专利名称：七个抑制BMPR-1B基因表达合成的shRNA分子的制作方法
技术领域：
本发明涉及能够对骨形成蛋白受体-IB(BMPR-IB)基因产生显著抑制作用的小干扰RNA分子的设计、合成和抑制作用在卵母细胞上的评价方法。
背景技术：
BMPR-IB基因是一种增加排卵率的调控基因，属于TGF-β超家族成员，又称为ALK6 基因；ALK6突变是在Booroola母羊(FecB)中发现的第一个点突变，发生在高度保守的胞内激酶区，核苷酸830处(A830G)，引起精氨酸代替了谷氨酰胺(Q249R)；其显性表现型为卵泡发育提前以及产多胎。文献检索披露(l)Biol. Reprod. 64，1225-1235作者=Wilson, T. 等发表《表现为多胎性状的Booroola羊，在卵母细胞和颗粒细胞表达的ALK6基因的一个突变》文章内容是携带!^cb纯合子的母羊其排卵率升高，伴随着大量囊状卵泡比!^Cb+杂合子的母羊提前成熟并发生排卵；因此，携带!^cb纯合子母羊其排卵前卵泡提前达到了最大直径并维持在一定水平，直到排卵，导致最终卵泡生长动力学发生了变化。OWeproductiveB iologyandEndocrinology2006, 4 20doi 1184/1477-7827-4-20 作者 M6phane Fabre 等发表《在哺乳动物中调节排卵率羊基因模型的作用》文章，内容是BMP15，GDF9, BMPR-IB这三个基因型来理解BMP系统的作用作为卵巢内滤泡生长和成熟的调节最后影响排卵率。(3) Reproduction (2011) 141 643-651作者Wei Wang等发表《RNA分子干扰猪的含有内源性 SMAD4的颗粒细胞导致的FSH介导的颗粒细胞的增值和类固醇合成的减少》文章内容是在猪的颗粒细胞上用RNA干扰的方法敲低了 SMAD4，结果显示了 SMAD4_siRNA抑制了 SMAD4的 mRNA和蛋白的表达并抑制了 FSH引起的猪颗粒细胞的分化和雌二醇的分泌和细胞周期蛋白的表达。关于BMPR-IB基因shRNA分子的研究，ALK6基因干扰的小鼠并没有像Booroola 母羊一样表现出多胎性状，且卵泡发育和排卵率都表现正常，但其软骨形成受到影响，骨骼肌发育存在缺陷，说明ALK6突变存在种属差异，针对其它家畜品种，如绵羊、山羊、猪等， 均未见报道。本发明构思根据绵羊BMPR-IB基因cDNA序列，自行设计合成的shRNA分子，通过功能验证，从设计的shRNA分子库中，筛选到7个对绵羊BMPR-IB基因均有显著抑制作用的 shRNA分子，为绵羊生物学研究拓展了应用领域。
发明内容
本发明的目在于通过对照组细胞BMPR-IB表达水平，从8种shRNA分子中筛选到 7个具有显著抑制效果的shRNA分子，在mRNA水平上抑制效率可达90%以上，而对BMPR-IB 蛋白的抑制可达80%以上。本发明的目的是这样实现的根据GeneBank中绵羊BMPR-IB基因 (ΝΜ_001009431. 1序列)；从启始密码(ATG)至终止密码(TGA)共1515bp编码区序列，用 shRNA设计软件设计干扰BMPR-IB基因转录的shRNA分子群，从设计的34条shRNA分子中，根据结构和位置筛选出8条针对不同位点的shRNA序列进行合成；将合成的两条互补单链的shRNA分子经退火形成双链后，分别连接到pLL3. 7慢病毒干扰载体上，构建了 8个慢病毒干扰RNA质粒(pLL-BMPR-lB-shRNA)，干扰RNA质粒与BMPR-IB表达载体经脂质体转染 293T法产毒，携带BMPR-IB的病毒稳定感染Hek293细胞系，然后携带干扰RNA病毒感染携带BMPR-IB的Hek293细胞系，通过实时定量荧光PCR及^festern blot从mRNA及蛋白水平分析了 BMPR-IB的表达，以及shRNA对BMPR-IB的干扰抑制作用，通过分析和比较实验组与对照组细胞BMPR-IB表达水平，从8个shRNA分子中筛选到7个具有显著抑制效果的shRNA 分子，在mRNA水平上抑制效率可达90%以上，而对BMPR-IB蛋白的抑制可达80%以上，最终确定的7个显著抑制BMPR-IB基因表达的shRNA分子； 其中使用的引物
