专利名称：酶法制备低过敏原海虾基料的方法
技术领域：
本发明涉及水产加工领域和食品安全领域，更具体的说，是涉及一种酶法制备低过敏原海虾基料的方法。
背景技术：
近年来食品安全问题受到越来越多的人的重视，过敏疾病的发病率越来越高，全世界约有30％-40％的人们患有各种各样的过敏疾病，且发病率和死亡率呈逐年上升趋势，过敏疾病被世界卫生组织(WHO)认定为当今世界性的重大卫生问题之一。在西方发达国家，有2.5％的成年人和6％-8％的儿童会对某些食品过敏。美国有600万-700万的过敏患者，每年平均有100-125例因食品过敏而致死的病例。在这些引起过敏的食品中，海产品是其中重要的一类。中国疾病控制中心营养与食品安全所调查数据显示，在15-24岁年龄段的健康人群中，约有6％的人曾患有食品过敏疾病。有关食用或加工海产品导致过敏的报道层出不穷。
在联合国粮农组织提出的八大类引起过敏的食物之中，虾与蟹等甲壳类动物及其制品是重要的一类。近年来国内外有关食源性虾过敏的报道屡见不鲜。食物过敏反应的临床表现包括呼吸系统、胃肠道系统、中枢神经系统、皮肤、肌肉和骨骼等不同形式的临床症状，如荨麻疹、疱疹样皮炎、口腔过敏综合症、肠病综合症、哮喘及过敏性鼻炎等。严重的食物过敏可导致过敏性休克，现已成为过敏反应中危及生命的主要原因。由于食物过敏症的发生始于婴幼儿期，而且对某些食物的过敏是终生不变的，食物过敏会严重影响患者及其家庭的生活质量。因此开发低过敏性虾产品对于保证虾产品的安全性、扩大其市场普及和提高水产品的利用价值都极其重要，是食品安全领域的一项重要课题。
虾的过敏原有多种，其中对于海虾过敏原的研究较多。Hoffman等人首先分离并研究了海虾过敏原的部分性质。研究结果表明海虾类过敏原分子量为38kDa，是等电点为4.5左右的糖蛋白，糖基的含量在4.0％左右。不久在生海虾中又提取出过敏原蛋白质Antigen I，分子量为21kDa，由两条多肽链组成的二聚体结构。印度Sunil Nagpal研究发现过敏原Sa-I和Sa-II，此外还发现一种TRNA(Sa-III)具有致敏性，但是不是过敏原还有待于进一步的研究证明。国外研究者从Penaeus indicus、Penaeus aztecus、Metapenaeus ensist和Parapenaeus fissures等4种海虾中分别纯化出相对分子量为36kDa的原肌球蛋白，并证实了其为海虾的主要过敏原，同时人们也发现，antergen-II、Antigen-I、Sa-I和Sa-II与原肌球蛋白有着很大的同源性，认为它们均为原肌球蛋白加工处理后的不同产物。现已证实从海虾中分离出的原肌球蛋白是虾的主要过敏原(Pen a 1)，分子量为36kDa，占煮后虾粗提液可溶性蛋白的20％，含糖约2.9％。根据国际免疫学学会过敏原专业术语的要求，将这种过敏原定名为Pen a 1。Nagpal等人从O anaeus indicus中发现另外一种海虾类过敏原，其分子量在34kDa左右；有研究者发现tRNA是另一种虾类的过敏原，但是其他的研究者没有证实获得这种过敏原。目前人们认为Pen a 1是虾中普遍存在的一种主要过敏原。我国青岛海洋大学也从凡纳滨对虾、克氏螯虾、口虾蛄几种不同亚目虾中提取海虾的主要过敏原，王晓雯等人也对中国对虾的主要过敏原进行了研究，在初步分离的蛋白质组分中分子量36kDa的蛋白含量较高，用海虾过敏者血清及阳性血清池鉴定中国对虾主要过敏原，鉴定36kDa的蛋白为主要过敏原。
