专利名称：Mlkl蛋白及其作为细胞坏死抑制剂靶点的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及MLKL蛋白及其作为细胞坏死抑制剂靶点的应用。
背景技术：
喃乳动物细胞中，receptor-interacting serine-threonine kinase 3 (RIP3)是细胞坏死通路中一个关键性的信号因子。大量数据表明，细胞坏死在许多生理和病理条件中扮演着重要的角色，如组织的发育和损伤，以及机体对抗病毒的免疫反应。细胞死亡对于多细胞动物非常重要。这一领域的重要发现包括细胞死亡是程序性发生并进行的，并且死亡的执行者是细胞中非常精细的生化途径。细胞凋亡通路的激活最终都导致了 caspase-3和caspase-7的激活。这一对执行蛋白酶的激活能够造成细胞形态发生显著变化，这些变化后来被发现是细胞凋亡所特有的。被研究最多最清楚的两条细胞凋亡通路一条起始于线粒体，另一条起始于定位于细胞表面的死亡受体。起始于线粒体的信号通路的激活是由于Bcl-2家族蛋白增加了线粒体外膜的通透性，使线粒体膜间隙细胞毒性蛋白cytochrome c和Smac/Diablo被释放到胞浆中从而导致了细胞凋亡。cytochrome c的释放最终激活凋亡蛋白酶，而Smac/Diablo又能够去除胞浆中凋亡蛋白酶的抑制因子如hhibitor of Apoptotic ftOteins (IAPs)。死亡受体的激活源于它们能够被相应的配体识别。激活的死亡受体引发死亡复合物death-inducing signaling complex (DISC)的形成。在这一复合物中，caspase-3和caspase-7被上游凋亡激酶caspase-8激活。当凋亡蛋白酶被抑制时，哺乳动物细胞的死亡通常不是被完全阻止而是被延迟。 对于内源性细胞凋亡途径来说，凋亡蛋白酶的激活处于线粒体损伤的下游，所以对线粒体的损伤可能最终导致细胞的死亡。不同于这种情况的是死亡受体的激活而引发的细胞死亡。这种形式的细胞凋亡可以被蛋白激酶抑制剂如z-VAD-fmk所抑制。而在某些细胞系中， 凋亡蛋白酶并不能抑制细胞凋亡，反而将凋亡调控到坏死途径。RIP3是决定细胞选择凋亡或坏死的关键性蛋白。表达RIP3的细胞如小鼠纤维细胞，以及一些源于造血系统细胞和上皮细胞，及胃肠道细胞等，能在细胞因子如TNF的刺激下能够产生细胞坏死。RIP3通过RHIM结构域与RIPl的相互作用而被RIPl带到死亡复合物DISC中。RIPl的激酶活性抑制剂necrostatin-Ι能够阻断RIPl与RIP3之间的相互作用。此外，RIPl和RIP3还是蛋白酶caspase-8的底物。同样位于死亡复合物DISC中的蛋白酶caspase-8可以将RIP1/RIP3进行酶切失活，从而终止它们参与引导细胞坏死。正如机体组织遭到病毒感染或者化学抑制剂的施加，异或是RIP3表达水平被大量提高时，蛋白酶caspase-8的抑制作用可以被克服。细胞坏死的重要性已经被近期的一些研究报道所阐释。当caspase-8基因被敲除后，小鼠的发育过程中呈现出许多缺陷，例如心肌和造血系统。但将caspase-8基因敲除的小鼠与RIP3基因敲除的小鼠杂交后，这些原本发育上的缺陷得以拯救。这说明caspase-8 基因敲除小鼠的发育缺陷是由于失去caspase-8抑制的RIP3所介导的细胞坏死作用造成的。在病毒感染过程中，RIP3基因敲除的小鼠表现出更加迅速的病毒感染和复制速度。在一些疾病模型中，如急性胰腺炎和视网膜脱落，RIP3的表达水平有显著性升高。当RIP3的表达被缺失后，这些疾病发生过程中组织的破坏程度将得以显著性降低。这说明RIP3介导的细胞坏死可能会加剧组织损伤而引发的炎症反应。所以对RIP3介导的细胞坏死通路的分子机制的理解，以及细胞坏死通路抑制剂的研究将成为医药产业的急切需求。细胞坏死的重要性已经引起广泛关注。在心脏、心血管以及造血细胞的发育过程中，依赖于MLKL的细胞坏死发挥着重要的作用。当细胞坏死被有效抑制以后，病毒的侵染及复制会变得更加迅速。另外，在急性胰腺炎和视网膜脱落的病发过程中，细胞坏死的关键性蛋白如RIP3的表达水平发生了迅速增加。降低细胞坏死信号通路中关键蛋白如RIP3、 MLKL等地表达水平，或者抑制这些蛋白的活性，能够有效地降低组织因细胞坏死而造成的损伤程度。MLKL参与的细胞坏死可以促进损伤而引发的炎症反应，如果不加以控制会导致损伤的扩大化。因此细胞坏死抑制剂的研发具有急迫的临床需求，和广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供MLKL蛋白及其作为细胞坏死抑制剂靶点的应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)或(C)或(d)或(e)或(f)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)由序列表中序列13所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(c)将序列表的序列13自N末端第357位由苏氨酸突变为丙氨酸得到的蛋白质；(d)将序列表的序列13自N末端第358位由丝氨酸突变为丙氨酸得到的蛋白质；(e)序列表的序列1自N末端第179至471位氨基酸序列组成的蛋白质；(f)将(a)、(b)、(c)、(d)或(f)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与细胞凋亡(坏死)相关的的由序列1衍生的蛋白质。