专利名称：一种结肠特异表达载体及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种结肠特异表达质粒及其构建方法和应用。
背景技术：
DNA重组(Recombinant DNA)技术是遗传工程的核心技术，也是人类在基因和DNA 分子水平进行操作的技术。重组技术是基因工程的核心，指在体外条件下，将不同生物的基因进行人工“剪切” “组合”和“拼接”，使遗传物质重新构建，然后通过载体如细菌质粒、噬菌体和病毒等转入受体细胞内进行无性繁殖，并使所需要的基因在受体细胞内表达，产生人类所需要的基因或产物，或创建新的生物类型。DNA重组技术涉及核酸分子杂交技术、限制性核酸内切酶等工具酶的应用、基因转移等多项技术应用。从1972年，美国科学家保罗·伯格首次成功地重组了世界上第一批DNA分子以来，一系列转基因家畜、转基因植物以及家喻户晓的克隆羊相继问世，随后1999年又出生了超级鼠，2000年完成了人类基因组计划。国内由暨南大学暨东生物工程研究所用质粒 PJU1005在E.coli中成功表达。主要作用是促进血管新生，促进软组织、软骨组织、骨组织的损伤修复，并具神经营养作用等等。启动子(Promoter)位于结构基因5'端上游区，能指导RNA聚合酶全酶与模版的正确结合，活化RNA聚合酶，并使之具有起始特异性转录的形式，决定转录的方向和效率以及所使用的RNA聚合酶类型，是转录调控的中心。在动物和植物基因工程研究中，为使外源基因在受体中高效表达，必须借助于高活性的启动子。有时为避免基因产物对受体及环境产生副作用，有时是为了获得特定的性状，需使外源基因只在特定的组织或器官中表达。而到现在为止对于特异表达载体的研究的例子也是非常多。在国内，李为民等从金华中棉中克隆了光诱导基因Gacab的启动子(1009 bp )， 转化烟草证明Gacab全长启动子能够驱动gus基因在转基因烟草叶片中的特异表达。黄海群等利用PCR法克隆了水稻日本晴的核酮糖-1、5-二磷酸羧化酶小亚基基因(rbcS ) 5’ 上游调控区，命名为Posrbcs。将Posrbcs与gus基因融合，并通过农杆菌介导转入水稻中花11 (Oryzasativa ssp. japon ica)中。对转基因水稻植株中gus活性进行定性与定量分析，结果表明，Posrbcs启动子可驱动gus基因在转基因水稻植株的叶片、叶、鞘茎杆及颖壳中特异性表达。肖守华等证明PNZIP启动子能驱动小麦抗真菌Y-硫堇蛋白(γ-Thionin) 基因在甜瓜叶片组织中表达。在国外，Calgene的有关组织特异性启动子的专利，控制基因在成熟的水果子房组织中，如草莓，苹果和梨的子房组织表达。文献“结肠特异性基因RELMii的克隆及其真核表达载体构建”(郑丽端，童强松， 吕清，杨秀萍，董继华，世界华人消化杂志，2007年7月28日，15(21):2284-2观9)报道，从小鼠结肠组织中提取总RNA，采用RT-PCR方法扩增RELMii全长cDNA，克隆至T载体后进行核酸序列分析，并将其正向插入到真核表达载体pcDNA3. l/Zeo(+)的限制性内切酶位点Eco^ I ；重组子在阳离子脂质体LipofectamindOOO的介导下瞬时转染小鼠胚胎纤维母细胞WH/3T3、结肠癌细胞系CD6。结果表明RELMii mRNA和蛋白特异表达于小鼠结肠，而其他脏器未见表达。真核表达载体pcDNA3. I-RELM^转染细胞后，细胞内RELM^ mRNA和蛋白水平均显著增高。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种结肠特异表达载体。本发明的另一目的是提供上述表达载体的制备方法。本发明的又一目的是提供上述结肠特异表达载体的应用。本发明通过以下技术方案实现上述目的
