专利名称：用环介导等温扩增方法检测诺沃克类病毒的试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及一种用环介导等温扩增方法检测诺沃克类病毒的试剂盒及方法。
背景技术：
诺沃克类病毒感染是一种由诺沃克类病毒所引起的传染病。此病毒会引致食物中 毒或肠胃炎，是很多国家非细菌性胃肠炎的最主要致病原，而且容易在安老院及学校引致 病症爆发。除此之外，任何年龄的人士均有机会染上此病，多发于冬季。以往检测诺沃克类病毒的主要办法聚合酶链式反应法(PCR法)，该法快速、灵 敏，但需要昂贵的PCR仪。目前尚未有用环介导等温扩增方法检测诺沃克类病毒试剂盒及 方法的报道。
发明内容
为了解决现有技术所存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种用环介导等温 扩增方法检测诺沃克类病毒的试剂盒及方法，通过使用该试剂，能快速、特异性强、灵敏度 高且成本低的用环介导等温扩增(Loop — mediated isothermal amplification, LAMP)方 法检测诺沃克类病毒的试剂盒，并提供一种使用该试剂盒快速检测诺沃克类病毒的方法， 该技术将会在遗传和传染病的早期诊断及预防控制方面发挥重要作用。本发明的主要原理为(1)特殊设计一组可识别靶DNA六个不同序列的两个内引 物(上游内引物和下游内引物)和两个外引物(上游外引物和下游外引物)，内引物包含靶 DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内引物首先与靶DNA杂交，随后的链置换DNA合成；在 具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下由一个外引物启动，释放出单链DNA，并作为由 杂交到靶的另一端的一个内引物和一个外引物启动的DNA合成的模板，产生一个原始的茎 环DNA ； (3)内引物以原始的茎环DNA为模板，启动链置换DNA的合成，产生一个原始的茎环 DNA和一个新的有两倍茎长度的茎环DNA ； (4)在等温条件下，内引物以茎环DNA为模板，通 过链置换形成多个含有靶DNA反复重复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使靶DNA 累积到IO9拷贝，可通过荧光染料来观察扩增结果。本发明的目的通过如下技术方案实现一种用环介导等温扩增方法检测诺沃克类 病毒的试剂盒及方法，该试剂盒包括
环介导等温扩增反应液A
含有 IOX Thermopol 反应缓冲液、300 — 500uM dNTP、2 — 4mM硫酸镁、0. 8 — 1. 2uM 上游内引物、0. 8-1. 2uM下游内引物、0. 2 — 0. 3uM上游外引物、0. 2 — 0. 3uM下游外引物； 其中IOX Thermopol反应缓冲液含有200mM pH8. 8的三羟基甲基氨基甲烷一盐 酸、IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和1 %曲拉通X — 100 ； 其中，上游内引物为
GAGATYGCGRTCYCCTGTCCATTTTGVTGGCAGGCCATGTTCCG ； AGATTGCGATCGCCCTCCCATTTTGCCCAGACAAGARSCMATGTT ；CCCAHGTGCTSARGTCTGAGAATTTTTGGATTTTTACGTGCCMAGRCA ； CCCAHGTGCTSARGTCTGAGAATTTTCATGAGTTTTATGTGCCAAAGT ； 下游内引物为
TAAATGATGATGGCGTCTAAGGATTTTRCCTCYGGTACYAGCTGGC ；
TAAATGATGATGGCGTCTAAGGATTTTTAACCTCCGGYACSAGYTGA ；
TCDGAATGAAGATGGCGTCGATTTTTTGRCCTCTGGKACGAGGTT ；
TGTGAATGAAGATGGCGTCGATTTTYYTCTGGGACGAGRCMGGC ；
TGTGAATGAAGATGGCGTCGATTTTGACCTCATTATTACTTTCTGGC ；
TGTGAATGAAGATGGCGTCGATTTTTCffTTKTKRMYCTCTGGKACGA ；
TGTGAATGAAGATGGCGTCGATTTTGYCTCAKTATTRCTYTCTGGC ；
上游外引物为
GGTTTRGARATGTATGTSCCA ；
AAGGGGGSYTTGARATSTAC ；
GAAGGTGGCATGGAYTTTTA ；
AGTGGTGGTCTGGARTTTTA ；
ACffGARYTSAARGARGGTGG ；
GGCATGGTffATCAAAGAAG ；
GAGATYAAGAGTGGTGGTC ；
下游外引物为
CATTGRffATffGGSTCAGCT ；
TGCAAGAGGGTCAGAAG ；
GffGGCAGTGGTTCAGCA ；
TCHAGffGCCATBRYCTCRTT ；
ACSGGYTCAAGAGCCATG ；
AGCCCCMRCCACRGGYTC ；
