具洗涤剂或轻垢型餐具洗涤剂，特别是高泡类型的；机洗餐具洗涤剂，包括用于家务和机构用途的各种片剂、颗粒、 液体和清洗辅助型；液体清洁和消毒剂，包括抗菌的手洗类型、清洁条、漱口水、牙齿清洁剂、车用香波、地毯香波、浴室清洁剂；洗发香波和/或用于人和其他动物的毛发洗剂；沐浴凝胶和泡沫浴液和金属清洁剂；以及清洁助剂，如漂白添加剂和“去污棒”或预处理类型。
本文使用的“衣物去垢剂”包括手洗和机洗洗衣去垢剂组合物，包括洗衣添加组合物和适用于浸泡和/或预处理污损织物(例如，衣物、亚麻和其他纺织材料)的组合物。
本文使用的“非衣物去垢剂”包括非纺织(即织物)表面清洁组合物，包括但不限于洗碗去垢剂组合物、口腔清洁组合物、牙齿清洁组合物和个人清洁组合物。
本文使用的术语“去垢剂组合物”和“去垢剂配方”用于指代预期用于洗涤基质中进行污染对象清洁的混合物。在优选的实施方案中，术语用于指代用于清洁餐具、刀叉等的去垢剂(例如，“餐具去垢剂”或“洗碗去垢剂”)。本发明并非意在限于任何特定的去垢剂配方或组合物。实际上，术语意在除含有至少一种本发明的蛋白酶的去垢剂外，涵盖了含有表面活性剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、增洁剂(builder)、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂和荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂、酶激活剂、抗氧化剂和助溶剂的去垢剂。
本文使用的“洗碗组合物”指用于清洁餐具(包括刀叉)的所有类型的组合物，包括但不限于颗粒的和液体的形式。在一些实施方案中，洗碗组合物是可用于自动化洗碗机的“自动化洗碗”组合物。本发明并非意在限于任何特定类型或餐具的组合物。实际上，本发明可用于清洁任意材料的餐具(例如，餐具，包括但不限于盘子、杯子、玻璃杯、碗等)和刀叉(例如，用具(utensil)，包括但不限于勺子、刀、叉子、上菜用具(serving utensil) 等)，所述材料包括但不限于陶瓷、塑料、金属、瓷、玻璃、丙烯酸树脂等。本文使用的术语“餐具”指代碗碟和刀叉。
本文使用的术语“漂白”指对材料(例如，织物、衣物、纸浆等)或表面处理足够长的时间，并且在适当的PH和温度条件下产生材料的增亮(即，增白)和/或清洁。适合漂白的化学品的实例包括但不限于C102、H202、过氧酸、NO2，等。
本文使用的变体蛋白酶的“洗涤性能”指变体蛋白酶对洗涤的贡献，即为没有向组合物中添加变体蛋白酶的去垢剂提供额外的清洁性能。洗涤性能是在相关的洗涤条件下进行比较的。
本文使用的术语“相关的洗涤条件”表示在餐具或洗衣去垢剂市场分类的家庭实际使用中的条件，特别是洗涤温度、时间、洗涤机械、泡沫浓度(sud concentration)、去垢剂类型和水硬度。
术语“改善的洗涤性能”用于表示相对于相应的野生型或起始亲本蛋白酶，在相关的洗涤条件下的去渍中获得的更好的最终结果，或者基于重量，获得相同的最终结果需要较少的变体蛋白酶。
本文使用的术语“消毒”指从表面去除污染物，以及抑制或杀死物品表面的微生物。本发明并非意在限于任何特定的表面、物品或待去除的污染物或微生物。
本文清洁组合物的“致密”形式最好通过密度来反映，对组合物而言，通过无机填充盐的量来反映。无机填充盐是粉末形式去垢剂组合物的常规成分。在常规去垢剂组合物中，填充盐以显著的量存在，一般按总组合物的重量计，占约17%至约35%。相比，在致密组合物中，存在的填充盐的量不超过总组合物的约15%。在一些实施方案中，按组合物的重量计，填充盐存在的量不超过约10%，或更优选不超过约5%。在一些实施方案中，无机填充盐选自碱金属和碱土金属的硫酸盐和盐酸盐。在一些实施方案中，优选的填充盐是硫酸钠。
清洁组合物 除非另外提出，本文提供的所有组分或组合物水平都参照所述组分或组合物的活性水平来制备，并且排除可能存在于市售来源中的杂质，例如残余的溶剂或副产物。酶组分重量是基于总活性蛋白的。除非另外指出，按重量计算所有的百分比和比例。除非另外指出，基于总组合物计算所有的百分比和比例。在示例性的去垢剂组合物中，按总组合物的重量计，通过纯酶表示酶水平，并且除非另外说明，按总组合物的重量表示去垢剂成分。
如本文所示，在一些实施方案中，本发明的清洁组合物进一步包含附加材料，包括但不限于表面活性剂、增洁剂、漂白剂、漂白活化剂、漂白催化剂、其他的酶、酶稳定体系、 螯合剂、光学增亮剂、污垢释放聚合物、染料转移剂、分散剂、抑泡剂、染料、香料、着色剂、 填充盐、助水溶物(hydrotrope)、光活化剂、荧光剂、织物软化剂、可水解的表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗缩水剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、色粒(color speckle)、银护理剂 (silvercare)、抗晦暗剂(anti-tarnish)和/或抗腐蚀剂、碱度源、助溶剂、载体、加工助剂、色素和PH控制剂(见例如，美国专利号6，610，642,6, 605，458,5, 705，464,5, 710，115、 5, 698, 504,5, 695, 679,5, 686, 014 ^P 5，646，101，均通过引用并入本文中)。下文详细示例了具体的清洁组合物材料的实施方案。在清洁组合物中的清洁附加材料与本发明的变体蛋白酶不相容的实施方案中，使用合适的方法保持清洁附加材料和蛋白酶分离(即，彼此不接触)直到两种组分的结合恰当之时。此类分离方法包括本领域已知的任何合适的方法 (例如，软胶囊(gelcap)、封装、片剂、物理分离等)。
本发明的清洁组合物有利的用于例如洗衣应用、硬表面清洁、洗碗应用，以及化妆应用如假牙、牙齿、头发和皮肤。此外，由于在低温溶液中效率增加的独特优势，本发明的酶理想地适用于洗衣应用。此外，本发明的酶可用于颗粒的和液体的组合物中。
本发明的变体蛋白酶还可用于清洁性添加产物中。在一些实施方案中，可使用低温溶液清洁应用。在一些实施方案中，本发明提供了包括至少一种本发明的酶的清洁性添加产物，所述产物理想地适合包括在需要额外的漂白效果的洗涤过程中。此类例子包括但不限于低温溶液清洁应用。在一些实施方案中，添加产物的最简单的形式是一种或多种蛋白酶。在一些实施方案中，添加产物是包装成剂量形式，用于向清洁过程添加。在一些实施方案中，添加产物是包装成剂量形式，用于向清洁过程添加，在所述过程中使用了过氧化物源，并且增加漂白效果是理想的。本发明可使用任何合适的单剂量形式，包括但不限于丸剂、片剂、软胶囊或其他的单剂量单位，如预测量的粉末或液体。在一些实施方案中，包括了填充剂或载体材料，以增加此类组合物的体积。此类填充剂或载体材料包括但不限于硫酸、 碳酸和硅酸的各种盐类，以及云母、粘土等。用于液体组合物的合适的填充剂或载体材料包括但不限于水或低分子量的伯醇和仲醇，包括多元醇和二醇。此类醇的实例包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。在一些实施方案中，组合物含有从约5%至约90%的此类材料。 酸性填充剂可用于降低PH。可选的，在一些实施方案中，清洁性添加物包括辅助成分，如下文详述。
本发明的清洁组合物和清洁添加物需要有效量的至少一种本文提供的蛋白酶变体，单独的或与其他蛋白酶和/或额外的酶组合。所需的酶水平是通过添加一种或多种本发明的蛋白酶变体实现的。本发明一般包含至少约0. 0001重量百分比，从约0. 0001至约 10，从约0. 001至约1，或者甚至从约0. 01至约0. 1重量百分比的至少一种本发明的变体蛋白酶。
本文的清洁组合物一般配制成在用于含水清洁操作的过程中，使得洗涤水将具有从约5. 0至约11. 5，或者甚至从约7. 5至约10. 5的pH。液体产物配方一般配制成具有从约3. 0至约9. 0，或者甚至从约3至约5的pH。颗粒状的洗衣产物一般配制成具有从约9 至约11的PH。用于控制pH在推荐使用水平的技术包括使用缓冲液、碱、酸等，且是本领域技术人员普遍已知的。
合适的低pH清洁组合物一般具有从约3至约5的净pH，且一般不含在此类pH环境下水解的表面活性剂。此类表面活性剂包括烷基磺酸钠表面活性剂，其包含至少一种环氧乙烷部分，或者甚至从约1至约16摩尔的环氧乙烷。此类清洁组合物一般包含有效量的PH修饰剂，如氢氧化钠、单乙醇胺或盐酸，以提供此类清洁组合物具有从约3至约5的净 pH。此类组合物一般包含至少一种酸稳定的酶。在一些实施方案中，组合物是液体的，而在其他的实施方案中，是固体的。一般以净PH测量此类液体组合物的pH。以所述组合物的 10%固体溶液来测量此类固体组合物的pH，其中溶剂是蒸馏水。在这类实施方案中，除非另外指出，所有的PH测量都在20°C下进行。
在一些实施方案中，当在颗粒状的组合物或液体中使用变体蛋白酶时，所述变体蛋白酶理想地是封装的颗粒形式，以在储存过程中保护变体蛋白酶离开颗粒组合物的其他组分。此外，封装也是控制变体蛋白酶在清洁过程中的可利用度的手段。在一些实施方案中，封装增强了变体蛋白酶和/或其他酶的性能。鉴于这一点，用本领域已知的任何合适的封装材料将本发明的变体蛋白酶封装。在一些实施方案中，封装材料一般封装了至少一部分本发明的变体蛋白酶催化剂。一般的，封装材料是可溶于水的和/或可分散于水中的。在一些实施方案中，封装材料具有o°c或更高的玻璃态转变温度(Tg)。玻璃态转变温度更详细的描述在WO 97/11151中。封装材料一般选自糖类、天然的或合成的树胶、几丁质、壳聚糖、纤维素和纤维素衍生物、硅酸盐、磷酸盐、硼酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蜡， 及其组合物。当封装材料是糖类时，它一般选自单糖、寡糖、多糖，及其组合物。在一些典型的实施方案中，封装材料是淀粉(见例如，EP 0 922 499 ；US 4,977, 252 ；US 5, 354, 559 和US 5, 935, 826) 0在一些实施方案中，封装材料是由塑料制造的微球，如热塑性塑料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈及其混合物；可使用的市售微球包括但不限于由EXPANCEL (Stockviksverken，瑞士)供应的，和 PM 6545, PM 6550、PM 7220、PM7228, EXTENDOSPHERES , LUXSIL , Q-CEL 和 SPHERICEL
(PQ Corp. λ Valley Forge、PA)。
如本文所述，本发明的变体蛋白酶可特别用于清洁工业，包括但不限于洗衣和洗碗去垢剂。这类应用将酶置于各种环境压力下。由于在各种条件下的稳定性，本发明的变体蛋白酶提供了超过许多目前使用的酶的优点。
实际上，参与洗涤的蛋白酶暴露于多种洗涤条件下，包括变化的去垢剂配方、洗涤水体积、洗涤水温度和洗涤时间长度。此外，用于不同的地理区域的去垢剂配方在洗涤水中存在的相关组分具有不同的浓度。例如，欧洲去垢剂一般在洗涤水中具有约4500-5000ppm 的去垢剂组分，而日本去垢剂一般在洗涤水中具有约667ppm的去垢剂组分。在北美，特别是在美国，去垢剂一般一般在洗涤水中具有约975ppm的去垢剂组分。
低去垢剂浓度系统包括去垢剂，其中洗涤水中存在低于约SOOppm的去垢剂组分。 日本去垢剂通常被认为是低去垢剂浓度系统，因为它们通常在洗涤水中存在约667ppm的去垢剂组分。
中去垢剂浓度系统包括去垢剂，其中洗涤水中存在在约800ppm至约2000ppm之间的去垢剂组分。北美去垢剂通常被认为是低去垢剂浓度系统，因为它们通常在洗涤水中存在约975ppm的去垢剂组分。巴西通常在洗涤水中存在约1500ppm的去垢剂组分。
高去垢剂浓度系统包括去垢剂，其中洗涤水中存在高于约2000ppm的去垢剂组分。欧洲去垢剂通常被认为是高去垢剂浓度系统，因为它们通常在洗涤水中含有约 4500-5000ppm的去垢剂组分。