①LV-BMPR-1B-749
Sense 5’ TGGACAATAGCAAAGCAAATTTCAAGAGAATTTGCTTTGCTATTGTCCTTTTTTC-3' (55 bp) ；Antisense: 5’ TCGAGAAAAAAGGACAATAGCAAAGCAAATTCTCTTGAAATTTGCTTTGCTATTGTCC A-3， (59bp )；
②LV-BMPR-1B-803
Sense 5' TGTAGATGTTTCAAGGTATATTCAAGAGATATACCTTGAAACATCTACTTTTTTC -3’ (55bp)；
Antisense 5' TCGAGAAAAAAGTAGATGTTTCAAGGTATATCTCTTGAATATACCTTGAAACATCTAC A-3， (59bp)；
③LV-BMPR-1B-1306
Sense 5，TGATGAGAGCTTGAACAGAAm^G^TTCTGTTCAAGCTCTCATCTTTTTTC ;_3，(5 5bp) ；Antisense 5’ TCGAGAAAAAAGATGAGAGCTTGAACAGAATTTT/TG^TTCTGTTCAAGCTCTCATC A-3， (59bp)；
@ LV-BMPR-1B-1475
Sense 5' TTGAGAGAGATCGTGTGTATTTCAAGAGAATACACACGATCTCTCTCATTTTTTC -3， (59bp)；
Antisense 5' TCGAGAAAAAATGAGAGAGATCGTGTGTATTCTCTTGAAATACACACGATCTCTCTCA A-3， (59bp)；
(5) LV-BMPR-1B-1685
Sense 5' TGGACAAAGCCAGTAGATATTTCAAGAGAATATCTACTGGCTTTGTCCTTTTTTC -3， (59bp)；
Antisense 5’ TCGAGAAAAAAGGACAAAGCCAGTAGATATTCTCTTGAAATATCTACTGGCTTTGTCCA -3， (59bp)；
LV-BMPR-1B-2567
Sense 5' TGTAAGAAGATGGTGTCAAATTCAAGAGATTTGACACCATCTTCTTACTTTTTTC -3’ (59bp) ；Antisense 5’ TCGAGAAAAAAGTAAGAAGATGGTGTCAAATCTCTTGAATTTGACACCATCTT CTTACA-3， (59bp)；
⑦ LV-BMPR-1B-2745
Sense 5’ TGAGGAAACGTATCAGGTTATTCAAGAGATAACCTGATACGTTTCCTCTTTTTTC-3’ (59bP) ； Antisense: 5’ TCGAGMAMAGAGGAAACGTATCAGGTTATCTCTTGMTMCCTGATACGTTTCCTC A -3， (59bp)；
其中shRNA分子的获取，包括shRNA慢病毒载体的构建即plex-bmpr_lb、 Lv-BMPR-lB-shRNA慢病毒的获取；重组Lentivirus感染Hek293细胞系的获取；shRNA病毒载体感染含BMPR-IB的Hek293细胞系的获取；siRNA抑制效果在Hek293细胞系上的评价等步骤。通过定量分析得出，pSi749能够有效抑制68. 3%的BMPR-IB的转录，pSi803能够有效抑制71. 2%的BMPR-IB的转录，pSil306能够有效抑制99. 86%的BMPR-IB的转录， pSi 1475能够有效抑制99. 78%的BMPR-IB的转录，pSi 1685能够有效抑制96. 42%的BMPR-IB 的转录，pSi2567能够有效抑制94. 37%的BMPR-IBp的转录，Si2745能够有效抑制80. 5%的 BMPR-IB的转录。本发明的实践意义与技术效果多胎性状是绵羊重要的经济性状之一 ；BMPR-IB 基因是小尾寒羊，湖羊等多个绵羊品种的多胎主效基因；本研究应用分子克隆技术，细胞培养技术，Western blot技术，实时定量PCR技术，针对绵羊的BMPR-IB基因序列设计了 8 个shRNA干扰分子，并通过检测BMPR-IB基因的mRNA及蛋白水平分析干扰结果显示，8个 shRNA分子中有7个shRNA分子具有显著抑制效果，在7个干扰分子中，能降低BMPR-IB基因表达水平的68. 3-99. 86% ；本发明为阐明BMPR-IB基因的作用机制，培育多胎绵羊品种提供技术支持，彰显技术进步。
