专利名称：一个调控果实采后成熟的基因及其编码产物与应用的制作方法
一个调控果实采后成熟的基因及其编码产物与应用本发明涉及香蕉柠檬酸合成酶基因(citrate synthase gene, MaCASl)序列的获 得、表达分析和体外调控基因表达调节香蕉果实采后成熟。柠檬酸合成酶(citratesynthase, CS, EC2. 3. 3. 1)催化草酰乙酸(oxaloacetic acid, OA)合成柠檬酸(citrate acid，CA)，是三羧酸循环和乙醛酸循环的关键酶。CS属于调控酶，它的活性受ATP、NADH、琥珀酰_CoA、CA、长链脂肪酸所抑制，又能 受 AMP 禾口 OA 的促进(Caggiano et al. , 1979 ；Mitchell et al. , 1995 ；Tabrettet al.， 2000)。根据作用位置的不同，CS在植物中大致分为两类即线粒体中的柠檬 酸合酶(mitochondrial citrate synthase, MCS)和非线粒体中的柠檬酸合酶
(nonmitochondrialcitrate synthase, non-MCS)-包括乙醛酸循环体中的柠檬酸合酶
(Glyoxysomalcitrate synthase, GCS)，两者在提纯方法、酶动力学、稳定性以及与线粒体 内膜的结合率上均存在差异(Kispal et al.，1991)。Schnarrenberger (2002)对已知序列 的柠檬酸合酶进行系统发育树的进化分析发现，植物中MGCS与酵母、猪、大鼠等真核生物 较为接近，是同一来源的，而乙醛酸循环体中的柠檬酸合酶则与原核生物的进化距离较近， 属同一来源。随着CS研究的深入，关于其在植物生理中作用的报道越来越多。Grzemski (2005) 发现MCS与植物根瘤固氮有关，酶活的降低会显著降低根瘤固氮酶的活性； Landschuetze(1995)发现MCS与花药或花粉发育相关，且与光合作用相关，在光合作用的 组织中表达较高，但在非光合作用的组织中表达量普遍偏低；在油菜、水稻、胡萝卜等植物 中GCS与耐铝、耐盐、耐磷等胁迫相关(Larsen et al.，1998 ；Koyamaet al.，2000)；此外， GCS还影响能影响种子的萌发(Pracharoenwattana et al.，2005)。CS催化的产物CA在许 多果实中存在，影响果实的酸度和口感，所以果实中CS酶活与CA含量的关系成为果实品质 研究者们感兴趣的热点。柠檬酸合酶基因已从南瓜(Cucurbita maxima)、水稻(Oryza sativa)和拟南芥 (Arabidopsis thaliana)等植物中被克隆，但对这些基因的更进一步的研究未见报道。我 们(Jin et al. 2008)利用cDNA微阵列和RT-PCR分析研究香蕉采后乙烯生物合成启动时 (采后10d)基因的差异表达，发现一个与其他植物同源的柠檬酸合酶基因明显上调表达。 推测该基因可能和香蕉过实采后成熟过程中乙烯生物合成相关，可能调控或影响香蕉果实 采后成熟过程。因此，CAS基因的开发利用，将有助于更加深入了解香蕉果实采后成熟机理， 建立更加安全、廉价、有效的果实采后保鲜新方法。为了深入研究香蕉果实采后成熟机理，建立安全、廉价、有效的果实保鲜新技术，提高果实的商品价值，分离与果实成熟相关基因并鉴定它们的功能十分必要，通过对这类 基因功能研究及调控，将对提高果实采后品质，培育耐储藏新品种具有重要意义。本发明提供的技术方案为构建香蕉果实采后0天、2天抑制缩减文库，获得一个 与CAS基因同源性较高的差异表达柠檬酸合酶基因同源的cDNA序列，RACE技术扩增该基因 全长序列(MaCASl)。荧光定量PCR方法研究在正常成熟、乙烯诱导成熟和1-MCP (1-methyl cyclopropene)抑制成熟的条件下，MaCASl在香蕉果实采后不同成熟阶段的表达情况。通 过体外诱导、抑制MaCASl的表达，研究果实成熟特性。1.香蕉果实采后2天抑制差减文库构建及分析采用热硼酸法法提取香蕉采后0天和2天果实总RNA，电泳检测RNA质量，质量检 测完毕后C于-76°C备用。