专利名称：一种解淀粉芽胞杆菌wh3及制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及属于免疫学领域，更具体地是涉及一种解淀粉芽胞杆菌WH3菌株，同时还涉及一种解淀粉芽胞杆菌WH3菌株的制备方法，还涉及一种解淀粉芽胞杆菌WH3菌株在制备免疫佐剂中的应用，同时也适用于其它微生物产生的具有类似结构的环肽。
背景技术：
免疫佐剂是指与抗原同时或预先应用，能增强抗原物质免疫原性，增强机体针对抗原的免疫应答能力，或改变免疫反应类型，而本身并无抗原性的物质。佐剂的作用机制极为复杂，目前的研究认为主要有(1)抗原贮存作用，矿物胶体、乳胶类佐剂等可在注射部位形成抗原储池，使抗原免受肝脏清除并延缓其释放速率，以便于疫苗抗原能充分地、高水平地、长时间地与免疫细胞接触作用，进而诱导有意义的免疫应答；(2)抗原提呈作用，佐剂能够保持抗原构象完整并将其提呈给适当的免疫效应细胞， 同时影响抗原提呈细胞(APC)摄取抗原和分泌细胞因子；(3)免疫调节作用，佐剂可以调节细胞因子网络，不同的佐剂诱导APC分泌不同的细胞因子；(4)靶向作用，佐剂通过激发APC 摄取和传递抗原，进而向免疫细胞呈递抗原；( 诱导T细胞免疫应答，指有目的地使用具有抗原或T细胞表位的佐剂类物质，此物质所具有的优先诱导或仅诱导T细胞应答的特性。佐剂的种类丰富，因此分类的方式也很多，没有统一的标准。根据其来源分为微生物来源佐剂、天然药物佐剂、生理性产物佐剂、合成佐剂和营养物质。根据其物理和化学性质，可以把佐剂分为凝胶型佐剂、微粒型佐剂、微生物来源佐剂、乳剂和合成佐剂。根据佐剂作用方式则可分为免疫调节剂、运输型佐剂和靶向型佐剂。按照其性能差别，又可分为免疫刺激型佐剂、颗粒型佐剂、粘膜佐剂和治疗性疫苗佐剂。伴随着生物科学的快速发展，免疫佐剂的应用范围不断扩大，免疫效果也逐渐提高，但它们依然有着各种不可避免的缺点。这些缺陷主要体现为(1)毒副作用突出，如弗氏佐剂、Quil A等；(2)对于抗原的应用范围有限，如铝佐剂；(3)免疫作用机制单一，如铝佐剂不能诱导产生Thl型反应；(4)稳定性不高、制作工艺复杂，如CpG寡核苷酸片段、脂质体等；( 免疫作用机制研究不彻底，如绝大多数的中药佐剂。这些缺点限制了佐剂的广泛应用，也影响着佐剂整体的发展。理想疫苗佐剂需要具有安全、有效、靶向和经济的特点。开发研制新型的免疫佐剂以增强疫苗的免疫效力并减少疫苗的毒副作用将是未来的发展趋势，新型疫苗佐剂是研究其免疫佐剂性与毒性的最佳平衡。它是生物反应调节剂中的免疫调节剂，非特异性免疫刺激作用是发挥其免疫佐剂性，使机体产生保护性免疫应答所必需的基本条件，但如果这种作用过度或过强，则必然呈现毒副作用。因此，如果能寻找一种既具有强佐剂活性，又具有极低非特异性免疫刺激作用的物质，那么对于佐剂研究来说将具有重要意义。
发明内容
为解决现有疫苗佐剂在安全性、稳定性等方面的缺陷，本发明通过大量实验和创造性劳动，目的是在于提供了一种解淀粉芽胞杆菌WH3菌株，该菌株可通过发酵生产一种环肽用于制备免疫佐剂，制备的新型免疫佐剂具有高效性、多能性、良好的安全性、低成本、 性质稳定、使用方便等优点，能激发有效的体液和细胞免疫应答。本发明的另一个目的是在于提供了一种解淀粉芽胞杆菌WH3菌株的制备方法，该菌株是从油菜苗中分离得到具有抗真菌活性的植物内生菌，可产生抗真菌活性的环状多肽表面活性素，命名为赛弗诺(Safenour)。WH3经抗真菌活性检测、形态观察、生理生化试验鉴定和16S rDNA序列分析，鉴定为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefacien)。解淀粉芽孢杆菌是革兰氏阳性芽孢杆菌属，在食品、医药、工农业生产中广泛应用，被认为无毒素和无致病性。WH3菌株产生的含碱性氨基酸精氨酸的Mfenour多肽，具有非常显著的免疫佐剂活性。本发明的再一个目的是在于提供了一种解淀粉芽胞杆菌WH3菌株在制备疫苗佐剂中的应用，通过发酵培养WH3菌株，可产生含精氨酸的环状多肽表面活性素Safenour。 Safenour可用作免疫佐剂，无论是口服还是注射给药途径，Safenour都能激发有效的体液免疫应答和细胞免疫应答。Mfenour用作疫苗佐剂安全性高，口服免疫达到1. 5g/kg体重的剂量，试验动物为无死亡、无中毒、无器官组织病变，具有很高的安全性。Mfenour多肽用作佐剂具有多能性，既能用于口服免疫，也能用于注射免疫；既能激发强烈的体液免疫，又能激发有效的细胞免疫。Mfenour多肽用作佐剂还具有高效性，用作口服佐剂，每只小鼠Mfenour的口服剂量为50-200 μ g，抗原蛋白谷胱甘肽-S-转移酶(GST)剂量为 50-200 μ g ；注射免疫Mfenour为1_20μ g，抗原蛋白GST剂量为2_5 μ g就能激发高效的免疫应答，其中口服免疫在血清中诱导产生的抗GST抗体的效价为12000倍，而注射免疫诱导产生的抗体效价更是高达400000倍。