拉丁美洲去垢剂一般是高泡磷酸增洁剂去垢剂，拉丁美洲使用的去垢剂范围可落入中和高去垢剂浓度中，因为它们在洗涤水中含有1500ppm至6000ppm的去垢剂组分。如上所述，巴西一般在洗涤水中存在约1500ppm的去垢剂组分。然而，其他高泡磷酸增洁剂去垢剂地区(不仅限于其他拉丁美洲国家)可能具有在洗涤水中含有高达约6000ppm去垢剂组分的高去垢剂浓度系统。
鉴于以上内容，很显然，典型洗涤溶液中的去垢剂组合物浓度在世界范围内从低于约800ppm去垢剂组合物(“低去垢剂浓度地区”，例如日本的约667ppm)，到约800ppm至约2000ppm( “中去垢剂浓度地区”，例如美国的约975ppm和巴西的约1500ppm)到高于约 2000ppm(“高去垢剂浓度地区”，例如欧洲的约4500ppm至约5000ppm，以及高泡磷酸增洁剂地区的约6000ppm)不等。
根据经验确定典型洗涤溶液的浓度。例如，在美国，典型洗衣机容纳约64. 4L体积的洗涤溶液。因此，为了获得洗涤溶液中约975ppm的去垢剂浓度，必须向约64. 4L洗涤溶液中加入约62. 79g去垢剂组合物。该量是消费者使用随去垢剂所提供的量杯衡量的加入洗涤水中的典型量。
作为进一步的实例，不同地区使用不同的洗涤温度。日本的洗涤水的温度一般低于欧洲所使用的。例如，北美和日本的洗涤水温度一般在约10°c和约30°C之间(例如，约 20°C )，而欧洲洗涤水的温度一般在约30°C和约60°C之间(例如，约40°C )。然而，为了节省能源，许多消费者转为使用冷水洗涤。此外，在其他一些地区，一般使用冷水进行洗衣和洗碗应用。在一些实施方案中，本发明的“冷水洗涤”在从约10°C至约40°C，或者从约20°C至约30°C，或者从约15°C至约25°C的温度下，以及落入约15°C至约35°C和落入10°C至40°C的范围内的所有其他组合，进行洗涤。
作为进一步的实例，不同的地区一般具有不同的水硬度。水硬度一般通过每加仑混合的Ca2+/Mg2+的格令(grain)数来描述。硬度是水中钙(Ca2+)和镁(Mg2+)量的度量。美国的多数水是硬的，但硬度不同。中等硬度水(60-120ppm)至硬水(121_181ppm)具有60 至181ppm(ppm转换为格令/美制加仑为ppm数除以17. 1等于格令/加仑)的硬度矿物质(见表13-1)。
权利要求
1.芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形态，并且在3个或多个位置上包含取代，所述位置选自:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29、30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52， 53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，71，72，73，74，75，76，77，78， 79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102， 103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121， 122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140， 141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159， 160，161，162，163，164，165，166，167，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179， 180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198， 199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217， 218，219，220，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237， 238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256， 257，258，259，260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274 和 275，其中所述位置对照SEQ ID NO :1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
2.权利要求1的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形态，并且在3个或多个位置上包含取代，所述位置选自1、3、4、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29，30，31，33，35，36，38，40，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，59， 61，62，68，69，72，73，76，78，84，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101， 102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，114，115，116，117，118，119，120，121， 122，124，126，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，139，140，141，142，143，144， 145，146，147，148，149，150，151，152，156，158，159，160，165，166，167，170，171，172，173， 174，175，176，177，180，182，183，184，185，186，187，188，191，194，195，198，199,203,204, 206，209，210，211，212，213，215，216，217，218，222，223，224，227，228，230，231，232，233， 234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249、250、251、252、 253、255、256、258、259、260、261、262、265、267、268、269、270、271、272、273、274 和 275，其中所述位置对照SEQID NO :1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
3.权利要求1的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形态，并且在3个或多个位置上包含取代，所述位置选自1、2、3、4，5，7， 8,9,10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，33，35， 36，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，59，60，61，62， 63，66，68，69，71，72，73，74，75，76，77，78，79，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92， 93,94,95,96,97,98,99,100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，114， 115，116,117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133， 134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，.153，156，158，159，160，165，166，167，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179， 180，181，182，183，184，185，186，187，.188，191，192，194，195，196，197，198，199,200,203, 204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，220，.222，223，224， 225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243， 244，245，246，247，.248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262， 263、264、265、267、268、269、270、271、272、273、274 和 275，其中所述位置对照 SEQ ID NO 1 所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
4.权利要求1的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述在3个或多个位置上的取代选自X001A、X001C、X001E、X001F、X001G、X001H、XOO1]J001K,XOOlL、X001N，X001P,X001Q,X001R,X001S,X001T,X001V,X001Y,X002A,X002C,X002E,X002G,X002K,X002L,X002M,X002N,X002P,X002Q,X002R,X002S,X002T,X002V,X002W,X002Y,X003D,X003E,X003F,X003G,X003H,X003I,X003L,X003M,X003N,X003P,X003R,X003S,X003T,X003V,X003W,X003Y,X004A,X004C,X004D,X004E,X004F,X004G,X004H,X004K,X004L,X004N,X004P,X004R,X004S,X004T,X004V,X004W,X005A,X005C,X005D,X005E,X005G,X005I,X005M,X005P,X005Q,X005S,X005T,X005W,X005Y,X006A,X006D,X006E,X006M,X006W,X007A,X007C,X007D,X007G,X007H,X007N,X007P,X007Q,X007S,X007T,X008A,X008F,X008G,X008I,X008L,X008M,X008Q,X008T,X008V,X008W,X008Y,X009A,X009C,X009D,X009E,X009F,X009G,X009H,X009L,X009N,X009P,X009Q,X009R,X009S,X009T,X009V,X009W,X009Y,X010A,X010C,X010F,X010G,X010H,X010I,X010K,X010L,X010M,X010N,X010Q,X010R,X010S,X010T,X010V,X010W,X010Y,X011A,X011C,X011D,X011G,X011I,X011M,X011R,X011S,X011T,X011V,X011Y,X012D,X012F,X012G,X012H,X012I,X012K,X012L,X012M,X012N,X012P,X012Q,X012R,X012S,X012T,X012V,X012W,X012Y,X013A,X013G,X013I,X013M,X013Q,X013T,X013V,X014A,X014C,X014D,X014E,X014F,X014G,X014H,X014I,X014K,X014L,X014P,X014Q,X014S