近年来，随着过敏原研究的进一步深入，国外和我国台湾报道，海虾中除了主要过敏原Pen a 1外，白虾和红虾还存在分子量分别为29kDa和39kDa的过敏原。2004年我国学者赖荷等在中国罗氏虾的研究中发现其粗提液的电泳图上存在12条致敏条带，其主要的致敏组分分布于大分子区段，分子量分别为78.2、66.2、46.5、37.8kDa，这四条带与过敏性疾病患者血清特异性IgE呈阳性反应，反应率在100％-56％。1990年Morgan研究证明，虾中至少存在13种过敏原蛋白质，分子量范围在16-166kDa，其中包括Pen a1，利用免疫学实验证明大于82％的虾过敏个体对36kDa分子量的蛋白质有过敏性反应，其它蛋白质也有反应，但反应均低于50％。2008年在张华等人对刀额新对虾的研究中发现其虾粗提蛋白约有20条可辨蛋白带，分子量在12.1kDa-105.6kDa之间，其中7条为过敏原条带，分子量为36kDa、46.2kDa、60kDa、64.8kDa、68kDa、78kDa和88.5kDa。另外还有21.6kDa的蛋白被个别患者的血清识别，其中4条过敏蛋白条带反应率高，为主要过敏组分，分子量分别为36kDa、46.2kDa、60kDa、68kDa。
在酶法消减海虾过敏原蛋白的研究中发现，大部分的食物过敏原是蛋白质，在一定条件下，蛋白质会发生水解。蛋白酶能够对虾过敏原蛋白的结构进行破坏，其作用分为两个方面一是改变抗原决定簇的三级结构，或者断裂一些化学键使之失去原有的活性，从而降低其过敏性。二是断裂酰胺键，破坏过敏原的抗原表位，从而降低过敏原的免疫活性。通过筛选出高效专一性的酶对过敏原进行定向酶解，控制和优化酶解工艺参数，可以有效的降低过敏原。日本学者Kuniyoshi S等人利用蛋白酶水解虾虾过敏原，发现虾过敏原对酶解较为敏感。经trypsin、α-chymotrypsin、protease等三种蛋白酶处理的龙虾过敏原，部分或全部丧失了致敏性，但经酶处理后可产生苦肽，降低蛋白质的质量，食用口感差。
目前，利用酶法消减海虾过敏原蛋白还都处于研究阶段，没有在产业上运用的先例。
发明内容
本发明是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种利用木瓜蛋白酶水解海虾蛋白过敏原，制备味道鲜美无苦味的水解产物，形成低过敏原或无过敏原的海虾基料，为所有人群提供一种虾味食品添加物的方法。
本发明通过下述技术方案实现 一种酶法制备低过敏原海虾基料的方法，其特征在于，包括下述步骤 (1)将新鲜海虾虾肉，按照每10-25g虾肉加水100g将虾肉与水捣碎制成虾肉浆； (2)将虾肉浆加热到60℃并保温，之后在虾肉浆中加入木瓜蛋白酶水解，水解条件为pH值为6.5，木瓜蛋白酶与底物的质量比为1∶100，水解温度为60℃，水解时间为3小时；水解结束后，调整水解液的pH值为7.0，然后，80℃灭酶10分钟得到木瓜蛋白酶水解物； (3)按照100g木瓜蛋白酶水解物加入0.45g食盐和0.3g淀粉的比例在木瓜蛋白酶水解物中添加食盐和淀粉，混匀后，在60-70℃条件下进行真空浓缩至固形物含量大于60％(即100g浓缩物中含有60g固形物)得到海虾基料；或者，按照100g木瓜蛋白酶水解物加入0.45g食盐的比例在木瓜蛋白酶水解物中添加食盐，混匀后，进行喷雾干燥或冷冻干燥至含水量小于5％得到海虾基料。
所述喷雾干燥的条件为进风温度为180-190℃，排风温度为75-80℃，进料温度为60℃。
海虾可以为凡纳滨对虾(南美白对虾)、中国明对虾、刀额新对虾(基围虾)、虾蛄(皮皮虾)中的任一种。