具体实施例方式本发明结合实施例作进一步说明。依据GeneBank 中绵羊 BMPR-IB 基因，即 NM-001009431. 1 序列；设计 34 条 shRNA 分子，针对不同位点的shRNA序列进行合成，将合成的两条互补单链的shRNA分子经退火形成双链后，分别连接到PLL3. 7慢病毒干扰载体上，构建了 8个慢病毒干扰RNA质粒，将 pLL-BMPR-lB-shRNA干扰RNA质粒与BMPR-IB表达载体经脂质体转染法产毒，经荧光 PCR及Wfestern blot的检测，确定7个显著抑制BMPR-IB基因表达的shRNA分子；所用引物(略)；
DshRNA慢病毒载体的构建
各取IOUL IOuM的两条siRNA寡核苷酸(正链和互补链)，加入8 μ L IOXannealing buffer和12 μ L灭菌超纯水，煮沸IOmin后自然冷却至室温，同时pLL3. 7质粒载体经BioI 和HpaI双酶切后回收线性化质粒，与退火产物4°C过夜连接，连接产物转化Dffia感受态细胞，LB平板氨苄青霉素(lOOug/uL)筛选；用载体检测引物及shRNA寡核苷酸引物筛选阳性克隆并送上海生工测序鉴定序列正确后，提取纯化重组质粒用于转染。2) plex-bmpr-lb、Lv-BMPR-lB-shRNA 慢病毒的制备第一日铺板(上午10-11时)
每IOcm面积中铺3X IO6个细胞，保证第二天细胞子完全培养液中汇合度达到 80%-90% ；
第二日Lipectamine2000脂质体转染(下午2-3时) 首先在聚丙烯管内准备脂质体和DNA复合物；加入1. 5ml预热的OPTI-MEMs I培养基后，按比例加入目的载体及病毒包装载体，轻轻混勻，室温放置；其中加入的比例转染载体Iv- bmpr-lb -shRNA 12ug、包装质粒REV 6ug、pMDL 6ug、包膜质粒 VSVG 6ug、转染载体 plex-bmpr-lb 12 ug、包装质粒 Pspax2 9 ug、包膜质粒 PMD2. G 3. 5 ug;
在使用LipictamindOOO之前先轻轻混勻脂质体，而后在另一个聚丙烯管中加入 1. 5mL预热的OPTI-MEMs I培养基，再加入50uLLipictamine2000，轻轻混勻后室温放置；
在室温放置5分钟后，将上述稀释好的DNA与脂质体混合，混合物质于室温孵育 20min,在此期间可以用OPTI-MEMs I培养基洗待转染的细胞一次；
注由于细胞易脱壁，故整个过程中操作须轻缓，可以先将细胞培养板倾斜，将液体沿板壁慢慢加入，在慢慢放正细胞板。然后将脂质和DNA复合物加入细胞，上下倾斜细胞板使液体均勻覆盖在细胞表面，而后，将细胞放回37°C培养箱，培养4h后，换IOmL新鲜的DMEM完全培养基，继续培养 48h后收集病毒，此时的病毒能直接用来转染，或置于-70°C备用。3)重组Lentivirus感染Hek293细胞系的步骤
转染前一天按每孔4X IO5个/mL的密度将Hek293细胞系接种于六孔板，保证转染时汇合度达到60-70%;将滤过的重组0.5 mL Lentivirus和0.5 mL培养液(体积比，1 :1)混合，同时加入IyL聚凝胺(polybrene)(终浓度为10yg/mL)，将病毒加入细胞，然后，把细胞置于32°C培养箱14-1 后移回37°C培养箱孵育，4- 后更换新鲜培养液，37°C培养箱继续培养。感染4 后，将6孔培养皿中的细胞转入IOOmm培养皿中，Ih后加入Puromycin (终浓度为600ng/ mL)选择性培养液；为了获得稳定整合外院基因的细胞，每隔2_3d更换含Puromycin选择性培养液，通常14_21d，即获得稳定转染的细胞。4) shRNA病毒载体感染含BMPR-IB的Hek293细胞系