AGCGCCYGCAACKGGG。环介导等温扩增反应液A每管23uL的组成为0. 5uL IOX Thermopol反应缓冲液、 1. OuL IOmMdNTPU. OuL 20uM 上游内引物、1. OuL 20uM 下游内引物、0. 25uL 20uM 上游外引 物、0. 25uL 20uM 下游外引物、0. 5uL IOOmM 硫酸镁、16. 5uL dd H2O0用环介导等温扩增方法检测诺沃克类病毒的方法，依次包括(1) - (3)下列步骤 (1)病毒RNA的提取
A.取250uL样本，加入1.5mL离心管中；
B.加入500uL的SolutionΑ,剧烈振荡混勻后，室温放置5分钟；
C.加入125uL 的 Solution B 和 125uL 的 DB Buffer，均勻混合后，12，000 rpm 离心 5 分钟；
D.将试剂盒中的Spin Column 安置于 Collection Tube (2mL)上；
Ε.将上述操作步骤3的上清液850uL转移至Spin Column中，12，000 rpm离心2分 钟，弃滤液；
F.将500 uL的Rinse A加入至Spin Column中，12，000 rpm离心1分钟，弃滤液；G.将500uL的Rinse B加入至Spin Column中，12，000 rpm离心1分钟，弃滤液；
H.重复操作步骤7;
I.将SpinColumn安置于新的1. 5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入 30 uL Elution Buffer (含 RNase Inhibitor luL)，室温静置 1 分钟；
J. 12，OOOrpm离心1分钟洗脱病毒RNA ；
(2)RT反应
A.按下述成分配置好20uL的反应液4uL氯化镁、2uL 10XRT缓冲液、6. 5uL Rnase free dH20、2uL dNTP Mixture (各 IOmM)、0· 5uL Rnase Inhibitor (40υ/μ1) ,2uL AMV Reverse Transcriptase (5U/M-l) > IuL Random 9mers (50ρπιο1/μ1)、2uL 样品 RNA ;
B.30°C保温10分钟；
C.42°C左右45分钟；
D.990C加热5分钟；
E.5°C保持5分钟，获得DNA模板；
(3)诺沃克类病毒的环介导等温扩增
A.在装有23uL环介导等温扩增反应液A的反应管中加入IuL待检模板DNA，于恒温金 属浴上95°C放置3 - 5分钟，立即置于冰上1 一 3分钟；
B.在反应管中加入IuLDNA聚合酶B;
C.于恒温金属浴上60- 65°C放置45 - 90分钟；
D.将金属浴调到80- 95°C终止反应，3 — 5分钟后取出待检；
(4)显色检测
在反应管中加入IuL显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，说明 待检样品含有或为诺沃克类病毒。本发明采用的环介导等温扩增(LAMP)技术，该技术特异性强，与PCR检测方法有 相同的高灵敏度，但不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳 方法来观察，使用荧光染料来观察即可，简单而快速，特别适用于基层医疗机构。
具体实施例方式下列实施例进一步说明本发明，但不应当作对本发明的限制。实施例1
环介导等温扩增反应液A
含有 10X Thermopol 反应缓冲液、300 — 500uM dNTP,2 一 4mM硫酸镁、0. 8—1. 2uM 上游内引物、0.8 — 1. 2uM下游内引物、0. 2-0. 3uM上游外引物、0. 2 — 0. 3uM下游外引物； 其中10X Thermopol反应缓冲液含有200mM pH8. 8的三羟基甲基氨基甲烷一盐 酸、IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和1 %曲拉通X — 100 ； 其中，上游内引物为
GAGATYGCGRTCYCCTGTCCATTTTGVTGGCAGGCCATGTTCCG ； AGATTGCGATCGCCCTCCCATTTTGCCCAGACAAGARSCMATGTT ； CCCAHGTGCTSARGTCTGAGAATTTTTGGATTTTTACGTGCCMAGRCA ； CCCAHGTGCTSARGTCTGAGAATTTTCATGAGTTTTATGTGCCAAAGT ；下游内引物为
TAAATGATGATGGCGTCTAAGGATTTTRCCTCYGGTACYAGCTGGC ；
TAAATGATGATGGCGTCTAAGGATTTTTAACCTCCGGYACSAGYTGA ；
TCDGAATGAAGATGGCGTCGATTTTTTGRCCTCTGGKACGAGGTT ；
TGTGAATGAAGATGGCGTCGATTTTYYTCTGGGACGAGRCMGGC ；
TGTGAATGAAGATGGCGTCGATTTTGACCTCATTATTACTTTCTGGC ；
TGTGAATGAAGATGGCGTCGATTTTTCffTTKTKRMYCTCTGGKACGA ；
TGTGAATGAAGATGGCGTCGATTTTGYCTCAKTATTRCTYTCTGGC ；