一种结肠特异表达载体，是用P-relmi3的核苷酸序列替换真核表达载体pVAXl的启动子PCMV构建而成，所述P-relmi3的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。本发明中所述 Ρ-Γθ πιβ启动子即为P-relmi3的核苷酸序列。上述结肠特异表达载体，具体为pVAXl质粒除去从酶切位点ΙΛ/Ι和之间的序列，总共718bp，将在ΙΛ/Ι和之间的718bp序列片段替换成了 P-relmi3序列(SEQ ID N0:l，982bp)。本发明根据已知relink基因的mRNA序列(GenBank登录号NM_023881)，将其在 NCBI中与小鼠全基因序列进行比对找出它的5’端启动子序列，命名为5’-relmi3 (SEQ ID N0:6)，在5’-relmi3的基础上扩增的P-relmi3序列片段作为启动子，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1。上述结肠特异表达载体的构建方法，步骤如下以小鼠全基因组为模板，以SEQ ID NO: 2^3为上下游引物，扩增Ρ-Γθ πιβ，用ΙΛ/Ι和对真核表达载体pVAXl和P_relm3 分别进行双酶切，酶切后的产物再进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α，筛选阳性克隆， 经过酶切鉴定和测序鉴定都正确的载体即为所述结肠特异表达载体。一种荧光标记的结肠特异表达载体，是以P-relmi3启动子替换PCMV启动子的 PVAXl质粒为出发载体，将绿色荧光蛋白基因Efgp插入到该出发载体中构建而成，即将 Efgp基因插入P-relmi3启动子下游构建而成。上述荧光标记的结肠特异表达载体，具体为pVAXl质粒除去从酶切位点ΙΛ/Ι 和之间的序列，总共718bp，将在ΙΛ/Ι和之间的718bp序列片段替换成了 Ρ-Γθ πιβ序列(SEQ ID N0:l，982bp)。在这个质粒接下来的多克隆位点区插入了 Egfp基因(752bp)，最后得到3988bp的载体序列，即ρ⑶T-GFP。接入的方式不会引起序列倒置，是
合理有效的。上述带有荧光标记的结肠特异表达载体的启动子由982个碱基对组成，对结肠特异性表达的调控作用明显，同时该质粒还具有Egfp (Green Fluorescent Protein)核苷酸序列(由797bp个碱基对组成)，在其下游插入目的基因可以通过荧光检测目的基因的构建是否成功，使检测方法变得容易。Egfp基因编码的蛋白为绿色荧光蛋白(GFP)，由238个氨基酸组成，分子量约27KD。GFP在包括热、极端pH和化学变性剂等苛刻条件下都很稳定，用甲醛固定后在荧光显微镜下，用波长约490 nm的紫外线激发后，即可观察到绿色荧光，直接、简捷、便于检测；无需任何的作用底物或共作用物，检测的灵敏度不受反应效率的影响，保证了极高的检出率；蛋白本身性质稳定；可在多种异源生物中表达且无细胞毒性；其基因片段长度较小，易于构建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持荧光激发活性，为研究其他基因表达产物的分布提供了方便。因此常作为一种报告基因被应用于各种研究领域。本发明所述结肠特异表达载体在制备基因药物中的应用。本发明提供的肠道特异表达载体具有重要的应用价值。应用之一是在生产环境友好型肠道特异分解臭气的转基因猪方面，随着畜牧业的迅猛发展，养猪场的数量急剧增加， 造成的污染问题日益突出，在养猪场，臭气不仅危害工作人员的健康，造成空气污染，而且也会使影响猪的健康生长，造成效益降低。应用肠道特异表达载体能特异的启动分解臭气的目的基因仅在肠道表达，不影响猪的正常功能的同时，减少空气污染。改善猪场的工作环境以及猪的生活环境，环境友好的同时增加收益。本发明提供的表达方法的第二个应用，是用于肠道疾病靶向治疗药物。无论是人类还是动物，患有肠道疾病的概率都是非常高的，应用肠道特异表达载体，给研究肠道疾病靶向治疗药物以及肠道疾病的诊断提供了基础。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
现有技术中已知relmii基因在结肠特异表达，本发明与现有技术的区别在于用的出发载体质粒不同。PVAXl载体是在载体pcDNA3. 1的基础上改建而成的一种新型真核表达载体，大小为3.0 1Λ。该质粒用卡那霉素抗性筛选基因替代pcDNA3.1中的氨卞霉素抗性筛选基因，最大程度的减少抗性筛选基因和人类基因组发生重组的可能性。PVAXl含有多个克隆酶切位点，允许同时克隆多个大片段的目的基因，强启动子PCMV和BGH poly A信号可以在哺乳动物细胞中高水平表达重组蛋白。本研究选择的大小为IOOObp左右的P-relmβ 启动子作为结肠特异表达启动子，能够使目的基因在肠道特异表达，载体制备方法简单实用，应用于转基因药物的制备。