,X014T,X014V,X014Y,X015A,X015D,X015F,X015G,X015I,X015K,X015L,X015M,X015P,X015Q,X015R,X015S,X015V,X015W,X016A,X016D,X016E,X016G,X016L,X016N,X016P,X016Q,X016R,X016S,X016T,X016V,X017A,X017D,X017E,X017F,X017G,X017H,X017I,X017K,X017M,X017N,X017R,X017S,X017T,X017V,X017W,X017Y,X018A,X018C,X018D,X018E,X018F,X018G,X018H,X018I,X018K,X018L,X018M,X018N,X018P,X018Q,X018R,X018S,X018T,X018V,X018W,X018Y,X019A,X019C,X019D,X019E,X019F,X019G,X019H,X019K,X019L,X019M,X019N,X019P,X019R,X019S,X019T,X019V,X019W,X019Y,X020A,X020C,X020D,X020F,X020G,X020I,X020K,X020L,X020M,X020P,X020Q,X020R,X020S,X020T,X020V,X020W,X020Y,X021A,X021C,X021D,X021E,X021G,X021H,X021I,X021K,X021L,X021M,X021N,X021P,X021Q,X021R,X021S,X021T,X021V,X021W,X022A,X022C,X022G,X022I,X022K,X022L,X022M,X022N,X022P,X022Q,X022R,X022S,X022T,X022V,X022W,X022Y,X023A,X023G,X023S,X024A,X024C,X024D,X024F,X024G,X024H,X024L,X024M,X024N,X024P,X024Q,X024R,X024S,X024T,X024V,X024W,X025C,X025D,X025E,X025F,X025G,X025H,X025K,X025L,X025M,X025N,X025Q,X025R,X025S,X025T,X025V,X025W,X026C,X026F,X026G,X026I,X026L,X026M,X026N,X026P,X026R,X026S,X026T,X026V,X027A,X027C,X027D,X027F,X027G,3X027I,X027K,X027L,X027M,X027N,X027PX027R,X027S,X027T,X027V,X027W,X027Y,X028A,X028E,X028G,X028H,X028I,X028LX028M,X028N,X028P,X028S,X028V,X028Y,X029A,X029C,X029G,X029I,X029K,X029SX029T,X029V,X030A,X030C,X030D,X030E,X030F,X030G,X030L,X030M,X030Q,X030SX030T,X030V,X031A,X031F,X031I,X031L,X031M,X031S,X031T,X031V,X032A,X032CX032D,X032E,X032G,X032V,X032W,X033A,X033C,X033D,X033E,X033G,X033H,X033IX033L,X033M,X033N,X033Q,X033R,X033S,X033T,X033V,X033Y,X034E,X034G,X034HX034L,X034Q,X034S,X035A,X035F,X035H,X035I,X035K,X035L,X035M,X035P,X035QX035R,X035S,X035A,X035C,X035E,X035F,X035G,X035H,X035I,X035L,X035M,X035NX035P,X035Q,X035R,X035T,X035V,X035W,X035Y,X038C,X038F,X038G,X038H,X038IX038K,X038L,X038M,X038N,X038Q,X038R,X038T,X038V,X038W,X038Y,X039A,X039EX039G,X039H,X039L,X039M,X039N,X039Q,X039S,X039T,X039V,X039Y,X040A,X040CX040D,X040E,X040G,X040H,X040I,X040K,X040L,X040M,X040N,X040P,X040R,X040SX040T,X040V,X040W,X040Y,X041C,X041D,X041E,X041N,X041P,X041Q,X041S,X042AX042C,X042F,X042G,X042H,X042I,X042L,X042M,X042N,X042Q,X042S,X042T,X042VX042Y,X043A,X043C,X043D,X043E,X043F,X043G,X043I,X043L,X043M,X043N,X043PX043R,X043S,X043T,X043V,X043W,X043Y,X044A,X044C,X044D,X044F,X044G,X044IX044K,X044L,X044M,X044N,X044P,X044Q,X044R,X044S,X044T,X044V,X044W,X044YX045A,X045D,X045F,X045G,X045H,X045I,X045K,X045L,X045M,X045N,X045P,X045QX045R,X045S,X045T,X045V,X045W,X045Y,X046C,X046D,X046E,X046F,X046G,X046HX046I,X046K,X046L,X046M,X046N,X046P,X046Q,X046R,X046S,X046T,X046V,X046WX047A,X047C,X047E,X047F,X047G,X047H,X047K,X047L,X047M,X047N,X047P,X047QX047R,X047S,X047T,X047W,X048A,X048C,X048E,X048F,X048G,X048H,X048I,X048KX048L,X048M,X048N,X048P,X048Q,X048R,X048S,X048T,X048V,X048Y,X049A,X049EX049F,X049G,X049H,X049K,X049L,X049M,X049P,X049Q,X049R,X049S,X049T,X050CX050F,X050G,X050H,X050I,X050L,X050N,X050T,X050V,X050Y,X051F,X051G,X051HX051K,X051L,X051N,X051P,X051R,X051S,X051T,X051V,X051W,X052A,X052C,X052EX052F,X052G,X052H,X052I,X052L,X052M,X052N,X052P,X052Q,X052R,X052T,X052VX052W,X052Y,X053A,X053C,X053D,X053E,X053G,X053H,X053I,X053K,X053L,X053MX053P,X053Q,X053R,X053S,X053T,X053V,X053W,X053Y,X054A,X054C,X054D,X054EX054F,X054G,X054H,X054I,X054K,X054L,X054M,X054N,X054P,X054Q,X054R,X054SX054V,X054W,X054Y,X055A,X055C,X055E,X055F,X055G,X055H,X055I,X055K,X055LX055M,X055N,X055P,X055Q,X055R,X055S,X055T,X055W,X055Y,X056A,X056C,X056DX056E,X056H,X056L,X056M,X056N,X056P,X056Q,X056R,X056S,X056T,X056V,X057AX057C,X057E,X057F,X057G,X057H,X057I,X057K,X057L,X057M,X057N,X057P,X057QX057R,X057S,X057T,X057V,X057W,X057Y,X059A,X059C,X059D,X059E,X059F,X059GX059I,X059K,X059L,X059M,X059N,X059P,X059Q,X059R,X059S,X059T,X059V,X059WX059Y,X060A,X060C,X060D,X060F,X060G,X060K,X060L,X060M,X060N,X060P,X060QX060S,X060T,X060V,X060W,X060Y,X061A,X061C,X061D,X061F,X061G,X061H,X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55E,X255F,X255H,X255I,X255L,X255N,X255P,X255Q,X255R,X255SX255T,X255V,X255W,X255Y,X256A,X256C,X256D,X256E,X256G,X256H,X256I,X256KX256L,X256M,X256N,X256P,X256R,X256S,X256T,X256V,X256W,X256Y,X257A,X257CX257E,X257F,X257G,X257H,X257I,X257K,X257L,X257M,X257P,X257S,X257T,X257VX257W,X257Y,X258A,X258C,X258D,X258E,X258F,X258G,X258H,X258I,X258L,X258MX258P,X258Q,X258R,X258S,X258T,X258V,X258W,X258Y,X259A,X259C,X259E,X259GX259I,X259L,X259M,X259P,X259Q,X259R,X259S,X259T,X259V,X260A,X260D,X260EX260F,X260H,X260I,X260L,X260M,X260N,X260P,X260R,X260S,X260T,X260V,X260YX261A,X261C,X261E,X261F,X261G,X261I,X261K,X261L,X261N,X261P,X261Q,X261RX261S,X261T,X261V,X261W,X261Y,X262A,X262C,X262D,X262F,X262G,X262H,X262IX262K,X262L,X262M,X262P,X262Q,X262R,X262S,X262T,X262V,X262W,X262Y,X263AX263C,X263D,X263F,X263G,X263H,X263I,X263K,X263L,X263M,X263N,X263P,X263QX263R,X263W,X263Y,X264A,X264C,X264E,X264F,X264G,X264H,X264I,X264L,X264PX264Q,X264S,X264T,X264V,X264Y,X265A,X265C,X265D,X265F,X265G,X265H,X265IX265K,X265L,X265M,X265N,X265P,X265Q,X265R,X265S,X265T,X265V,X265W,X265YX266G,X266W,X266Y,X267A,X267C,X267D,X267E,X267F,X267G,X267H,X267I,X267KX267L,X267M,X267N,X267S,X267T,X267V,X267Y,X268A,X268D,X268E,X268G,X268HX268K,X268L,X268M,X268N,X268P,X268Q,X268R,X268S,X268V,X268W,X268Y,X269CX269D,X269F,X269G,X269H,X269I,X269L,X269M,X269N,X269Q,X269R,X269S,X269TX269V,X270A,X270C,X270D,X270E,X270F,X270G,X270H,X270I,X270L,X270M,X270NX270P,X270Q,X270S,X270T,X270V,X271A,X271C,X271E,X271F,X271G,X271H,X271IX271K,X271L,X271M,X271N,X271P,X271T,X271V,X271Y,X272A,X272C,X272D,X272EX272F,X272G,X272H,X272K,X272L,X272M,X272N,X272P,X272R,X272S,X272T,X272WX272Y,X273A,X273C,X273D,X273E,X273F,10X273G, X273H, X273I, X273K, X273L, X273R, X273S, X273T, X273V, X273W, X273Y, X274A, X274C, X274D, X274E, X274G, X274H, X274K, X274L, X274M, X274N, X274P, X274Q, X274R, X274S, X274T, X274W, X275A, X275C, X275D, X275E, X275F, X275G, X275H、X275K、X275L、 X275M、X275P、X275Q、X275R、X275V 和 X275W，其中所述位置对照 SEQ ID NO 1 所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