本发明具有下述技术效果 本发明采用木瓜蛋白酶水解海虾蛋白，能够消除过敏原，得到的低过敏原或无过敏原海虾基料味道鲜美无苦味。通过本发明的方法直接水解虾肉或海虾蛋白制备水解产物，在动物实验中无明显过敏反应；通过ELISA检测，其过敏者血清的抗原抗体反应的OD值与正常人血清的抗原抗体反应的OD值的最大值无显著差异。将水解物通过浓缩制备膏状海虾基料，或经冷冻干燥或喷雾干燥的方法制备粉状海虾基料，可添加到其他食品中制备虾味食品的添加物。该制品可适用于所有人群，包括海虾过敏的人群。本方法能够在产业上应用。
具体实施例方式 以下结合具体实施例对本发明详细说明。
实施例1 1、虾肉浆制备 将新鲜凡纳滨对虾清洗干净，去头去皮得到虾肉，按每10g虾肉加水100g，通过高速组织捣碎机制成虾肉浆。
2、木瓜蛋白酶水解虾肉浆并通过动物实验检测过敏反应情况 (1)水解物制备 将制成的虾肉浆加热至60℃并保温，利用木瓜蛋白酶水解虾肉浆的条件为，按照木瓜蛋白酶与底物的质量比为1∶100的比例加入木瓜蛋白酶，在pH6.5，温度60℃的条件下水解3小时。水解过程中维持所设定的pH值不变。水解结束后，用氢氧化钠溶液调整水解液的pH值为7.0，然后80℃灭酶10min得到木瓜蛋白酶水解物。
(2)过敏反应检测 ①木瓜蛋白酶水解物致敏豚鼠全身免疫实验 用上述木瓜蛋白酶水解物进行豚鼠全身免疫实验，实验设计及结果见表1。
表1豚鼠全身免疫实验结果 由表1可以发现作为阳性对照组致敏和激发均为未水解的虾蛋白，豚鼠死亡率为100％。本实施例得到的木瓜蛋白酶水解物对用未水解的虾蛋白和水解的虾蛋白致敏豚鼠激发后豚鼠均正常，无死亡。
豚鼠全身免疫实验中所用水解虾蛋白经ELISA检测后的数值为木瓜蛋白酶水解物与海虾过敏者血清反应的OD值为0.047，该值在正常人血清反应的值范围内(正常人血清反应值的范围为0.3-0.5之间)。
②致敏豚鼠离体回肠平滑肌过敏性收缩试验 致敏豚鼠，200～350g，♀♂均可。用卵白蛋白等致敏。注射致敏原3～5周后，豚鼠被致敏，可供实验用。
实验观察取致敏豚鼠，放血处死，取出回肠一段，按离体器官装置进 行描记(仪器设备用BL-420F生物信号实时采集分析系统)。待基线稳定后，进行抗原攻击。观察、记录并比较各组的肠收缩幅度。结果以均值±标准差(x±s)表示，收缩力变化率(％)＝(处理后的肠平滑肌收缩力-处理前的肠平滑肌收缩力)/处理前的肠平滑肌收缩力×100％。
根据肠管收缩反应判断过敏反应的强度，结果见表2。
表2
与0.1％虾蛋白组比较，*0.01＜P＜0.05，**P＜0.01 由表2可以看出本实施例的木瓜蛋白酶水解物的致敏肠管收缩反应与虾蛋白相比具有显著差异。
3、低过敏原的膏状海虾基料制作 将步骤2所获得的木瓜蛋白酶水解物，按照100g木瓜蛋白酶水解物中添加0.45g食盐，0.3g淀粉，混匀后，在60-70℃条件下进行真空浓缩，浓缩至固形物含量大于60％，可获得膏状海虾基料。
实施例2 1.将新鲜凡纳滨对虾清洗干净，去头去皮得到虾肉，按每15g虾肉加水100g，通过高速组织捣碎机制成虾肉浆。
2、木瓜蛋白酶水解虾肉浆并通过动物实验检测过敏反应情况 (1)水解物制备 制备条件同实施例1。
(2)过敏反应检测 ①全身免疫实验检测结果同表1。
②致敏豚鼠离体回肠平滑肌过敏性收缩试验结果见表2。
豚鼠全身免疫实验中所用水解虾蛋白经ELISA检测后的数值为木瓜蛋白酶水解物与海虾过敏者血清反应的OD值为0.054，该值接近正常人血清反应的最大值(正常人血清反应值的范围为0.3-0.5之间)，与最大值相比无显著差异。
3、低过敏原的膏状海虾基料制作 将步骤2所获得的木瓜蛋白酶水解物，按照100g木瓜蛋白酶水解物中添加0.45g食盐，0.3g淀粉，混匀后，在60-70℃条件下进行真空浓缩，浓缩至固形物含量大于60％，可获得膏状海虾基料。