感染前一天按每孔4 X IO5个/mL的密度将表达BMPR-IB的Hek293细胞接种于六孔板， 用2mL含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养细胞，24h后细胞达到70-80%汇合度时；将 500 μ L的ShRNA干扰病毒与500 μ L含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养细胞(体积比 1:1)混合，同时加入IyL 10 μ g/mL的Polybrene，24h后，更换为含有10%胎牛血清的 DMEM完全培养液，再培养24h后收获细胞，用Trizol法提取总RNA及细胞蛋白裂解液提取蛋白。5) siRNA抑制效果在Hek293细胞系上的评价
上述感染细胞的总RNA经反转录成cDNA后，通过实时定量PCR对BMPR-IB基因表达进行相对定量分析，评价对BMPR-IB基因表达的抑制效果；定量分析方法如下Real time PCR荧光染料SYBR Green I购自TAKARA公司试剂进行Real Time PCR反应体系为2 χ master mix 10 μ L,上下游(10pm)个 0· 8 μ L ;cDNA 2yL。PCR 反应条件为95°C 10s, 58°C 20s, 72°C 20s, 55个循环后进入溶解曲线分析程序40°C -99°C (0. 1°C /s)。通过相对定量分析得出pSi749能够有效抑制68. 3%的BMPR-IB的转录，pSi803能够有效抑制71. 2%的BMPR-IB的转录，pSil306能够有效抑制99. 86%的BMPR-IB的转录，pSil475能够有效抑制99. 78%的BMPR-IB的转录，pSil685能够有效抑制96. 42%的BMPR-IB的转录， pSi2567能够有效抑制94. 37%的BMPR-IBp的转录，Si2745能够有效抑制80. 5%的BMPR-IB 的转录。
本实验自制的细胞蛋白裂解液，由50mM Tris, pH7. 4,150mM NaCl, 1% N P-40, 0. 1% SDS配制，置于容器中，混合均勻使用。本实验选用的Opti-MEM培养液和DMEM培养液，购自美国Gibco公司；BioI和 HpaI双酶切，购自美国TAKARA公司；染载体pLL3. 7由周文来，即美国加州大学圣地亚哥分校医学部，霍华德休斯医学研究所提供；PSpax2 ；VSVG由李文蓉，即美国克罗拉大学提供； plex购自美国Openbiosystem公司；包装质粒pMDL，REV, PMD2. G购自美国biosystem公司。
权利要求
1.七个抑制BMPR-IB基因表达合成的shRNA分子，其特征在于依据GeneBank中绵羊 BMPR-IB基因，即NM-001009431. 1序列；设计；34条shRNA分子，针对不同位点的shRNA序列进行合成，将合成的两条互补单链的shRNA分子经退火形成双链后，分别连接到pLL3. 7慢病毒干扰载体上，构建了 8个慢病毒干扰RNA质粒，将pLL-BMPR-lB-shRNA干扰RNA质粒与BMPR-IB表达载体经脂质体转染法产毒，经荧光PCR及flfestern blot的检测，确定 7个显著抑制BMPR-IB基因表达的shRNA分子； 其中使用的引物①LV-BMPR-1B-749Sense 5’ TGGACAATAGCAAAGCAAATTTCAAGAGAATTTGCTTTGCTATTGTCCTTTTTTC-3' (55 bp) ；Antisense 5’ TCGAGAAAAAAGGACAATAGCAAAGCAAATTCTCTTGAAATTTGCTTTGCTATTGTCC A-3， (59bp )；②LV-BMPR-1B-803Sense 5' TGTAGATGTTTCAAGGTATATTCAAGAGATATACCTTGAAACATCTACTTTTTTC -3’ (55bp)；Antisense 5' TCGAGAAAAAAGTAGATGTTTCAAGGTATATCTCTTGAATATACCTTGAAACATCTAC A-3， (59bp)；③LV-BMPR-1B-1306Sense 5，TGATGAGAGCTTGAACAGAA/Tm^G^TTCTGTTCAAGCTCTCATCTTTTTTC ;_3，(5 5bp) ；Antisense 5’ TCGAGAAAAAAGATGAGAGCTTGAACAGAATTTT/TG^TTCTGTTCAAGCTCTCATC A-3， (59bp)；@ LV-BMPR-1B-1475Sense 5' TTGAGAGAGATCGTGTGTATTTCAAGAGAATACACACGATCTCTCTCATTTTTTC -3， (59bp)；Antisense 5' TCGAGAAAAAATGAGAGAGATCGTGTGTATTCTCTTGAAATACACACGATCTCTCTCA A-3， (59bp)；(5) LV-BMPR-1B-1685Sense 5' TGGACAAAGCCAGTAGATATTTCAAGAGAATATCTACTGGCTTTGTCCTTTTTTC -3， (59bp)；Antisense 5’ TCGAGAAAAAAGGACAAAGCCAGTAGATATTCTCTTGAAATATCTACTGGCTTTGTCCA -3， (59bp)； LV-BMPR-1B-2567Sense 5' TGTAAGAAGATGGTGTCAAATTCAAGAGATTTGACACCATCTTCTTACTTTTTTC -3’ (59bp) ；Antisense 5’ TCGAGAAAAAAGTAAGAAGATGGTGTCAAATCTCTTGAATTTGACACCATCTT CTTACA-3， (59bp)；⑦ LV-BMPR-1B-2745Sense 5’ TGAGGAAACGTATCAGGTTATTCAAGAGATAACCTGATACGTTTCCTCTTTTTTC-3’ (59b ρ) ； Antisense: 5’ TCGAGAAMAAGAGGAMCGTATCAGGTTATCTCTTGAATAACCTGATACGTTTCCTC A -3， (59bp)；其中shRNA分子的获取1) shRNA慢病毒载体的构建各取IOUL IOuM的两条siRNA寡核苷酸，即为正链和互补链；加入8 μ L IOXannealing buffer和12 μ L灭菌超纯水，煮沸10分钟后冷却至室温；同时用pLL3. 7 质粒载体经》ιοΙ和HpaI双酶切后回收质粒，与退火产物4°C过夜连接，连接产物转化Dffia 感受态细胞，即用LB平板氨苄青霉素lOOug/uL ；用载体检测引物及shRNA寡核苷酸引物筛选阳性克隆，并送上海生工所测序鉴定，提取纯化重组质粒用于转染；2 ) plex-bmpr-lb、Lv-BMPR-lB-shRNA 慢病毒的制备铺板，每IOcm面积中铺5 X IO6个细胞；LipectamindOOO脂质体转染，在含有脂质体和DNA复合物的试管中加入1. 5ml预热的OPTI-MEMs I培养基，加入目的载体及病毒包装载体，其载体的加量分别为转染载体Iv- bmpr-lb -shRNA 12ug、REV 6ug、pMDL 6ug、 VSVG 6ug ； plex-bmpr-lbl2 ug,Pspax2 9ug,PMD2. G3. 5 ug，轻轻混勻，室温放置 5 分钟，之后将上述稀释好的DNA与脂质体混合，置于室温孵育20分钟，此时用OPTI-MEMs I培养基清洗液转染细胞一次；将脂质和DNA复合物加入细胞，置于37°C培养箱，培养4-6小时，换 IOmL新鲜的DMEM完全培养基，继续培养48-50小时，收集病毒，此时的病毒直接用于转染或置于-70°C备用；3)重组Lentivirus感染的Hek293细胞系将滤过的重组0. 5 mL Lentivirus和0. 