按照 Clontech 公司的 PCR-Select cDNA SubstractionKit, Advantage 2 PCR Kit产品使用说明进行缩减杂交。抑制缩减杂交产物经与pGEM_T Easy Vecter连接，转化E.coli DH5 a，构建抑制差减文库。获得文库独立克隆测序、分析。2.香蕉柠檬酸合酶基因全长序列克隆根据SSH获得的基因片段和NCBI的比对结果可知，该基因片段为657bp，与其他植 物的柠檬酸和酶基因具有较高的同源性。用Primer Premier 5设计5' -RACE和3' -RACE 引物，以本研究室构建的香蕉果实cDNA文库为模板，PCR扩增5’端和3’端序列。将扩增 序列与已有的657bp序列拼接获得基因的全长序列。根据拼接全长序列设计引物在文库中 通过PCR扩增、测序验证。3.荧光定量研究MaCASl与果实采后成熟的关系采后香蕉果实分设乙烯处理、1-MCP处理和正常成熟3组，提取3组中不同成熟阶 段的果实总RNA反转录cDNA，荧光定量研究3中不同处理条件下MaCASl表达与成熟的关 系。4. MaGADl诱导剂草酰乙酸(0A)和抑制剂柠檬酸(CA)处理果实，研究体外调控基 因表达对果实成熟的影响将采后的香蕉果实按照一定浓度用草酰乙酸(0A)和柠檬酸(CA)分别处理，观察 处理果实成熟变化，乙烯生物合成关键酶基因ACC氧化酶和ACC合成酶基因表达分析，测定 果实成熟相关的生理指标，分析通过采后体外调控MaCASl的表达对果实成熟的影响。[结果分析]1.成功构建香蕉果实采后0天和2天的抑制缩减文库用差减PCR产物，以T/A克 隆法构建质粒载体文库，差减文库包括312个白色克隆，克隆饱满清晰。应用PCR方法对差 减文库的312个克隆进行筛选，获得302个重组子，插入片段集中在300bp-500bp之间，符 合抑制缩减文库的要求。2.成功克隆香蕉柠檬酸合酶基因全长序列对获得的抑制缩减文库中302个重组 测序分析，有1个与其他生物柠檬酸合酶基因具有较高同源性。根据获得的香蕉柠檬酸合 酶基因片段设计5’端和3’端PCR引物，克隆5’和3’端序列，与原有序列拼接后利用生物 信息学软件分析，具有完整的阅读框架，为一个完整基因。根据拼接全长序列重新设计其5’ 和3 ’弓丨物，从cDNA文库中获取序列，测序验证，它们的碱基序列完全相同，命名为MaCAS 1。 包含一个1542bp的完整开放阅读框(序列1)，编码513个氨基酸残基的多肽(序列2)。与 南瓜乙醛酸循环体中的柠檬酸合酶CuGCS (登录号为P49299)具有很高的同源性，一致性达
4到82%。与拟南芥中的CS3、CS2，水稻中的0sGCS、0sI_006349也具有很高的同源性，一致 性分别达到81%、81%、83%和77%。GenBank查找未见香蕉该基因的报道。3.MaCASl在香蕉果实采后被乙烯诱导表达，并可调节成熟乙烯生物合成， MaGCSl在香蕉果实正常成熟时基因表达量的变化与内源乙烯的释放相一致，而外源乙烯处 理，MaCASl被诱导表达，表达量明显增加且提前。1-MCP处理后MaGCSl的表达被明显抑制 (图1)。以上结果显示，MaGCSl与果实采后成熟过程中乙烯生物合成密切相关，促进香蕉 果实采后成熟中的乙烯合成可以显著促进MaGCSl的表达，抑制香蕉果实成熟中的乙烯合 成可以显著抑制MaGCSl的表达。因此，推测该基因与香蕉果实采后成熟相关，对该基因的 调控将达到调控香蕉采后成熟的目的。4. MaCASl诱导剂和抑制剂显著促进和抑制该基因的表达，进而影响果实的成熟 过程和品质研究结果证明，草酰乙酸(OA)和柠檬酸(CA)分别能诱导和抑制香蕉果实成 熟，通过生理学分析显示这种影响改变了果实颜色、硬度、芳香物质、淀粉含量等。证实对 MaCASl表达的调控可以调节果实采后成熟(图2、图3)。进一步研究显示，MaCASl调控果 实成熟是通过调控MaACOl基因的表达来实现的，而MaACOl是香蕉果实采后成熟过程中启 动MaACSl基因表达和成熟乙烯生物合成的关键酶基因。因此，我们推测香蕉MaCASl是香 蕉果实采后成熟过程中成熟乙烯生物合成的上游调节者，它通过调控MaACOl的表达控制 果实的成熟过程和品质形成(图4)。