5.分离的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体在选自BMI测定、蛋黄微样品测定和/或 AAPF活性测定的至少一种测定中具有大于1的性能指数，以及在LAS稳定性或TCA测定中具有大于0. 8的性能指数，其中所述变体在1个或多个位置上包含至少一个取代，所述位置选自1、2、3、4、5、7、8、9、10、11、12、13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27， 28，29，30，31，33，35，36，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55， 56，57，59，60，61，62，63，66，68，69，71，72，73，74，75，76，77，78，79，81，82，83，84，85，86， 87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108， 109，110，111，112，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123,124，125，126，127，128， 129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147， 148，149，150，151，152，153，156，158，159，160，165，166，167，169，170，171，172，173，174， 175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，191，192，194，195，196， 197，198，199，200，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217， 218，220，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238， 239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257， 258，259，260，261，262，263，264，265，267，268、269、270、271、272、273、274 和 275，其中所述位置对照SEQ IDNO 1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
6.分离的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体在选自BMI测定、蛋黄微样品测定和/或 AAPF活性测定的至少一种测定中具有大于0. 8的性能指数，以及在LAS稳定性或TCA测定中具有大于0. 8的性能指数，其中所述变体在1个或多个位置上包含至少一个取代，所述位置选自:1、3、4、8、9、10、11、12、13、15、16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30， 31，33，35，36，38，40，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，59，61，62，68， 69，72，73，76，78，84，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103， 104，105，106，107，108，109，110，111，112，114，115，116，117，118，119，120，121，122，124， 126，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，139，140，141，142，143，144，145，146， 147，148，149，150，151，152，156，158，159，160，165，166，167，170，171，172，173，174，175， 176，177，180，182，183，184，185，186，187，188，191，194，195，198，199，203，204，206，209， 210，211，212，213，215，216，217，218，222，223，224，227，228，230，231，232，233，234，235， 236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，255， 256，258，259，260，261，262、265、267、268、269、270、271、272、273、274 和 275，其中所述位置对照SEQ ID NO :1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
7.权利要求5的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述分离的变体在选自BMI测定、蛋黄微样品测定和/或AAPF活性测定的至少一种测定中具有大于1的性能指数，以及在LAS/ EDTA稳定性或TCA测定中具有大于0. 8的性能指数，其中所述变体包含至少3个取代，所述取代选自X001A、X001C，X001E, X001F, X001G, X001H, X001I, X001K, X001L, X001N,X001Q,X001R,X001S,X001T,X001V,X001Y,X002A,X002C,X002E,X002G,X002K,X002L,X002M,X002N,X002P,X002Q,X002R,X002S,X002T,X002V,X002W,X002Y,X003D,X003E,X003F,X003G,X003H,X003I,X003L,X003M,X003N,X003P,X003R,X003S,X003T,X003V,X003W,X003Y,X004A,X004C,X004D,X004E,X004F,X004H,X004K,X004L,X004N,X004P,X004R,X004S,X004T,X004V,X004W,X005A,X005C,X005D,X005E,X005G,X005P,X005Q,X005S,X005T,X007A,X007C,X007D,X007G,X007H,X007N,X007S,X007T,X008A,X008F,X008I,X008L,X008M,X008T,X008V,X009D,X009E,X009F,X009G,X009H,X009L,X009N,X009P,X009Q,X009R,X009S,X009T,X009V,X009W,X009Y,X010A,X010C,X010G,X010H,X010K,X010M,X010N,X010Q,X010R,X010S,X010T,X010W,X011A,X011I,X011M,X011S,X011V,X012D,X012F,X012G,X012H,X012I,X012K,X012L,X012M,X012N,X012Q,X012R,X012S,X012T,X012V,X012W,X013A,X013G,X013I,X013T,X013V,X014A,X014D,X014E,X014F,X014H,X014I,X014K,X014L,X014P,X014Q,X014S,X014T,X014V,X014Y,X015A,X015D,X015F,X015G,X015I,X015K,X015L,X015M,X015P,X015Q,X015R,X015S,X015V,X015W,X016A,X016G,X016L,X016N,X016P,X016Q,X016S,X016T,X016V,X017A,X017F,X017H,X017I,X017K,X017M,X017N,X017R,X017S,X017V,X017W,X017Y,X018A,X018C,X018D,X018E,X018F,X018G,X018H,X018K,X018L,X018M,X018N,X018P,X018Q,X018R,X018S,X018T,X018V,X018W,X018Y,X019A,X019C,X019D,X019E,X019F,X019G,X019H,X019K,X019L,X019M,X019N,X019R,X019S,X019T,X019V,X019W,X019Y,X020A,X020C,X020D,X020F,X020G,X020I,X020K,X020L,X020M,X020P,X020Q,X020R,X020S,X020T,X020V,X020W,X020Y,X021A,X021C,X021D,X021E,X021G,X021H,X021I,X021K,X021L,X021M,X021N,X021P,X021Q,X021R,X021S,X021T,X021V,X021W,X022A,X022C,X022G,X022I,X022K,X022L,X022M,X022N,X022P,X022Q,X022R,X022S,X022T,X022V,X022W,X022Y,X023A,X023G,X023S,X024A,X024C,X024D,X024F,X024G,X024H,X024L,X024M,X024N,X024P,X024Q,X024R,X024S,X024T,X024V,X024W,X025C,X025D,X025E,X025F,X025G,X025H,X025K,X025L,X025M,X025N,X025Q,X025R,X025S,X025T,X025V,X025W,X026C,X026F,X026G,X026I,X026L,X026M,X026N,X026P,X026R,X026S,X026T,X026V,X027A,X027C,X027D,X027F,X027G,X027I,X027K,X027L,X027M,X027N,X027P,X027R,X027S,X027T,X027V,X027W,X027Y,X028A,X028E,X028H,X028I,X028L,X028M,X028N,X028S,X028V,X029A,X029C,X029G,X029S,X029