为了以上任一所述蛋白质便于纯化，可在由蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1标签的序列
权利要求
1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)或(c)或(d)或(e)或(f)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)由序列表中序列13所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(c)将序列表的序列13自N末端第357位由苏氨酸突变为丙氨酸得到的蛋白质；(d)将序列表的序列13自N末端第358位由丝氨酸突变为丙氨酸得到的蛋白质；(e)序列表的序列1自N末端第179至471位氨基酸序列组成的蛋白质；(f)将(a)、(b)、(c)、(d)或(f)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且与细胞凋亡相关的的由序列1衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)至7)中任一所述的DNA 分子1)序列表的序列2所示的DNA分子；2)序列表的序列14所示的DNA分子；3)将序列表的序列14自5’末端第1069位核苷酸由a突变为g得到的DNA分子；4)将序列表的序列14自5’末端第1072位核苷酸由t突变为g得到的DNA分子；5)序列表的序列2自5’末端第535至1413位核苷酸所示的DNA分子；6)在严格条件下与1)或2)或3)或4)或5)限定的DNA序列杂交且编码细胞凋亡相关蛋白的DNA分子；7)与1)或2)或3)或4)或5)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码细胞凋亡相关蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.权利要求1所述蛋白在与RIP3蛋白结合中的应用，或，权利要求1所述蛋白在制备与所述RIP3蛋白结合的产品中的应用；所述RIP3蛋白如序列表的序列3所示。
6.权利要求1所述蛋白在参与细胞凋亡中的应用、作权利要求1所述蛋白为抗细胞凋亡药物的靶点的应用、或权利要求1所述蛋白在筛选研发抗细胞凋亡药物中的应用。
7.核酸，为如下任意一种(I )序列表的序列6所示的核酸； (II )序列表的序列7所示的核酸； (III)序列表的序列8所示的核酸； (IV )序列表的序列9所示的核酸； (V )序列表的序列10所示的核酸； (VI)序列表的序列11所示的核酸； (W )序列表的序列12所示的核酸。
8.权利要求1所述蛋白的抑制剂，或，抑制权利要求2或3所述基因表达的抑制剂，在抑制细胞凋亡中的应用。
9.一种抑制细胞凋亡的产品，它的活性成分为权利要求1所述蛋白的抑制剂，或，抑制权利要求2或3所述基因表达的抑制剂。
10.如权利要求8所述的应用或如权利要求9所述的产品，其特征在于所述抑制剂为权利要求5所述核酸或权利要求11所述化合物。
11.式(X )所示化合物；
全文摘要
本发明公开了MLKL蛋白及其作为细胞坏死抑制剂靶点的应用。本发明提供了如下任一蛋白质(a)由序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)由序列13所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(c)将序列13自N末端第357位由苏氨酸突变为丙氨酸得到的蛋白质；(d)将序列13自N末端第358位由丝氨酸突变为丙氨酸得到的蛋白质；(e)序列1自N末端第179至471位氨基酸序列组成的蛋白质。所述蛋白通过与RIP3蛋白结合参与细胞凋亡，从而可以作为抗细胞凋亡药物的靶点，用于筛选研发抗细胞凋亡的药物。本发明还提供了抑制所述基因表达的核酸和抑制所述蛋白的化合物，均可作为抑制细胞凋亡的产品。本发明对于医学研究和药物开发具有重大价值。
文档编号C12N15/63GK102516384SQ201110344239
公开日2012年6月27日 申请日期2011年11月3日 优先权日2011年11月3日
发明者何苏丹, 刘伟龙, 孙丽明, 廖道红, 汪志高, 汪来, 王华翌, 王晓东, 陈涉, 雷晓光 申请人:北京生命科学研究所