实施例3 1.将新鲜凡纳滨对虾清洗干净，去头去皮得到虾肉，按每25g虾肉加水100g，通过高速组织捣碎机制成虾肉浆。
2、木瓜蛋白酶水解虾肉浆并通过动物实验检测过敏反应情况 (1)水解物制备 制备条件同实施例1 (2)过敏反应检测 ①全身免疫实验检测结果同表1。
②致敏豚鼠离体回肠平滑肌过敏性收缩试验结果见表2。
豚鼠全身免疫实验中所用水解虾蛋白经ELISA检测后的数值为木瓜蛋白酶水解物与海虾过敏者血清反应的OD值为0.057，该值接近正常人血清反应的最大值(正常人血清反应值的范围为0.3-0.5之间)，与最大值相比无显著差异。
3、低过敏原的膏状海虾基料制作 将步骤2所获得的木瓜蛋白酶水解物，按照100g木瓜蛋白酶水解物中添加0.45g食盐，0.3g淀粉，混匀后，在60-70℃条件下进行真空浓缩，浓缩至固形物含量大于60％，可获得膏状海虾基料。
实施例4 木瓜蛋白酶水解物的制作方法及检测方法同实施例1。将所获得的木瓜蛋白酶水解物按照100g木瓜蛋白酶水解物中添加0.45g食盐，食盐溶解后，在进风温度为180-190℃，排风温度为75-80℃，进料温度为60℃的条件下进行喷雾干燥，控制水分含量小于5％得到粉状海虾基料。
实施例5 木瓜蛋白酶水解物的制作方法及检测方法同实施例1。将所获得的木瓜蛋白酶水解物按照100g木瓜蛋白酶水解物中添加0.45g食盐，食盐溶解后，采用真空冷冻干燥方法，干燥到水分含量小于5％得到粉状海虾基料。
权利要求
1.一种酶法制备低过敏原海虾基料的方法，其特征在于，包括下述步骤
(1)将新鲜海虾虾肉，按照每10-25g虾肉加水100g将虾肉与水捣碎制成虾肉浆；
(2)将虾肉浆加热到60℃并保温，之后在虾肉浆中加入木瓜蛋白酶水解，水解条件为pH值为6.5，木瓜蛋白酶与底物的质量比为1∶100，水解温度为60℃，水解时间为3小时；水解结束后，调整水解液的pH值为7.0，然后，80℃灭酶10分钟得到木瓜蛋白酶水解物；
(3)按照100g木瓜蛋白酶水解物加入0.45g食盐和0.3g淀粉的比例在木瓜蛋白酶水解物中添加食盐和淀粉，混匀后，在60-70℃条件下进行真空浓缩至固形物含量大于60％得到海虾基料；或者，按照100g木瓜蛋白酶水解物加入0.45g食盐的比例在木瓜蛋白酶水解物中添加食盐，混匀后，进行喷雾干燥或冷冻干燥至含水量小于5％得到海虾基料。
2.根据权利要求1所述的酶法制备低过敏原海虾基料的方法，其特征在于，所述喷雾干燥的条件为进风温度为180-190℃，排风温度为75-80℃，进料温度为60℃。
全文摘要
本发明公开了一种酶法制备低过敏原海虾基料的方法，旨在提供一种利用木瓜蛋白酶水解海虾蛋白过敏原，制备味道鲜美无苦味的水解产物，形成低过敏原或无过敏原的海虾基料，为所有人群提供一种虾味食品添加物的方法。将新鲜海虾虾肉，按照每10-25g虾肉加水100g将虾肉与水捣碎制成虾肉浆；将虾肉浆加热到60℃并保温，之后在虾肉浆中加入木瓜蛋白酶水解；按照100g木瓜蛋白酶水解物加入0.45g食盐和0.3g淀粉，混匀后，在60-70℃条件下进行真空浓缩至固形物含量大于60％得到海虾基料；或者，按照100g木瓜蛋白酶水解物加入0.45g食盐，混匀后，进行喷雾干燥或冷冻干燥至含水量小于5％得到海虾基料。
文档编号A23L1/223GK101756147SQ20101010241
公开日2010年6月30日 申请日期2010年1月29日 优先权日2010年1月29日
发明者胡志和, 吴海明, 王丽娟, 庞广昌, 陈庆森 申请人:天津商业大学