专利名称：与鸭龙骨长性状连锁的微卫星标记、其检测试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及与鸭龙骨长性状连锁的微卫星标记、 其检测试剂盒及应用。
背景技术：
it Jl M (microsatellite) X ^ ^J M j^5 ^lJ M M (Sample SequenceRepeats, SSR)，一般以1-6个碱基为核心序列，首尾相连组成的串联重复序列，侧翼DNA序列位于核 心序列的两端，为保守的特异单拷贝序列，能使微卫星特异地定位于染色体常染色质区的 特定部位。这种序列存在于几乎所有真核生物的基因组中，基因的间隔区和内含子以及外 显子和调控区均有微卫星的分布(黄海根，1995)。不同物种中，微卫星序列的含量各不相 同，并且各种微卫星序列的丰度在不同物种中也各不相同。与其它分子标记相比，微卫星标记具有以下特点(1).广泛随机分布于真核生物 基因组中，外显子和内含子皆有分布；(2).可根据微卫星两侧的保守性侧翼序列设计引 物，通过PCR扩增检测其多态性；(3).高度多态，信息含量高；(4).进化上分离时间短的 物种间微卫星侧翼序列保守性较高，如Reed等用鸡的特异性微卫星引物扩增火鸡基因组， 54%的引物具有PCR扩增产物(Reed et al. ,2000) ； (5).共显性遗传；(6).微卫星的序 列一般较短，即使是部分降解的DNA也可能有足够用来扩增的微卫星序列，这一点更优于 RAPD和更长目的基因序列的VNTR，因而在古DNA的研究及法医学鉴定中具有重要的应用价 值；(7).随着毛细管电泳技术及相关技术的发展，全自动化的大规模基因型分析已成为可 能。因而，自1974年Skirmer等首先发现微卫星以来(Skinner et al.，1974)，该标记被广 泛应用于生物进化、遗传学鉴定、种质资源分析及遗传图谱的构建、功能基因和数量性状的 定位等研究(张天真等，2001 ；樊斌，1999 ；况少青，1997 ；Heyen et al.，1997，Schnabel et al.，2000，Rosenberg et al.，2001)龙骨长是体尺性状中重要的一项，它能够反应禽类的生长发育状况。对龙骨长这 一性状的微卫星标记，能够为辅助育种提供有效参数，提高育种效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种与鸭龙骨长性状连锁的微卫星标记、其检测试剂盒及应用。本发明通过设计微卫星引物并荧光标记微卫星引物，利用PCR扩增得到不同长 度的微卫星片段，在ABI测序仪GS-RUN-360-P0P4default module下电泳，电泳结果用 GenesScan3. 7和Genemapper分析扩增片段大小，利用Crimap2. 4软件构件基因遗传连锁图 谱。在构建的基因遗传图片的基础上，用Haley回归区间定为法对重要经济性状进行QTL 定位，定位采用模型为y = μ +P (Q | M) [CalA+CdlD] +e其中μ为群体平均数；
P(Q|M)为已知标记基因型时，QTL标记基因型的概率；Cal为群体中第i个个体在给定座位的加性组分的回归系数；A为QTL的加性效应；Cdl为群体中第i个个体在给定座位的显性组分的回归系数；D为QTL的显性效应；e为残差效应。结果发现，由引物SEQ ID No. 2&3标志的微卫星标记与鸭龙骨长性状相连锁。进 而，本发明提供用于鸭鸭龙骨长筛选的微卫星标记，其中优势等位基因为SEQ ID No. 1所示 的微卫星标记。本发明进一步提供用于扩增上述微卫星标记的引物。在本发明优选的实施方案中 所述引物序列为Pf :GGACTTTGCCAAGAGGAACA,Pr :GCGACGGAGGGGTTTTGC。进一步，本发明还提供含有上述引物的试剂盒。该试剂盒还进一步包括以下试剂 中的一种或多种PCR缓冲液、Mg2+、DNA聚合酶、dNTPs。本发明微卫星标记及试剂盒可用于鸭的辅助育种，快速准确的辅助筛选，具有早 期筛选、节省时间、成本低廉、准确性高的优点。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以 下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。随机采自北京金星鸭业中心的15个鸭群体(A-O)的各40个鸭个体血样，群体包 括2个北京鸭保种群体M和N，2个从英国樱桃谷公司引进的樱桃谷鸭品系(C、D)，11个北 京鸭人工选育品系(A、B、E-L、0)实施例1微卫星标记与龙骨长性状的关联1、引物信息5，端标记有HEX或FAM亚磷酸酰胺荧光基团的引物表 1
~M 上下■物(5|-3’)~产物大小Tm(。C)表型解释效雌 _(bp)_ki(%)_
龙骨长(KBL) GGACTTTGCCAAGAGGAACA226-228 63.5 93