图1. ρ⑶T-GFP质粒的结构示意图； 图2. pVAXl质粒的结构示意图3. Ρ-Γθ πιβ启动子per电泳图，其中1、2、3均为P-relm3，M为marker ； 图4.实施例1 Ρ-ΓΘ πιβ启动子酶切回收产物电泳图，M为marker，1为P_relm3酶切回收产物；
图5. P-relm^连接pVAXl载体后的菌液鉴定图6.实施例2中Egfp基因PCR电泳图，其中M为marker，1、2、3均为Egfp基因； 图7.实施例2中ρ⑶T质粒酶切鉴定图，M为marker，1、2均为酶切产物； 图8. pVAXI-GFP组和pCDT-GFP组在SW480细胞上的表达结果，图中绿色荧光显示有表达；
图9. pVAXI-GFP组和pCDT-GFP组在Vero细胞上的表达结果，图中绿色荧光显示有表
达；
图10.为空白组(未转染任何质粒)和脂质体组(空白脂质体转染细胞)在sw480细胞上的表达；
图11.为空白组(未转染任何质粒)和脂质体组(空白脂质体转染细胞)在vero细胞上的表达；
图12.实施例4小鼠肝脏冰冻切片荧光检测结果，显示没有荧光，a是叠加图，b是荧光蛋白表达检测图，c是肝脏形态图13.实施例4小鼠肌肉冰冻切片荧光检测结果，显示没有荧光，a是叠加图，b是荧光蛋白表达检测图，c是肌肉形态图14.实施例4小鼠结肠冰冻切片荧光检测结果，实验组有绿色荧光显示，a是叠加图，b是荧光蛋白表达检测图，c是结肠形态图，实验组1、2、3分别为同一切片的不同视野； 图15.实施例4小鼠脾冰冻切片荧光检测结果，显示没有荧光，a是叠加图，b是荧光蛋白表达检测图，c是脾形态图16.实施例4小鼠肾冰冻切片荧光检测结果，显示没有荧光，a是叠加图，b是荧光蛋白表达检测图，c是肾形态图17.实施例4小鼠小肠冰冻切片荧光检测结果，显示没有荧光，a是叠加图，b是荧光蛋白表达检测图，c是小肠形态图18.实施例4小鼠心冰冻切片荧光检测结果，显示没有荧光，a是叠加图，b是荧光蛋白表达检测图，c是心形态图。
具体实施例方式以下实施例中除有特殊说明外，均为本领域常规实验试剂、方法和步骤。实施例1重组质粒ρ⑶的构建 1. Ρ-Γθ πιβ 的 PCR 扩增
根据已知relink基因的mRNA序列(GenBank登录号ΝΜ_023881)，将其在NCBI中与小鼠全基因序列进行比对找出它的5’端序列，通过预测启动子的网站预测的启动位置，分别设计引物，引入酶切位点i/Ζ Ι和feoRI，设计针对mRNA序列872_891bp的上游引物F 5 ，-TCTACGCGTTCCACCCCATAATCAGCA-3'，SEQ ID NO:2，针对 1836_1854bp 的下游引物 R :5，-GACTCGAG TTATCTAGATCCG-3，，SEQ ID NO:3 (其中划线部分为酶切位点)。以小鼠总DNA为模板，上述F和R为引物，扩增relmii基因的启动子P-relmii序列片段。PCR反应体系组成如下模板 μ ，10 Xbuffer ΙΟμ , dNTPs 8 μ ，引物F 1 μ ，引物 R μ , Bland Taq 1 μ , ddH20 补至 ΙΟΟμ 。PCR 反应程序94°C预变性 3min，1 个循环； 94°C 40s, 58°C 40s, 72°C lmin，35 个循环；72°C后延伸 lOmin。PCR产物在1 %琼脂糖凝胶电泳检测时可观察到IOOObp左右的特异性条带，见图3。2.重组质粒pCD的构建
将P-relmi3序列的PCR产物用内切酶i/Ζ Ι和进行酶切消化，同时将pVAXl质粒(invitrogen公司)同样用内切酶i/Ζ Ι和进行酶切消化，37°C作用池，两个反应的反应体系如下10 X buffer M 10μ L,#7wl EcoRl 5 μ L，PCR 产物(或 pVAXl 质粒) 30^50 μ L，ddH20补至100 μ L，同时用CIAP (碱性磷酸酶)去磷酸化。在Τ4连接酶的作用下连接消化的P-relmi3序列的PCR产物和酶切处理的pVAXl质粒，4°C连接过夜，反应体系如下10 X连接buffer 1 μ L，PCR酶切回收产物5 7 μ L，pVAXl质粒回收产物1 μ L，T4 DNA 连接酶1 μ L，ddH20补至10 UL0将连接产物转化DH5a感受态细胞，挑取阳性克隆，将阳性克隆用3ml左右的LA培养基在37°C继续培养，然后抽取质粒。用酶切的方法进行酶切鉴定。送鉴定为阳性的重组质粒到奥科生物技术公司进行序列测定。测序正确的重组质粒即为新构建的PCD质粒(含有ZAo I酶切位点)。实施例2含有荧光报告基因的重组质粒构建 1. Egfp绿色荧光蛋白基因的扩增