^fenour多肽佐剂激发的免疫反应产生的特异性抗体在小鼠体内可持续存在2个月以上，形成记忆性淋巴细胞，当再次免疫时可迅速激发强烈的免疫应答，产生高滴度的抗体，效价可达400000倍。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施一种解淀粉芽胞杆菌WH3菌株的制备方法，其步骤是1.细菌的分离筛选与鉴定从中国湖北省武汉市湖北农科院油菜田(任一油菜田)中选取3叶期的油菜苗分离具有抗油菜菌核病的细菌。对检测到具有显著抗真菌活性的细菌进行16S rDNA、生理生化和形态鉴定，确定分离得到的WH3菌株是一株解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。2.抗真菌活性物质Mfenour的分离纯化及鉴定对上述获得的解淀粉芽胞杆菌 WH3培养2天后的发酵液用“两步萃取法”(见实施例2、提取抗菌活性物质，将萃取后液体经真空旋转蒸发浓缩，并溶于IOml蒸馏水中。用葡聚糖G-25柱进一步分离纯化，绘制洗脱曲线。利用洗脱曲线各峰值的组分进行抗菌活性检测。在抗真菌活性分析后，对有活性的抗菌物质进行真空冷冻干燥进行浓缩，并经MALDI-T0F质谱分析，得到抗菌物质的结构，发现为一种特殊的环状多肽(表面活性素)，含碱性氨基酸Arg，命名为赛弗诺(Safenour)。实施结果从油菜苗中共分离得到细菌菌株86株，其中命名为WH3的菌株具有显著的抗油菜菌核病的抗性。WH3菌株经形态观察和16S rDNA分析，发现该菌株为革兰氏阳性，菌体杆状，菌体大小1-1. 4 μ mX 2. 3-3. 5 μ m，在PDA平板上能快速扩散，不形成特定的菌落形态，边缘不规则，呈灰白色，粘稠有荚膜，培养4 后表面有小皱褶。在LB平板上形成米白色的菌落，菌落直径3-5mm，表面干燥有皱褶，中间塌陷，边缘波状。37°C生长明显快于。芽胞近端生，鞭毛周生。WH3菌株的接触酶、酪朊水解、厌氧生长、明胶水解、淀粉水解、V-P反应和硝酸盐还原均为阳性；酪氨酸水解、苯丙氨酸脱氨酶、吲哚产生、柠檬酸盐利用均为阴性；可利用D-葡萄糖、D-甘露醇、麦芽糖、蔗糖。结合，上述形态特征及染色结果，判断WH3 为芽孢杆菌属。再结合16S rDNA序列分析(与解淀粉芽胞杆菌的同源性为99. 4%)表明为解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyl0liquefaCienS)WH3，保存于中国典型物保藏中心，保藏地址中国.武汉.武汉大学，保藏日期2011年7月洸日，保藏编号CCTCC NO :M2011266, 分类命名解淀粉芽胞杆菌 WH!3B acillus amyloliquefaciens WH3。WH3产生的抗真菌物质经“两步萃取法”萃取后，再经凝胶柱分离，获得的具有抗真菌活性的物质进一步经MALDI-T0F-MS分析，发现其分子量为1065 Da，为含精氨酸的环状多肽表面活性素，命名为赛弗诺(Mfenour)，结构式如下图。其特征为含有一个碱性氨基酸精氨酸，具有很强的热稳定性，对酸碱环境不敏感，可长期储存。
权利要求
1.一种解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WH3，CCTCC :M201U66。
2.根据权利要求1所述的一种解淀粉芽胞杆菌，其特征在于所述的解淀粉芽胞杆菌所产环状环肽，分子量为1065Da，该环肽结构式如下
3.权利要求1所述的一种解淀粉芽胞杆菌在制备免疫佐剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种解淀粉芽胞杆菌WH3菌株及制备方法和用途，其步骤1.细菌的分离与鉴定从油菜苗中分离得到具有抗油菜菌核病的细菌，经16SrDNA和形态鉴定，确定分离得到的WH3菌株为解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)。2.抗真菌活性物质赛弗诺(Safenour)的分离纯化及鉴定将WH3菌株发酵后萃取抗菌活性物质，再用葡聚糖凝胶柱分离纯化，对有活性的抗菌物质进行MALDI-TOF质谱分析，推断为一环状多肽。3.该菌株在制备疫苗及免疫佐剂中的应用。将Safenour用作佐剂，与蛋白抗原混合后分别经口服和注射途径免疫小鼠，可激活有效的体液和细胞免疫应答，在血清中可检测到高滴度的特异性抗体。Safenour生产成本低，稳定性高，与抗原混合不需乳化，免疫增强效果优于弗氏佐剂及霍乱弧菌毒素B亚单位。
文档编号C12R1/07GK102286408SQ20111022269
公开日2011年12月21日 申请日期2011年8月4日 优先权日2011年8月4日
发明者李菁菁, 祁高富, 苏纪宇, 赵秀云 申请人:武汉光谷世傲生物科技有限公司