图1是1-MCP处理和乙烯处理条件下，利用荧光定量PCR分析MaCASl在香蕉采后不同 时期的表达图2是OA(上)和CA(下)处理对香蕉果实采后成熟的影响图3是0A和CA处理后荧光定量PCR分析MaCASl的表达图4是0A和CA处理荧光定量PCR分析MaCASl、MaACOl\MaACSl的表达图下面结合实施方式对本发明进行详细说明1、材料来源巴西香蕉(M. AAA Group Cavendish)果实，采自中国热带农业科学院 热带生物技术研究所实验基地。2、方法(1)香蕉果实采后2天抑制差减文库构建及分析参照Ching-Yi Wan和 Thea A. ffilkins (1994)的热硼酸法提取香蕉果实RNA。按照PCR-Select cDNA SubstractionKit，Advantage 2 PCR Kit产品使用说明进行0天和2天果实RNA抑制缩减 杂交。抑制缩减杂交产物经与pGEM-T Easy Vecter连接，转化E. coli DH5 a。采用PCR的 方法对重组子进行鉴定，PCR鉴定采用试剂盒提供的引物Nested PCR 引物 1 :5’ -TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3，Nested PCR 引物 2R :5’ -AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3，以待测质粒为模板，在Biometra型PCR仪上进行PGR反应。反应条件为94°C变 性5. 0分钟；94°C 45秒，68°C 1. 0分钟，72°C 1. 0分钟，扩增35个循环；72°C延伸7. 0分钟。然后取5. 0 yl PCR反应液进行1. 2%琼脂糖凝胶电泳，5v/cm恒压条件下电泳30分钟后， 于紫外灯下观察重组子插入片段大小。将插入有目的片段的重组子测序、分析。(2)香蕉柠檬酸合酶基因全长序列克隆根据SSH获得的基因片段和NCBI的比 对结果可知，该基因片段为657bp，与其他植物的柠檬酸和酶基因具有较高的同源性。用 Primer Premier 5 设计 5' -RACE 和 3' -RACE 引物，5，-RACE 引物GCS-5 :5， -GGTGCTCTGTATGGTCCTCTCCA-3，；3，-RACE 引物GCS-3 :5， -AAGGTCATCCGCAAGTTG-3，以本研究室构建的香蕉果实cDNA文库为模板，利用5’和3’文库接头引物PCR扩 增5’端和3’端序列。5’文库接头引物ptr5' :5， -CTCCGAGATCTGGACGAGC-3，；3’文库接头引物ptr3' :5， -TAATACGACTCACTCACTATAGGG-3’在0. 2mL离心管中依次加入cDNA 文库库液1. 0 ii L10 X Buffer (含 2. 5mM Mg2+)2. 5 u LdNTP (dA/G/C/TTP lOmMeach)0. 5 u Lptr5' (lOpM)1. Ou L5，-RACE(lOpM)1. Ou LTaq 聚合酶(55u/ u L)0. 3 u LddH2018. 7u L_总体积25. Ou LcDNA 文库库液1. 0 ii L10 X Buffer (含 2. 5mM Mg2+)2. 5 u L
dNTP (dA/G/C/TTP lOmMeach)0. 5 u Lptr3' (lOpM)1. Ou L3，-RACE(lOpM)1. Ou LTaq 聚合酶(5u/ u L)0. 3 u LddH2018. 7u L_总体积25.0iiL将扩增5’和3’端序列与已有的657bp序列拼接获得基因的全长序列。根据拼接全长序列，用Primer Premier 5设计引物，交由上海生物工程有限公司 合成。其中CS L-5是上游引物，CS L-3是下游引物。CS L-5 5' -CGCTTCCCTTCCCCTTGCC-3‘CS L-3 5' -CTATGCTTATTGTTCCACGCACGAGT-3‘