5 mL培养液，以体积比1 :1混合，加入浓度为 10 μ g/mL的聚凝胺1 μ L,将病毒加入细胞，置于32°C培养箱14-1 ，移回37°C培养箱孵育 4_6h，更换新鲜培养液，在37°C培养箱继续培养，感染48-5池，将6孔培养皿中的细胞转入 IOOmrn培养皿中，1-1. 5h加入含有浓度为600ng/ mL的Puromycin的选择性培养液；每隔 2-3天更换选择性培养液，2-3周获得稳定转染的细胞；4)shRNA病毒载体感染含BMPR-IB的Hek293细胞系感染前按每孔4X IO5个/mL的密度将表达BMPR-IB的Hek293细胞接种于六孔板， 用2mL含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养细胞，24-26h备用；将500 μ L的shRNA干扰病毒与500 μ L含有10%胎牛血清的DMEM培养液培养细胞，以体积比1 :1混合，同时加入 IuL 10 μ g/mL的Polybrene，24_30h，更换含有10%胎牛血清的DMEM完全培养液，再培养Μ-2 !收获细胞；用Trizol法提取总RNA及细胞蛋白裂解液提取蛋白；5)siRNA抑制效果在Hek293细胞系上的评价PCR 反应体系2 χ master mix 10 μ L,上下游(10pm)个 0. 8 μ L ；cDNA 2 μ L ；PCR 反应条件95°C 10s, 58°C 20s, 72°C 20s, 55个循环后进入溶解曲线分析程序40°C -99°C，即为0. 1°C /s ；通过定量分析得出PSi749能够有效抑制68. 3%的BMPR-IB的转录，pSi803能够有效抑制71. 2%的BMPR-IB的转录，pSil306能够有效抑制99. 86%的BMPR-IB的转录， pSi 1475能够有效抑制99. 78%的BMPR-IB的转录，pSi 1685能够有效抑制96. 42%的BMPR-IB 的转录，pSi2567能够有效抑制94. 37%的BMPR-IBp的转录，Si2745能够有效抑制80. 5%的 BMPR-IB的转录；其中细胞蛋白裂解液由 50mM Tris，pH7. 4，150mM NaCl, 1% N P-40, 0. 1% SDS配制，混合均勻后使用。
2.根据权利要求1所述合成的shRNA分子，其特征在于0pti-MEM培养液和DMEM培养液，购自美国Gibco公司；BioI和HpaI双酶切，购自美国TAKARA公司；染载体pLL3. 7由周文来，即美国加州大学圣地亚哥分校医学部，霍华德休斯医学研究所提供；Plex购自美国 Openbiosystem 公司；包装质粒 pMDL，REV，PMD2. G 购自美国 biosystem 公司；Pspax2 ； VSVG由李文蓉，即美国克罗拉大学提供。
全文摘要
本发明提供的七个抑制BMPR-1B基因表达合成的shRNA分子，根据GeneBank中绵羊BMPR-1B基因(NM_001009431.1序列)；用shRNA设计软件设计干扰BMPR-1B基因转录的shRNA分子群,从设计的34条shRNA分子中，根据结构和位置筛选出8条针对不同位点的shRNA序列进行合成；将合成的两条互补单链的shRNA分子经退火形成双链后，分别连接到pLL3.7慢病毒干扰载体上,构建了8个慢病毒干扰RNA质粒(pLL-BMPR-1B-shRNA)，将干扰RNA质粒与BMPR-1B表达载体经脂质体转染293T法产毒，经荧光PCR及Westernblot检测表达，获得了7个显著抑制BMPR-1B基因的shRNA分子，在mRNA水平上抑制效率达90%以上，对BMPR-1B蛋白的抑制达80%以上。
文档编号C12N15/113GK102433337SQ20111037252
公开日2012年5月2日 申请日期2011年11月22日 优先权日2011年11月22日
发明者刘晨曦, 林嘉鹏, 汪立芹, 白杰, 金贤华, 黄俊成 申请人:新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国-澳大利亚绵羊育种科学研究中心