V,X030C,X030E,X030L,X030S,X030T,X030V,X031A,X031F,X031I,X031L,X031M,X031S,X031T,X031V,X033A,X033D,X033E,X033G,X033H,X033M,X033N,X033Q,X033S,X033T,X033Y,X035A,X035F,X035I,X035L,X035M,X035P,X036A,X036C,X036E,X036F,X036G,X036H,X036I,X036L,X036M,X036N,X036Q,X036R,X036S,X036T,X036V,X038C,X038F,X038G,X038H,X038I,X038K,X038L,X038M,X038N,X038Q,X038R,X038T,X038V,X038W,X038Y,X039H,X039V,X040A,X040C,X040D,X040E,X040G,X040H,X040I,X040K,X040L,X040M,X040N,X040P,X040R,X040S,X040T,X040V,X040W,X040Y,X041D,X041E,X042C,X042H,X042I,X042L,X042M,X042N,X042T,X042V,X043A,X043C,X043D,X043E,X043F,X043G,X043I,X043L,X043M,X043N,X043P,X043R,X043S,X043T,X043V,X043W,X043Y,X044A,X044C,X044D,X044G,X044I,X044K,12X044L,X044M,X044N,X044P,X044Q,X044RX044S,X044T,X044V,X044W,X044YX045A,X045D,X045F,X045G,X045H,X045I,X045KX045L,X045M,X045N,X045P,X045QX045R,X045S,X045T,X045V,X045W,X045Y,X046CX046D,X046E,X046F,X046G,X046HX046I,X046K,X046L,X046M,X046N,X046P,X046QX046R,X046S,X046T,X046V,X046WX047A,X047F,X047G,X047N,X047R,X047S,X047TX047W,X048A,X048C,X048E,X048FX048G,X048H,X048I,X048K,X048L,X048M,X048NX048P,X048Q,X048R,X048S,X048TX048V,X048Y,X049A,X049F,X049G,X049L,X049MX049P,X049S,X049T,X050C,X050FX050H,X050I,X050L,X050N,X050T,X050V,X050YX051F,X051G,X051H,X051K,X051LX051N,X051P,X051R,X051S,X051T,X051V,X051WX052A,X052C,X052E,X052F,X052GX052H,X052I,X052L,X052M,X052N,X052P,X052QX052R,X052T,X052V,X052W,X052YX053A,X053C,X053D,X053E,X053G,X053H,X053KX053L,X053M,X053P,X053Q,X053RX053S,X053T,X053V,X053W,X053Y,X054A,X054CX054D,X054E,X054F,X054I,X054MX054N,X054Q,X054S,X054V,X055A,X055C,X055EX055F,X055G,X055H,X055I,X055KX055L,X055M,X055N,X055P,X055Q,X055S,X055TX055W,X055Y,X056A,X056C,X056DX056E,X056H,X056L,X056M,X056N,X056P,X056QX056S,X056T,X057A,X057C,X057EX057F,X057G,X057H,X057I,X057K,X057L,X057MX057N,X057P,X057Q,X057R,X057SX057T,X057V,X057W,X057Y,X059A,X059C,X059DX059E,X059F,X059G,X059I,X059LX059M,X059N,X059P,X059Q,X059R,X059S,X059TX059V,X059W,X059Y,X060D,X060SX060V,X061A,X061C,X061D,X061F,X061G,X061HX061I,X061L,X061M,X061N,X061PX061R,X061S,X061T,X061V,X061Y,X062C,X062EX062F,X062G,X062H,X062I,X062KX062L,X062M,X062N,X062P,X062Q,X062R,X062SX062T,X062V,X062Y,X063A,X063CX063D,X063E,X063F,X063G,X063H,X063K,X063MX063Q,X063R,X063S,X063W,X066KX066S,X066T,X068I,X068T,X068V,X069A,X069EX069G,X069N,X069S,X069T,X071AX071I,X071N,X071T,X071V,X072C,X072F,X072IX072L,X072M,X072T,X072V,X073AX073C,X073D,X073E,X073H,X073K,X073L,X073NX073S,X073T,X073V,X074A,X074CX074S,X075A,X075H,X075I,X075L,X075M,X075NX075P,X075Q,X075R,X075S,X075VX076D,X076E,X076F,X076G,X076H,X076K,X076MX076N,X076Q,X076R,X076S,X076TX076W,X076Y,X077D,X077N,X078A,X078C,X078EX078F,X078G,X078H,X078I,X078KX078L,X078M,X078N,X078P,X078Q,X078R,X078SX078T,X078V,X078Y,X079C,X079DX079E,X079F,X079G,X079I,X079K,X079L,X079NX079Q,X079R,X079S,X079T,X079VX079W,X079Y,X081C,X081G,X081H,X081I,X081LX081M,X081Q,X081S,X081T,X081VX082A,X082E,X082F,X082K,X082L,X082M,X082QX082R,X082T,X082V,X082Y,X083GX083S,X084C,X084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ID NO 1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
8.权利要求6的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体在选自BMI测定、蛋黄微样品测定和/或AAPF活性测定的至少一种测定中具有大于1的性能指数，以及在LAS稳定性和TCA测定中具有大于0.8的性能指数，其中所述变体包含至少3个取代，所述取代选自 X001A、X001E、X001G、X001H, X001Q, X001V, X003E, X003H, X003I, X003M, X003S, X003T, X003V, X004T, X004V, X008I, X008V, X009E, X009H, X009N, X009Q, X009S, X009T, X010A, X010C, X010G, X010H, X010K, X010M, X010N, X010R, X010S, X010T, X011I, X011V, X012G, X012I, X012N, X012Q, X012S, X012T, X012V, X013A, X013G, X015A, X015D, X015F, 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V,X133Y,X134A,X134S,X134T,X134V,X135L,X135MX135W,X136E,X136Q,X137A,X137C,X137E,X137H,X137K,X137L,X137M,X137Q,X137RX137S,X137W,X139C,X139I,X139V,X140D,X140E,X140N,X141D,X141E,X141G,X141HX141I,X141K,X141L,X141N,X141Q,X141R,X141S,X141V,X141Y,X142A,X142C,X142VX143C,X143D,X143F,X143H,X143N,X143T,X144A,X144C,X144D,X144G,X144H,X144IX144L,X144M,X144N,X144R,X144S,X144T,X144V,X144Y,X145A,X145C,X145D,X145FX145K,X145L,X145N,X145Q,X145R,X146D,X146G,X147I,X147L,X147T,X147V,X148CX148I,X148L,X148M,X148N,X148V,X149C,X149I,X149L,X149V,X150A,X150L,X150TX150V,X151A,X151S,X152A,X152S,X156D,X156E,X156L,X156N,X156S,X156T,X158AX158C,X158E,X158F,X158H,X158K,X158L,X158M,X158Q,X158R,X158S,X158T,X158VX159A,X159C,X159E,X159G,X159H,X159M,X159P,X159S,X160A,X160C,X160D,X160FX160I,X160L,X160M,X160N,X160Q,X160S,X160T,X160V,X160Y,X165I,X165L,X165VX166A,X166C,X166D,X166E,X166H,X166M,X166S,X166T,X167F,X167Y,X170A,X170DX170E,X170G,X170H,X170K,X170Q,X170R,X170S,X170V,X170Y,X171C,X171Y,X172AX172C,X172D,X172G,X172I,X172K,X172L,X172M,X172P,X172Q,X172R,X172S,X172VX172Y,X173A,X173C,X173D,X173H,X173M,X173N,X173Q,X173T,X174A,X174S,X174TX174V,X175L,X175M,X175V,X176A,X176S,X177C,X177V,X180T,X180V,X182A,X182DX182E,X182Q,X183A,X183D,X183N,X183Q,X183S,X184D,X184N,X185A,X185C,X185EX185H,X185K,X185M,X185N,X185Q,X185T,X185V,X186I,X186K,X186L,X186R,X187AX187C,X188A,X188D,X188E,X188F,X188H,X188I,X188K,X188L,X188P,X188Q,X188SX188T,X191A,X191D,X191Q,X191S,X194A,X194C,X194D,X194E,X194F,X194H,X194IX194L,X194M,X194P,X194Q,X194R,X194S,X194T,X194W,X194Y,X195C,X195D,X195EX195G,X195Q,X198I,X198L,X199C,X199M,X199S,X199V,X