根据Egfp-C3载体(invitrogen公司)中的Egfp基因设计引物，引入两个酶切位点 &ORI 和损ol，上游引物 F (5’-GAGAATTCCCACCATGGTGAGCA-3’, SEQ ID NO: 4 )和下游引物 R (5’-GACTCGAGTTATCTAGATCCG-3’, SEQ ID NO: 5)，扩增 Egfp 基因片段。PCR 反应体系的组成如下模板 μ ，IOXbuffer 10 μ , dNTPs 8 μ , F 1 μ , R μ , Bland Taq 1 μ , ddH20 补至 100ML。PCR 反应程序94°C预变性 3min，l 个循环；94°C 40s, 60°C 40s, 72°C lmin,35 个循环；72°C后延伸lOmin。PCR产物在1 %琼脂糖凝胶电泳检测时可观察到SOObp左右的特异性条带，见图6。2.构建含Egfp报告基因的载体ρ⑶T-GFP
为了使Egfp绿色荧光报告基因置于肠道特异表达基因的表达调控元件的控制之下。 将Egfp基因的PCR产物用内切酶I和损ο I进行酶切消化，同时将ρ⑶质粒(实施例 1制备)用内切酶I和损ol进行酶切消化，37°C作用3h，反应体系如下10Xbuffer MlO μ Ι,Ι ο I 5 μ L,BcoR I 5 μ L，PCR 产物(或 pCD 质粒)30 50 μ L，ddH20 补至 100 μ L。同时用CIAP去磷酸化。在T4连接酶的作用下，4°C连接过夜，反应体系如下10X连接buffer 1口1^，？0 酶切回收产物5 741^，？^质粒回收产物141^，114 DNA连接酶1 yL，dd H2O补至 10 μ L0将连接产物转化Ε. coli DH5 α感受态细胞，最后取菌液涂布含有100 μ g/mL kana 的LB琼脂培养基上，37°C培养12 16h。平板上挑取5个单菌落接种3 mL含50 μ g/mL kana 的LB培养液中，37 °C振摇培养1池后，取菌液用实施例1中的引物F/R进行PCR检测，同时设立空白对照(反应体系中的模板为1 μ L的ddH20作为空白对照组)和阳性对照(反应体系中的takara公司提供的control DNA为模板，以及相应的引物作为阳性对照组)，反应体系如下10 X PCR buffer 2yL，菌液 1 μ L, dNTPs 2μ L (2. 5mM)，引物 F 0. 5 μ L (20 μ Μ)，弓丨 tl R ο. 5 μ L (20 μ Μ)，Taq 0. 1 μ L (5U/μ L)，ddH20 补至 20 μ L。按常规方法扩增 Egfp 基因，反应条件为94°C预变性3min ；94°C变性40s，60°C退火40s, 72°C延伸Imin。循环35次， 最后72°C延伸IOmin0 PCR产物用1%琼脂糖凝胶(含0.5 μ g/mL溴化乙锭，EB)电泳检测， 在100V的电压下进行电泳，20min后在紫外灯下观察结果。挑取阳性克隆，将阳性克隆用 3ml左右的Kana培养基在37°C 220rpm过夜振荡培养，次日用Ε. Z. N. A. Plasmid Minipi^ps Kit提取质粒，按试剂盒说明书进行操作抽取质粒。用酶切的方法进行酶切鉴定(鉴定结果见图7)。送鉴定为阳性的重组质粒到奥科生物技术公司进行序列测定。测序正确的重组质粒即为新构建的结肠特异表达基因启动子与Egfp报告基因的载体，命名为pCDT-GFP质粒。实施例3将结肠特异表达载体pCDT用脂质体介导感染细胞
