专利名称：一种mthfr与fgf5基因snp检测特异性引物和液相芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技木，具体的是涉及ー种MTHFR与 FGF5基因SNP检测特异性引物和液相芯片。
背景技术：
Ν5’1。-亚甲基四氢叶酸还原酶(Methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR) 是叶酸代谢过程的关键酶，也是同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)重新甲基化为蛋氨酸所需要的关键酶。主要生化功能是催化还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)介导的从5，10-亚甲基四氢叶酸到5-甲基四氢叶酸的还原反应，生成体内最主要的甲基供体， 5-甲基四氢叶酸是组织和血清叶酸的主要形式，參与体内多种重要的生化反应(如嘌呤和胸腺嘧啶的生物合成等)。MTHFR定位于染色体1ρ36. 3，基因包括11个外显子和10个内含子，外显子的长度分别为99-252bp，内含子的长度分别为192-98Ibp。MTHFR基因突变可直接影响亚甲基四氢叶酸还原酶的活性和耐热性，表现为不同程度的酶活性降低并伴有酶的耐热性降低，继而导致同型半胱氨酸(Hcy)向蛋氨酸的转化发生障碍，使Hcy在血液中堆积，促进氧自由基的生成，引起血管内皮細胞的损伤。目前研究认为，血浆高Hcy是心脑血管疾病的独立危险因素。成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor, FGF)是ー组强大的促细胞分裂物，其靶细胞包括血管内皮細胞、血管平滑肌細胞、成纤维細胞等，因此它对于血管壁细胞的作用是非特异的。FGFs通过刺激血管内皮细胞迁移、促进细胞基质降解和平滑肌細胞増殖等功能參与血管新生的过程。FGF5是FGF中的一员，位于人类基因组4q21。在基因治疗方面，FGF5基因首先被应用于心肌缺血治疗的研究。Giordano等在猪慢性心肌缺血模型中予冠脉内注射携帯FGF5基因的重组腺病毒，在心肌内成功地检测到FGF5mRNA和蛋白的表达；组织学检查发现FGF5组心肌内毛細血管数多于对照组，缺血区心肌收缩功能改善更为明显。当FGF5基因出现突变则会改变心血管的正常状态，引起心血管疾病的发生。本发明目标检测的MTHFR和FGF5基因突变位点，如表所示
权利要求
1.ー种MTHFR与FGF5基因SNP检测液相芯片，其特征在于，主要包括有(A).针对每种SNP分别设计的野生型和突变型的ASPE引物每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因SNP位点的特异性引物組成，所述野生型和突变型的特异性引物分别为针对MTHFR基因的G121A SNP位点的SEQ ID NO. 9及SEQ ID NO. 10、针对 A105G SNP位点的 SEQ ID NO. 11 及 SEQ ID NO. 12、针对GlllA SNP位点的 SEQ ID NO. 13 及 SEQ ID NO. 14、和 / 或针对 FGF5 基因的 T196ASNP 位点的 SEQ ID NO. 15 及 SEQ ID NO. 16 ； 所述tag序列选自SEQ ID NO. 1-8 ；(B).有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO. 17 SEQ IDN0. 24中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C).用于扩增出需要检测的、具有相应SNP位点的目标序列的引物。
2.根据权利要求1所述的MTHFR与FGF5基因SNP检测液相芯片，其特征在干，所述扩增引物为针对MTHFR基因的G121A SNP位点的SEQ ID NO. 25及SEQ ID NO. 26、针对A105G SNP 位点的 SEQ ID NO. 27 及 SEQ ID NO. 28、针对 GlllA SNP 位点的 SEQID NO.四及 SEQ ID NO. 30、和 / 或针对 FGF5 基因的 T196A SNP 位点的 SEQ ID NO. 31 及 SEQ ID NO. 32。
3.根据权利要求1所述的MTHFR与FGF5基因SNP检测液相芯片，其特征在干，所述 ASPE引物为针对MTHFR基因的由SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 9组成的序列及由SEQID NO. 2和SEQ ID NO. 10组成的序列、由SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 11组成的序列及由SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 12組成的序列、由SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 13組成的序列及由 SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 14组成的序列、和/或针对TOF5基因的由SEQ IDN0. 7和SEQ ID NO. 15組成的序列及由SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 16組成的序列。
4.根据权利要求1所述的MTHFR与FGF5基因SNP检测液相芯片，其特征在干，(A).所述ASPE引物针对MTHFR基因的由SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 9组成的序列及由SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 10組成的序列、由SEQ ID N0. 3和SEQ IDN0. 11組成的序列及由SEQ ID N0. 4和SEQ ID N0. 12組成的序列、由SEQ ID N0. 5和SEQ ID N0. 13組成的序列及由 SEQ ID N0. 6和SEQ ID N0. 14组成的序列、和针对FGF5基因的由SEQ ID N0. 7和SEQ ID N0. 15組成的序列及由SEQ ID N0. 8和SEQ ID N0. 16組成的序列；(B).有anti-tag序列包被的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列；所述anti-tag序列选自SEQ ID N0. 17 SEQ IDN0. 24中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；(C).所述扩增引物针对MTHFR基因的G121ASNP位点的SEQ ID N0. 25及SEQ IDN0. 26、针对 A105G SNP 位点的 SEQ ID N0. 27 及 SEQ ID N0. 28、针对 GlllA SNP 位点的 SEQ ID N0. 29 及 SEQ ID N0. 30、和针对 FGF5 基因的 T196A SNP 位点的 SEQ IDN0. 31 及 SEQ ID N0. 32。
5.根据权利要求1-4任一项所述的MTHFR与FGF5基因SNP检测液相芯片，其特征在干，所述间隔臂为5-10个T。
6.ー种MTHFR与FGF5基因SNP检测特异性引物，其特征在于，包括有如下针对MTHFR 基因的 G121A SNP 位点的 SEQ ID N0. 9 及 SEQ ID N0. 10、针对 A105GSNP 位点的 SEQ ID NO. 11 及 SEQ ID N0. 12、针对 GlllA SNP 位点的 SEQ ID N0. 13 及 SEQ ID N0. 14、和 / 或针对 FGF5 基因的 T196A SNP 位点的 SEQ ID NO. 15 及 SEQID NO. 16。
全文摘要
本发明公开了一种MTHFR与FGF5基因SNP检测特异性引物和液相芯片，所述液相芯片包括有由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变的特异性引物组成的ASPE引物，所述特异性引物分别为针对MTHFR基因的G121A SNP位点的SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10、针对A105G SNP位点的SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12、针对G111A SNP位点的SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14、和/或针对FGF5基因的T196ASNP位点的SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16；有anti-tag序列包被的微球；扩增引物。本发明所提供的MTHFR与FGF5基因SNP检测液相芯片的检测结果与测序法的吻合率高达100％。
文档编号C12Q1/68GK102533952SQ201010590999
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月16日 优先权日2010年12月16日
发明者刘志明, 秦会娟, 许嘉森, 郭婧 申请人:广州益善生物技术有限公司