GCGACGGAGGGGTTTTGC2.禽血的采取及处理鸭厂采集到15个家系共约650个个体的纯种北京鸭血液样品，翅静脉采血，每一 个体采取0. 5ml血样，加入0. 2ml抗凝剂，充分混勻。常温带回实验室后，以1 9比例加 入禽血裂解液，常温裂解抗凝血48小时后_20°C保存备用。
4
3..鸭基因组DNA的提取(1)取0. 4ml裂解血(Iml血液加9ml禽血裂解液)放入1. 5ml离心管中，视情况 补加TE稀释；(2)加入蛋白酶k至终浓度200 μ g/ml，混勻，55°C水浴消化24_36小时，视情况补 加蛋白酶K，继续消化；(3)加入等体积Tris饱和酚，轻摇lOmim，12000rpm离心IOmin ；(4)将上清转移至新离心管中；(5)用等体积的酚氯仿(1 1)和氯仿各抽提一次；(6)上层水相加入1/10体积乙酸钠(pH5. 2)和2倍体积无水乙醇沉淀DNA，室温 沉淀Imin左右至致密的絮状DNA出现；(7)用干净的Tip枪头把DNA挑出放入新离心管，用70%的乙醇洗涤DNA沉淀两 次，真空抽干后加入100-200 μ 1 TE (ΡΗ8. 0)溶解DNA ；(8)0. 7%的琼脂糖电泳初步检测浓度和纯度，将各样品DNA浓度稀释至20ng/ μ I。4. PCR 扩增对于上面提及的各对微卫星荧光引物分别进行PCR反应条件(退火温度Tm)的确 定，个别引物过去所摸索的条件并不理想，所以需要重新进行梯度PCR反应确定一个合适
的退火温度。条件确定后再进行大规模鸭群体PCR扫描。
PCR反应体系(15 μ 1)
上游引物(IOmM)0. 5μ 1
下游引物(IOmM)0. 5μ 1
dNTP(IOmM)1. 2μ 1
10XPCR Buffer1. 5μ 1
Taq酶0. 3μ 1
模板(20ng/ μ 1)2. 0μ 1
dd H2O9. 0μ 1
反应条件
开始，94°C预变性 5min ；中间，94°C 30S, 63. 5°C 30S, 72°C 35S，共 35 个循环；最后，
72 0C延伸7min，4V保存。反应于96孔板中进行，应做阴性对照。5.用试剂盒进行基因型分析该试剂盒包括PCR扩增引物一对(SEQ ID No. 5&6)，PCR扩增酶，限制性内切酶 HaeIII和Rsa I及其缓冲液。根据标记在引物5’端荧光的差异、扩增片段的大小以及尽量避免引物间的配对， 将引物对放在一个组中，PCR产物按引物名称根据片段大小及所加荧光标记颜色差别进行 的组合。用灭菌的去离子水稀释PCR产物3-10倍，取1 μ 1稀释产物，加入10 μ 1去离子 甲酰胺，0. 15 μ lGenescan-350R0XTM 或 Genescan_500R0XTM，充分振荡混勻后在 3100 测序 仪 GS-RUN-36-P0P4default Module 下(D 系统)电泳 36-44 分钟。应用 Genescan 3. 7 及 Genemapper 1. 1软件分析PCR扩增片段大小，人工校正后用Genepop 3. 4、Cervus 2. 0软 件分析各个家系各个位点基因型相关信息。扩增序列的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，其中5’起87 102区域为核心区，其他区域为侧翼区。表2基因型分析结果 表中“No.，OHet, Ehet, PIC"分别表示“位点等位基因数，实际杂合度、理论杂合度 和信息含量”6.子代性状筛选对每一批预选留子代详细记录6周龄龙骨长。筛选6周龄龙骨长的鸭传种。结果 表明，在筛选后的北京鸭后代群体在基因组水平得到了改善，优势等位基因频率得到了不 同程度的提高。结果如下表
权利要求
与鸭龙骨长性状连锁的微卫星标记，其为以下引物的扩增产物PfACTTCTCTTGTAGGCATGTCA，PrCACCTGTTGCTCCTGCTGT。
2.如权利要求1所述的微卫星标记，其核苷酸序列如SEQIDNo. 1所示。
3.用于扩增权利要求1所述微卫星标记的引物。
4.如权利要求2所述的引物，其为 Pf ACTTCTCTTGTAGGCATGTCA,Pr :CACCTGTTGCTCCTGCTGT。
5.含有权利要求3或4所述引物的试剂盒。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其还包括以下试剂中的一种或多种PCR缓冲液、Mg2+、 DNA 聚合酶、dNTPS。
7.权利要求1或2所述微卫星标记、权利要求3或4所述引物或权利要求5或6所述 试剂盒在鸭选育中的应用。
全文摘要
本发明提供了与鸭龙骨长性状连锁的微卫星标记、其检测试剂盒及应用，本发明微卫星标记，是引物对SEQ ID No.2&3的扩增产物，其优势基因型如SEQ ID No.1所示。本发明微卫星标记及试剂盒可用于鸭的辅助育种，快速准确的辅助筛选，具有早期筛选、节省时间、成本低廉、准确性高的优点。
文档编号C12N15/11GK101899514SQ20101023430
公开日2010年12月1日 申请日期2010年7月23日 优先权日2010年7月23日
发明者吴非, 李宁, 黄银花 申请人:李宁