203C,X203E,X203T,X203VX204A,X204C,X204E,X204G,X204N,X204S,X206D,X206E,X206H,X206L,X206N,X206QX206S,X209F,X209M,X209W,X209Y,X210A,X210C,X210I,X210L,X210M,X210N,X210PX211A,X211C,X211E,X211G,X211H,X211I,X211M,X211P,X211Q,X211T,X211V,X212CX212F,X212G,X212H,X212M,X212N,X212R,X212S,X212Y,X213A,X213D,X213E,X213NX213Q,X213S,X213T,X215A,X215C,X215D,X215E,X215H,X215I,X215K,X215M,X215NX215S,X215T,X215V,X215Y,X216A,X216C,X216D,X216E,X216F,X216H,X216I,X216LX216M,X216N,X216Q,X216S,X216V,X216W,X216Y,X217A,X217C,X217D,X217E,X217FX217K,X217L,X217M,X217Q,X218C,X218D,X218E,X218N,X218Q,X222C,X222M,X222SX223A,X223S,X224A,X224N,X224S,X224T,X227A,X227C,X227V,X228A,X228G,X228SX228V,X230A,X230G,X230N,X230S,X230T,X230V,X231A,X231C,X231F,X231G,X231SX232A,X232L,X232M,X233A,X233C,X233E,X233G,X233I,X233L,X233N,X233Q,X233SX233T,X233V,X234L,X234M,X234N,X234Q,X234S,X234T,X234V,X235C,X235F,X235GX235H,X235I,X235K,X235L,X235M,X235N,X235Q,X235R,X235S,X235V,X235W,X235YX236A,X236C,X236E,X236F,X236H,X236N,X236Q,X236S,X236T,X236Y,X237A,X237CX237F,X237G,X237H,X237I,X237K,X237L,X237M,X237Q,X237R,X237S,X237T,X237VX237W,X237Y,X238C,X238D,X238E,X238F,X238G,X238H,X238I,X238K,X238L,X238MX238N,X238Q,X238R,X238S,X238T,X238V,X238Y,X239C,X239D,X239F,X239G,X239HX239K,X239L,X239M,X239N,X239P,X239Q,X239R,X239S,X239T,X239V,X239W,X239YX240A,X240C,X240E,X240F,X240I,X240K,X240M,X240N,X240Q,X240R,X240S,X240TX240W,X240Y,X241A,X241C,X241D,X241E,X241F,X241G,X241H,X241I,X241K,X241LX241M,X241N,X241Q,X241R,X241S,X241T,X241V,X241W,X241Y,X242A,X242C,X242DX242G,X242H,X242I,X242L,X242M,X242P,X242Q,X242S,X242T,X242V,X243C,X243DX243E,X243F,X243G,X243H,X243I,X243L,X243M,X243N,X243P,X243Q,X243S,X243TX243V,X243W,X244D,X244E,X244F,X244H,X244I,X244L,X244M,X244N,X244Q,X244S,X244T,X244V,X244W,X245A,X245C,X245E,X245G,X245H,X245K,X245L,X245P,X245Q,X245S,X245V,X245W,X245Y,X246A,X246C,X246I,X246L,X246M,X246T,X246V,X247A,X247C,X247F,X247G,X247H,X247K,X247L,X247M,X247N,X247R,X247S,X247T,X247V,X247W,X247Y,X248C,X248D,X248E,X248G,X248H,X248I,X248L,X248N,X248P,X248R,X248S,X248T,X248V,X248Y,X249A,X249D,X249E,X249F,X249G,X249H,X249I,X249K,X249L,X249M,X249N,X249Q,X249S,X249T,X249W,X249Y,X250C,X250I,X250L,X250M,X250V,X251A,X251D,X251E,X251F,X251G,X251K,X251L,X251M,X251Q,X251R,X251T,X251V,X251Y,X252A,X252C,X252D,X252F,X252G,X252H,X252I,X252K,X252L,X252M,X252N,X252R,X252S,X252V,X252W,X253A,X253E,X253H,X253M,X253S,X253T,X253W,X255A,X255C,X255D,X255E,X255I,X255L,X255N,X255Q,X255T,X255V,X255Y,X256A,X256C,X256D,X256E,X256G,X256H,X256I,X256K,X256L,X256M,X256N,X256P,X256S,X256V,X256W,X256Y,X258D,X258G,X259A,X259C,X259E,X259P,X259Q,X259S,X260A,X260D,X260E,X260H,X260I,X260N,X260P,X260S,X260T,X260V,X261A,X261C,X261E,X261F,X261I,X261K,X261L,X261N,X261P,X261Q,X261S,X261T,X261V,X261W,X261Y,X262A,X262C,X262D,X262F,X262H,X262I,X262L,X262M,X262Q,X262T,X262V,X262Y,X265A,X265D,X265S,X267I,X267L,X268A,X268L,X268V,X269D,X269H,X269N,X269Q,X269S,X270A,X270C,X270G,X270I,X270L,X270N,X270S,X270T,X270V,X271C,X271E,X272A,X272C,X272D,X272E,X272F,X272G,X272H,X272L,X272M,X272N,X272P,X272S,X272T,X272W,X272Y,X273A,X273C,X273G,X273S,X274A,X274C,X274G,X274L,X274M,X274N,X274S,X274T,X275D,X275E,X275F,X275H, X275K, X275L, X275M、X275P、X275Q和X275R，其中所述位置对照SEQ！ ID NO1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
9.权利要求1的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体在选自18、52、 72、117、119、127、144、185,209和213的一个或多个位置上包含进一步的取代，并且其中所述位置对照SEQ ID NO :1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
10.权利要求1-9的任一项的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是GG3变体。
11.权利要求1的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述分离的枯草杆菌蛋白酶变体包含选自以下的取代的组合S87N/Q109Q/G118D/SU8L/PU9Q/S130A/S188S/T213E/ N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248D, S87N/Q109Q/G118V/ S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/ T213E/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109R/ G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/ S188S/T213T/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/ Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R, S87N/Q109R/G118R/S128L/P129Q/ S130A/S188D/T213T/N248R, S87N/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248R, S87R/Q109Q/G118R/S128L/ P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248N, S87R/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/ S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R, S87D/Q109D/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188D/ T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248R, S87N/Q109R/ G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248R, S87R/Q109R/G118R/S128L/P129Q/S130A/ S188D/T213E/N248R, S87N/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N, S87N/ Q109R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/ S130A/S188R/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/ P129Q/S130A/S188R/T213R/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/ N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248R, S87N/Q109R/G118V/ S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/ T213T/N248D, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248N, S87N/Q109R/ G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/ S188R/T213T/N248D, S87R/Q109D/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/ Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/ S130A/S188D/T213R/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248N, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248N, S87N/Q109Q/G118V/S128L/ P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/ N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R, S87N/Q109R/G118V/ S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/ T213T/N248N, S87R/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109Q/ G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/Q109D/G118V/S128L/P129Q/S130A/ S188R/T213R/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248D, S87N/ Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/ S130A/S188D/T213R/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248D, S87R/Q109D/G118R/S128L/ P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/ N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248N, S87N/Q109Q/G118V/ S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248R, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/ T213E/N248R, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248D,禾口 S87N/ Q109Q/G118V/SU8LPU9Q/S130A/S188R/T213E/N248R，其中所述位置对照 SEQ ID NO 1 所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
12.权利要求1的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体包含选自以下的取代的组合S87N/Q109Q/G118V/SU8L/PU9Q/S130A/S188S/T213T/N248D，S87N/Q109Q/G118V/ S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248N, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/ T213R/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248D, S87R/Q109D/ G118R/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R, S87R/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/ S188D/T213E/N248R, S87N/Q109D/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248D,和 S87N/Q109Q/G118V/SU8L/PU9Q/S130A/S188R/T213E/N248D，其中所述位置对照 SEQ IDNO 1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
13.权利要求1的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体包含选自以下的取代的组合S87D/Q109D/G118R/SU8L/PU9Q/S130A/S188R/T213E/N248D，S87N/Q109D/G118R/ S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87D/Q109Q/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188S/ T213E/N248D, S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248D, S87N/Q109Q/ G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248D, S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/ S188R/T213T/N248D, S87R/Q109D/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R, S87N/ Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248D,和 S87R/Q109D/G118R/S128L/ PU9Q/S130A/S188D/T213T/N248R，其中所述位置对照SEQ ID NO :1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
14.权利要求1的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体包含选自以下的取代的组合A001C/S024V/I107L、A001I/R045T/I107R/A172T、A001K/A172L、A001K/A172W，A001K/ I072C/L126F, A001K/I072C/L126F/S164Q, A001K/I072C/V104I/L126F, A001K/I072C/ V104I/L126F/S164Q, A001K/I072V, A001K/I072V/L126F, A001K/I072V/L126F/S164F, A001K/I072V/V104I, A001K/I072V/V104I/L126F/S164I, A001K/I072V/V104I/S164F, A001K/I072V/V104I/S164Q, A001K/I107T/A172Q, A001K/I107V/G127Q, A001K/I107V/ G127Q/A172Q, A001K/I107V/G127R/A172Q, A001K/L126F, A001K/L126F/S164F, A001K/ L126F/S164I, A001K/L126F/S164Q, A001K/R045F/I072C, A001K/R045F/I072C/L126F, A001K/R045F/I072C/V104I/S164F, A001K/R045F/I072V/L126F/S164I, A001K/R045F/ I072V/L126F/S164Q, A001K/R045F/I072V/S164F, A001K/R045F/I072V/V104G/S164T, A001K/R045F/I107L/A172N, A001K/R045F/I107T, A001K/R045F/I107V/G127Q, AOOIK/ R045F/L126F/S164F, A001K/R045F/L126F/S164I， A001K/R045F/S164F, A001K/R045F/ V104I/L126F/S164Q, A001K/R045K/I072C/L126F/S164Q, A001K/R045K/I072V/L126F, A001K/R045K/I072V/L126F/S164F, A001K/R045K/I072V/L126F/S164Q, A001K/R045K/ I072V/S164F, A001K/R045K/I072V/S164Q, A001K/R045K/I072V/V104I/L126F/S164F, A001K/R045K/I072V/V104I/L126F/S164I, A001K/R045K/I072V/V104I/L126F/S164Q, A001K/R045K/I107A/A172T, A001K/R045K/I107R/G127A/A172N, A001K/R045K/I107T/ G127R, A001K/R045K/I107T/G127R/A172Q, A001K/R045K/L126F, A001K/R045K/K126F/ S164I, A001K/R045K/L126F/S164P, A001K/R045K/L126F/S164Q, A001K/R045K/S164F, A001K/R045K/V104I/S164Q, A001K/R045K/V104L/S164A, A001K/R045N/I107T/G127Q, A001K/R045S/V104C/L126Y/S164F, A001K/S024H/I107T/G127Q, A001K/S024H/I107T/ G127R, A001K/S024H/I107V, A001K/S024H/R045N/I107T, A001K/S024H/R045N/I107T/ G127Q/A172Q, A001K/S024L/R045A, A001K/S024N/I107V/G127T, A001K/S024N/R045K/ A172Y, A001K/S024R/I107T, A001K/S024R/R045N/A172C, A001K/S024R/R045N/I107T, A001K/S024R/R045N/I107T/G127R, A001K/S024T/I107T/G127Q/A172Q, A001K/S024T/ R045N/G127Q/A172Q, A001K/S024W/I107T/G127R, A001K/S024W/I107V/G127T/A172Q, A001K/S164Q, A001K/V104E, A001K/V104I/L126F, 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S099Q/S103P/S132H, S099Q/S132R, S099T/G118F, S099T/ G118R/S132H, S099T/G118T/S132H, S099T/G118T/S132N, S099T/S103P, S099T/S103P/ G118L/S132H, S101E/N117I, S101E/N117Y/N248K, S101F/N117I/N248I， S101F/N117Y/ N248I, S101F/N117Y/N248K, S101F/N248K, S101R/N117I/N248K, S101R/N117Y, SlOlR/ N248K, S101T/N117Y/N248K, S101T/N248I, S101V/N248K, S101Y/N117I/N248K, SlOlY/ N117Y, S101Y/N248K, S103G/G118I/G127E/S132E, S103L/S132E, S103R/S132P, S144T/ N185R, S144T/N185R/Y209W/S256I, S144T/N185R/Y209W/S256T, S144T/N185V, S144V/ N185R/S256I, S144V/N185R/Y209W, S144V/N185R/Y209W/S256T, S144V/S256I, S144V/ Y209W, S144W/N185R/Y209W/S256T, S144W/N185V/Y209W/S256I, S144W/S256I、 S144Y/ Y209W/S256I、V104E/LU6I/S164L，其中所述位置对照SEQ ID NO=I所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