将已构建好的载体用Lipofectamine2000转染SW480细胞(人结肠癌细胞)以及Vero细胞，设置阳性对照组(PVAX1-GFP组，为pVAXl质粒与绿色荧光蛋白基因构建的质粒)、空白组(未转染任何质粒)、脂质体组(空白脂质体转染细胞)以及实验组(P⑶T-GFP转染细胞)， 转染结果见图8 11，从图中结果可以看出，pVAXl-GFP组和pCDT-GFP在SW480细胞上均有表达，，pVAXl-GFP组在Vero细胞中有表达，但是pCDT-GFP组在Vero细胞没有表达。空白组和脂质体组在两种细胞均未表达。表明P⑶T-GFP重组载体能够启动蛋白表达，且能在肠道细胞表达，在非肠源细胞，如Vero细胞中不表达。实施例4将结肠特异表达载体ρ⑶T肌肉注射小鼠体内的表达
将实施例2制备的pCDT-GFP质粒以及pVAXl质粒的菌液分别在kana培养板上划线培养，在37°C培养箱中过夜，次日挑取单菌落，用3ml左右的kana培养基在37°C 220rpm过夜振荡培养。之后用装有400ml kana培养基的三角瓶在37°C培养箱中过夜扩大培养。次日用天根生物有限公司的大提质粒试剂盒大量提取质粒。检测质粒的浓度，放_20°C保存。将从暨大试验动物中心买来的4周的昆明小白鼠分为两组，用同一批饲料进行饲养。组别分别是空白组(磷酸缓冲液PBS)和pCDT实验组(脂质体与pCDT质粒的混合液，按体积比2:1混合)。连续注射三天。之后隔三天，在此期间的第三天不予提供饲料，让小鼠空腹一天，到注射后的第四天，杀小鼠，分别取心脏，肝脏，肾脏，脾脏，肌肉，结肠，小肠。装于2ml的离心管中，置于液氮中速冻，15 20分钟之后，用黑色薄膜袋放入-80度保存。第二天送莱德尔公司做冰冻切片免疫荧光。具体方法是将组织做成冰冻切片，之后将冰冻切片丙酮固定10分钟，接着用PBS洗2次，每次5分钟，5分钟后用抗荧光淬灭剂封片。最后显微镜检测荧光并拍照。结果显示只有结肠组织有明显的荧光表达(见图14实验组1、2、 3)，而其他组织如肝脏、肌肉、小肠、肾、脾、心脏组织均无荧光表达。见图12、13、15、16、17、 18。
权利要求
1.一种结肠特异表达载体，其特征在于是用P-relmβ核苷酸序列替换真核表达载体 PVAXl的启动子PCMV构建而成，所述Ρ-Γθ1πιβ的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2.权利要求1所述结肠特异表达载体的构建方法，其特征在于步骤如下以小鼠全基因组为模板，以SEQ ID NO:2^3为上下游引物，扩增P-relmi3序列，用ΙΛ/Ι和对真核表达载体PVAXl和P-relmi3序列分别进行双酶切，酶切后的产物再进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α，筛选阳性克隆，经过酶切鉴定和测序鉴定都正确的载体即为所述结肠特异表达载体。
3.一种荧光标记的结肠特异表达载体，其特征在于是将绿色荧光蛋白基因Efgp插入到权利要求1所述P_relmi3核苷酸序列的下游构建而成。
4.根据权利要求4所述荧光标记的结肠特异表达载体，其特征在于所述绿色荧光蛋白基因Efgp的扩增用引物如SEQ ID NO:4 5所示。
5.权利要求1所述结肠特异表达载体在制备转基因药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述转基因药物为肠道疾病靶向治疗药物。
全文摘要
本发明公开了一种结肠特异表达载体及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明的结肠特异表达载体，是用Relmβ基因启动子(命名为P-relmβ)的核苷酸序列替换真核表达载体pVAX1的启动子PCMV，构建而成的。该表达载体的制备方法是扩增大小约1000bp的P-relmβ序列，用MluI和EcoRI对真核表达载体pVAX1和P-relmβ分别进行双酶切，酶切后的产物再进行连接构建而成。本发明的结肠特异表达载体表达效率高，且制备方法简单，可以广泛应用于转基因药物的制备。
文档编号C12N15/66GK102321654SQ201110254009
公开日2012年1月18日 申请日期2011年8月31日 优先权日2011年8月31日
发明者孙宝丽, 毕英佐, 王静, 谢青梅, 马静云 申请人:华南农业大学