以本研究室构建的香蕉果实cDNA文库为模板，反应体系同上进行PCR扩增、测序。该基因cDNA 0RF 为 1542bp bp。(3)荧光定量研究MaCASl与果实采后成熟的关系提取乙烯处理、1-MCP处理和采后正常成熟香蕉不同成熟期的果实总RNA反转录 cDNA用作荧光定量PCR的模板。用NCBI的保守结构域分析软件分析MaGADl、Ma-act in 1 2个基因的保守结构， 确保所设计引物的扩增片段位于非保守区；然后根据荧光定量PCR的引物设计原则，用 primer premier 5 设计弓|物。MaCASl 上游引物5，-GAGTTCTTTCCTGTTCTGTTTG-3，MaCAS 1 下游引物5，-CTATGCTTATTGTTCCACGC-3，Ma-act in 1 上游引物5 ‘ -CGAGGCTCAATCAAAGA-3 ‘Ma-act in 1 下游引物5 ‘ -ACCAGCAAGGTCCAAAC-3 ‘ 在Stratagene的Mx3000P仪器上进行荧光定量PCR。在0. 2mL的PCR反应 管中加入 SYBR Premix Ex Taq (2 X) (TAKARA) 12. 5 u L, Rox reference Dye II(50X) (TAKARA) 0. 5 ii L、5 ii M的一对引物各0. 75 u L，cDNA样品1 y L，然后用水补足至25 y L。每 个样品既要用于扩增目的基因又要扩增内参基因Ma-actinl，各个基因的扩增都做三个重 复。按照94°C预变性3min，94°C变性7s，55°C退火15s，72°C延伸20s，共40个循环的反应 程序进行扩增(四个基因的反应程序是一致的)，并于每个循环的延伸阶段采集荧光信号。 反应结束后做94°C _55°C的融解曲线分析。荧光定量PCR结果证明，MaCASl表达受乙烯诱导、1_MCP抑制，在香蕉果实采后成 熟过程中起着调控乙烯生物合成、果实成熟的作用。(4)MaCASl诱导剂OA和抑制剂CA处理果实对成熟期的影响将采收的果实切割 成单蕉指，用0. 次氯酸钠进行表面消毒lOmin，同时把果实顶部的干花抹掉，放置一个 晚上晾干，随机选取成熟度较为一致的香蕉果实分成3个处理正常成熟、OA处理、CA处理。 每个处理选取30-40个果实，每3个果实装进一个保鲜盒中。正常成熟的果实置于22°C恒 温条件下成熟。观察不同处理对香蕉果实采后成熟时期的影响，结果显示OA处理明显能缩短达 到每个成熟度的时间，促进成熟；CA处理明显能延长达到每个成熟度的时间，延缓成熟。
权利要求
一个分离的香蕉柠檬酸合成酶基因，其特征在于具有序列表中1项下的序列。
2.序列表中1项下的序列限定的蛋白质，具有序列表中序列2的氨基酸残基序列或将 序列的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的 氨基酸残基序列相同活性的由序列衍生的蛋白质。
3.草酰乙酸(OA)和柠檬酸(CA)处理香蕉采后果实，可诱导和抑制权利要求1中的序 列所编码基因表达。同时，CA对果实采后成熟有抑制作用而OA对果实采后成熟有促进作 用。
全文摘要
本发明公开了一个与香蕉果实采后成熟过程有关的基因MaCAS1是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的蛋白质，具有序列表中序列2的氨基酸残基序列或将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列衍生的蛋白质。该基因可被草酰乙酸(OA)和柠檬酸(CA)分别诱导和抑制表达，从而调控采后香蕉果实成熟度的变化。该基因的应用对于建立香蕉采后果实成熟调控新技术和培育优良品种具有重要的理论及实际意义。
文档编号C12N9/10GK101851632SQ20101016623
公开日2010年10月6日 申请日期2010年4月20日 优先权日2010年4月20日
发明者刘菊华, 张建斌, 徐碧玉, 贾彩红, 迟光红, 金志强 申请人:中国热带农业科学院海口实验站