15.权利要求1的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体包含选自以下的取代的组合:TS87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24ff/S101L/Q109K, S87N/G118V/S128L/P129Q/ S130A/N18K/G97P/S101L/Q109R/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/Q109R/S164I， S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109R/S188D/N248R, S87N/G118V/ S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101Y/Q109L/N185R/A215R, S87R/G118R/S128L/P129Q/ S130A/S101K/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24W/S101L/Q109L, S87N/ G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101Y/Q109R/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/ P129Q/S130A/72V/S101L/Q109R/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109R/ S188D/T213E/N248R, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/I72V/S164I/S188D/N248R, S87N/ Gl18V/S128L/P129Q/S130A/N76D, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24W/S101Y/Q109K, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N43S/P52V/S101R/Q109R, S87N/G118V/S128L/P129Q/ S130A/I72V/S101Y/Q109R/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101L/Q109L/S188D/ N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/Q109R/S164I/S188D/N248R, S87N/G118V/ S128L/P129Q/S130A/N76D/S101L, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24W/S101Y/Q109L, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D/S164I, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/N76D/ S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109L/S188D/N248R, S87R/G118R/ S128L/P129Q/S130A/V118R/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D/S101M, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/N76D/G97P/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/ P129Q/S130A/I72V/S101L/S164I, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101L/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109L/S188D/T213E/N248R, S87R/G118R/S128L/ P129Q/S130A/Q109L/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101L/ N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101Y/S164I, S87N/G118V/S128L/ P129Q/S130A/S101Y/T213E/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101L/Q109L/ S164I, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101V/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/ S130A/N18K/G97P/S101Y/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101V/ S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101L/T213E/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/ S130A/I72V/S101Y/Q109L/S164I, S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101H/S188D/N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/Q109R/N185R/A215R, S87N/G118V/S128L/ P129Q/S130A/I72V/S101H/S164I, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101L/Q109R/S188D/ N248R, S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101L/Q109L/N185R/A215R, S87R/ G118R/S128L/P129Q/S130A/S101M/S188D/N248R, N76D/S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/ S188D, N76D/S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/N248K, S87N/G118V/G127S/S128L/ P129Q/S130A, S87N/S101H/G118V/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101K/G118V/S128L/P129Q/ S130A, S87N/S101V/G118V/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101Y/G118V/S128L/P129Q/S130A, S87N/S101L/G118V/S128L/P129Q/S130A,I72V/S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A//S164I, 其中所述位置对照SEQID NO :1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
16.编码权利要求1-15的任一项提出的枯草杆菌蛋白酶变体的分离的核酸。
17.包含权利要求16的核酸的表达载体。
18.包含权利要求17的表达载体的宿主细胞。
19.包含权利要求1-15的任一项提出的枯草杆菌蛋白酶变体的清洁组合物。
20.权利要求19的清洁组合物，其中所述组合物包含液体的、凝胶的、片剂的、粉末的和/或颗粒状的去垢剂。
21.权利要求19和/或20的清洁组合物，其中所述清洁组合物选自洗衣去垢剂和餐具去垢剂。
22.权利要求21的清洁组合物，其包含洗衣去垢剂。
23.权利要求22的清洁组合物，其中所述洗衣去垢剂是重垢型去垢剂。
24.权利要求21的清洁组合物，其包含选自手洗餐具去垢剂和自动化餐具洗涤去垢剂的餐具去垢剂。
25.权利要求19-24的任一项的清洁组合物，进一步包含至少一种漂白剂。
26.权利要求19-25的任一项的清洁组合物，其中所述清洁组合物是无磷的或含磷的去垢剂。
27.权利要求19-26的任一项的清洁组合物，其中所述清洁组合物是冷水型去垢剂。
28.权利要求19-27的任一项的清洁组合物，进一步包含至少一种其他的酶。
29.权利要求观的清洁组合物，其中所述至少一种其他的酶选自半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、金属蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、 果胶酶、果胶裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、木质酶、 支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanases、β -葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶，或其混合物。
30.清洁方法，包括提供待清洁的物品和包含权利要求19-29的任一项提出的清洁组合物的组合物，以及在有效提供所述物品的清洁的条件下，将所述物品与所述组合物接触。
31.权利要求30的方法，还包括在将所述物品与所述清洁组合物接触后，清洗所述物品的步骤。
32.权利要求30和/或31的方法，其中所述待清洁的物品包括餐具。
33.权利要求30和/或31的方法，其中所述待清洁的的物品包括织物。
全文摘要
本发明提供了用于蛋白改造的方法，以及从其产生的丝氨酸蛋白酶变体。具体而言，本发明提供了相比参照的丝氨酸蛋白酶，具有一个或多个取代的丝氨酸蛋白酶变体。此外，本发明提供了包含这些丝氨酸蛋白酶变体的组合物。在一些实施方案中，本发明提供了包含至少一种这些丝氨酸蛋白酶变体的清洁组合物。
文档编号C12N9/54GK102209778SQ200980144959
公开日2011年10月5日 申请日期2009年11月10日 优先权日2008年11月11日
发明者W·埃赫勒, L·G·卡斯康-佩雷拉, D·A·埃斯特尔, F·齐德戈伯, J·T·小凯尔利斯, A·J·保罗斯, B·F·施密特 申请人:丹尼斯科美国公司