上游外引物为
GGTTTRGARATGTATGTSCCA ；
AAGGGGGSYTTGARATSTAC ；
GAAGGTGGCATGGAYTTTTA ；
AGTGGTGGTCTGGARTTTTA ；
ACffGARYTSAARGARGGTGG ；
GGCATGGTffATCAAAGAAG ；
GAGATYAAGAGTGGTGGTC ；
下游外引物为
CATTGRffATffGGSTCAGCT ；
TGCAAGAGGGTCAGAAG ；
GffGGCAGTGGTTCAGCA ；
TCHAGffGCCATBRYCTCRTT ；
ACSGGYTCAAGAGCCATG ；
AGCCCCMRCCACRGGYTC ；
AGCGCCYGCAACKGGG。环介导等温扩增反应液A每管23uL的组成为
2. 5uL IOX Thermopol 反应缓冲液、1. OuL 1 OmMdNTP、1. OuL 20uM 上游内引物、1. OuL 20uM下游内引物、0. 25uL 20uM上游外引物、0. 25uL 20uM下游外引物、0. 5uL IOOmM硫酸 镁、16.5uL ddH20。用环介导等温扩增方法检测诺沃克类病毒的方法，其特征是依次包括(1)一(3)下 列步骤
(1)病毒RNA的提取
A.取250uL样本，加入1.5mL离心管中；
B.加入500uL的SolutionΑ,剧烈振荡混勻后，室温放置5分钟；
C.加入125uL 的 Solution B 和 125uL 的 DB Buffer，均勻混合后，12，000 rpm 离心 5 分钟；
D.将试剂盒中的Spin Column 安置于 Collection Tube (2mL)上；
Ε.将上述操作步骤3的上清液850uL转移至Spin Column中，12，000 rpm离心2分 钟，弃滤液；
F.将500 uL的Rinse A加入至Spin Column中，12，000 rpm离心1分钟，弃滤液；G.将500uL的Rinse B加入至Spin Column中，12，000 rpm离心1分钟，弃滤液；
H.重复操作步骤7;
I.将SpinColumn安置于新的1. 5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入 30 uL Elution Buffer (含 RNase Inhibitor luL)，室温静置 1 分钟；
J. 12，OOOrpm离心1分钟洗脱病毒RNA ；
(2)RT反应
A.按下述成分配置好20uL的反应液4uL氯化镁、2uL 10XRT缓冲液、6. 5uL Rnase free dH20、2uL dNTP Mixture (各 IOmM)、0· 5uL Rnase Inhibitor (40υ/μ1) ,2uL AMV Reverse Transcriptase (5U/M-l) > IuL Random 9mers (50ρπιο1/μ1)、2uL 样品 RNA ;
B.30°C保温10分钟；
C.42°C左右45分钟；
D.990C加热5分钟；
E.5°C保持5分钟，获得DNA模板；
(3)诺沃克类病毒的环介导等温扩增
A.在装有23uL环介导等温扩增反应液A的反应管中加入IuL待检模板DNA，于恒温金 属浴上95°C放置3 - 5分钟，立即置于冰上1 一 3分钟；
B.在反应管中加入IuLDNA聚合酶B;
C.于恒温金属浴上60- 65°C放置45 - 90分钟；
D.将金属浴调到80- 95°C终止反应，3 — 5分钟后取出待检；
(4)显色检测
在反应管中加入IuL显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，说明 待检样品含有或为诺沃克类病毒。
权利要求
1.一种用环介导等温扩增方法检测诺沃克类病毒的试剂盒及方法，其特征在于该试剂 盒包括环介导等温扩增反应液A 含有 IOX Thermopol 反应缓冲液、300 — 500uM dNTP、2 — 4mM硫酸镁、0. 8—1. 2uM 上游内引物、0.8 — 1. 2uM下游内引物、0. 2-0. 3uM上游外引物、0. 2 — 0. 3uM下游外引物； 其中IOX Thermopol反应缓冲液含有200mM pH8. 8的三羟基甲基氨基甲烷一盐 酸、IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和1 %曲拉通X — 100 ； 其中，上游内引物为GAGATYGCGRTCYCCTGTCCATTTTGVTGGCAGGCCATGTTCCG ； AGATTGCGATCGCCCTCCCATTTTGCCCAGACAAGARSCMATGTT ； CCCAHGTGCTSARGTCTGAGAATTTTTGGATTTTTACGTGCCMAGRCA ； CCCAHGTGCTSARGTCTGAGAATTTTCATGAGTTTTATGTGCCAAAGT ； 下游内引物为TAAATGATGATGGCGTCTAAGGATTTTRCCTCYGGTACYAGCTGGC ；TAAATGATGATGGCGTCTAAGGATTTTTAACCTCCGGYACSAGYTGA ；TCDGAATGAAGATGGCGTCGATTTTTTGRCCTCTGGKACGAGGTT ；TGTGAATGAAGATGGCGTCGATTTTYYTCTGGGACGAGRCMGGC ；TGTGAATGAAGATGGCGTCGATTTTGACCTCATTATTACTTTCTGGC ；TGTGAATGAAGATGGCGTCGATTTTTCffTTKTKRMYCTCTGGKACGA ；TGTGAATGAAGATGGCGTCGATTTTGYCTCAKTATTRCTYTCTGGC ；上游外引物为GGTTTRGARATGTATGTSCCA ；AAGGGGGSYTTGARATSTAC ；GAAGGTGGCATGGAYTTTTA ；AGTGGTGGTCTGGARTTTTA ；ACffGARYTSAARGARGGTGG ；GGCATGGTffATCAAAGAAG ；GAGATYAAGAGTGGTGGTC ；下游外引物为CATTGRffATffGGSTCAGCT ；TGCAAGAGGGTCAGAAG ；GffGGCAGTGGTTCAGCA ；TCHAGffGCCATBRYCTCRTT ；ACSGGYTCAAGAGCCATG ；AGCCCCMRCCACRGGYTC ；AGCGCCYGCAACKGGG。
2.根据权利要求2所述的用环介导等温扩增方法检测诺沃克类病毒的试剂盒，其特征 在于环介导等温扩增反应液A每管23uL的组成为2. 5uL IOX Thermopol 反应缓冲液、1. OuL 1 OmMdNTP、1. OuL 20uM 上游内引物、1. OuL20uM下游内引物、0. 25uL 20uM上游外引物、0. 25uL 20uM下游外引物、0. 5uL IOOmM硫酸 镁、16.5uL ddH20。
3.根据权利要求1所述的用环介导等温扩增方法检测诺沃克类病毒的方法，其特征 是依次包括(1) - (3)下列步骤(1)病毒RNA的提取A.取250uL样本，加入1.5mL离心管中；B.加入500uL的SolutionΑ,剧烈振荡混勻后，室温放置5分钟；C.加入125uL 的 Solution B 和 125uL 的 DB Buffer,均勻混合后，12，000 rpm 离心 5 分钟；D.将试剂盒中的Spin Column 安置于 Collection Tube (2mL)上；Ε.将上述操作步骤3的上清液850uL转移至Spin Column中，12，000 rpm离心2分 钟，弃滤液；F.将500uL的Rinse A加入至Spin Column中，12，000 rpm离心1分钟，弃滤液；G.将500uL的Rinse B加入至Spin Column中，12，000 rpm离心1分钟，弃滤液；H.重复操作步骤7;I.将SpinColumn安置于新的1. 5 ml的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入 30 uL Elution Buffer (含 RNase Inhibitor luL)，室温静置 1 分钟；J. 12，OOOrpm离心1分钟洗脱病毒RNA ；(2)RT反应A.按下述成分配置好20uL的反应液4uL氯化镁、2uL 10XRT缓冲液、6. 5uL Rnase free dH20、2uL dNTP Mixture (各 IOmM)、0· 5uL Rnase Inhibitor (40υ/μ1) ,2uL AMV Reverse Transcriptase (5U/M-l) > IuL Random 9mers (50ρπιο1/μ1)、2uL 样品 RNA ;B.30°C保温10分钟；C.42°C左右45分钟；D.990C加热5分钟；E.5°C保持5分钟获得DNA模板；(3)诺沃克类病毒的环介导等温扩增A.在装有23uL环介导等温扩增反应液A的反应管中加入IuL待检模板DNA，于恒温金 属浴上95°C放置3 - 5分钟，立即置于冰上1 一 3分钟；B.在反应管中加入IuLDNA聚合酶B;C.于恒温金属浴上60- 65°C放置45 - 90分钟；D.将金属浴调到80- 95°C终止反应，3 — 5分钟后取出待检；(4)显色检测在反应管中加入IuL显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜色变为绿色，说明 待检样品含有或为诺沃克类病毒。
全文摘要
本发明涉及一种用环介导等温扩增方法检测诺沃克类病毒的试剂盒及方法。其中的试剂包括环介导等温扩增反应液，含有10XThermopol反应缓冲液、300－500uMdNTP、2－4mM硫酸镁、0.8－1.2uM上游内引物、0.8－1.2uM下游内引物、0.2－0.3uM上游外引物、0.2－0.3uM下游外引物；其中10XThermopol反应缓冲液含有200mMpH8.8的三羟基甲基氨基甲烷一盐酸、l00mM氯化钾、l00mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1％曲拉通X－100。其优点是具有快速、特异性强、灵敏度高且成本低的用环介导等温扩增方法检测诺沃克类病毒。
文档编号C12Q1/70GK102134611SQ201010607570
公开日2011年7月27日 申请日期2010年12月28日 优先权日2010年12月28日
发明者王滔 申请人:王滔