专利名称：乙型肝炎病毒突变体、突变扩增试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及乙型肝炎病毒的新突变、突变扩增试剂盒及应用。
背景技术：
目前全球估计有3. 5亿慢性乙肝病毒(HBV)携带者，有三分之一的人口感染过 HBV0在我国，乙型肝炎是最为严重、最广泛的传染病之一，感染率高达60%，约有1. 2亿人携带HBV。乙型肝炎的发病率居传染病首位，死亡数居传染病第三位。
根据临床表现的不同HBV感染可分为多种类型无症状携带状态，急性自限性肝炎，慢性肝炎，暴发型肝炎(fulminant h印atitits，FH)。母婴传播是HBV的重要传播途径，患者通常处于免疫耐受状态的，对HBV不发生应答，但是往往绝大部分无症状携带者会发生肝炎，甚至有一部分最终发展为ra。乙型肝炎重症化的机制一直未明确，目前认为是由宿主免疫和病毒两方面的作用所致。关于HBV变异和重肝的发生仍存在争议，尚没有一个基因变异可以作为重型乙型肝炎的标志性变异。而且大量的研究表明HBV在病人体内时以准种形式存在的，要研究病毒突变与肝炎的关系，必须考虑到HBV的准种特性。目前大多数研究采用的PCR-克隆-测序的方法研究HBV准种。因此，找到与肝炎加重密切相关的基因位点，将会为HBV的临床早期诊断和干预提供帮助。发明内容
本发明的目的在于提供与肝炎加重密切相关的乙肝病毒突变体，突变扩增试剂盒，及应用，为HBV的临床早期诊断和干预提供帮助。
本发明一方面公开了一种乙型肝炎病毒(简称乙肝病毒或HBV)突变体，包括乙肝病毒基因组，所述乙型肝炎病毒突变体的突变发生在乙型肝炎病毒基因组序列第216位和 /或第285位，所述第216位发生的突变为碱基T突变为C (216T — C)，所述第285位发生的突变为碱基G突变为A (285G — A)。
较优的，所述乙型肝炎病毒基因组的核苷酸序列选自SEQ ID NO =USEQ ID NO 10 或 SEQ ID NO :11ο
进一步的，所述乙肝病毒突变体HBV基因组序列的互补序列上，与基因组第216位对应位点的突变为A突变为G，与基因组第285位对应位点的突变为C突变为Τ。
较优的，所述乙型肝炎病毒突变体编码的S蛋白与正常的乙肝病毒S蛋白相比，其氨基酸序列第21位和/或第44位发生突变，第21位氨基酸的突变是由亮氨酸(L)突变为丝氨酸(S)，第44位氨基酸的突变是由甘氨酸(G)突变为谷氨酸(E)。
更优的，所述正常的乙肝病毒S蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO :12。
MENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPTCPGQNSQSPTSNHSPTSCPPIC PGYRWMCLR
RFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLLPGTSTTSTGPCKTCTIPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSffLSLLVPFVQffFVGLSPTVffLSVIWMMWYffGPSLYNILSPFLPLLPIFFCLffVY I(SEQ IDNO 12)本发明第二方面公开了一种扩增乙肝病毒基因组序列第216位和观5位基因片段的HBV突变扩增试剂盒，包括引物、dNTP、PCR缓冲液、DNA聚合酶、ddH20，所述引物包括上游引物和下游引物，所述引物特异性扩增包括乙肝病毒基因组序列第216位和第285位的基因片段。较优的，所述DAN聚合酶为高保真DNA聚合酶；更优的，所述高保真DNA聚合酶为 Prime Star。较优的，PCR缓冲溶液为 5 XPrime Star buffer。较优的，所述上游引物和下游引物序列如下
引物序列
上游弓丨物 5，-ggagcgggagcattcgg-3 ‘(SEQ IDΝ0:8)下游弓丨物 5，_ataaaacgccgcagasacatccagc3，(SEQ IDΝ0:9)
本发明试剂盒PCR体系如下
权利要求
1.一种乙型肝炎病毒突变体，包括乙肝病毒基因组，所述乙型肝炎病毒突变体的突变发生在乙型肝炎病毒基因组序列第216位和/或第285位，所述第216位发生的突变为碱基T突变为C，所述第285位发生的突变为碱基G突变为A。
2.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒突变体，其特征在于，所述乙型肝炎病毒基因组的核苷酸序列选自 SEQ ID NO =USEQ ID NO: 10 或 SEQ ID NO: 11。
3.如权利要求1所述的乙型肝炎病毒突变体，其特征在于，所述乙型肝炎病毒突变体编码的S蛋白与正常的乙肝病毒S蛋白相比，其氨基酸序列第21位和/或第44位发生突变，第21位氨基酸的突变是由亮氨酸突变为丝氨酸，第44位氨基酸的突变是由甘氨酸突变为谷氨酸。
4.如权利要求3所述的乙型肝炎病毒突变体，其特征在于，所述正常的乙肝病毒S蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO 12。
5.一种扩增乙肝病毒基因组序列第216位和观5位基因片段的HBV突变扩增试剂盒， 包括引物、dNTP、PCR缓冲液、DNA聚合酶、ddH20，所述引物包括上游引物和下游引物，其特征在于，所述引物特异性扩增包括乙肝病毒基因组序列第216位和第285位的基因片段。
6.如权利要求5所述的HBV突变扩增试剂盒，其特征在于，所述引物序列为SEQID NO 8 9。
7.如权利要求5所述的HBV突变扩增试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为高保真 DNA聚合酶。
8.如权利要求7所述的HBV突变扩增试剂盒，其特征在于，所述高保真DNA聚合酶为 PrimeStar0
9.如权利要求5所述的HBV突变扩增试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲溶液为 5XPrimeStar buffer。
10.如权利要求5-9任一权利要求所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的扩增程序为预变性 94°C 3min，然后 94°C 30s, 57°C 15s，72°C 2min 45 个循环，72°C延伸 IOmin0
11.权利要求5-10任一权利要求所述的试剂盒的使用方法，步骤如下DDNA模板的制备抽取外周静脉血并提取HBV基因组作为DNA模板；2)PCR扩增通过权利要求5-10任一权利要求所述HBV突变扩增试剂盒，对步骤1)制备的DNA模板经扩增程序进行PCR扩增反应；3)纯化PCR产物。
12.如权利要求11所述的使用方法，其特征在于，所述扩增程序为预变性94°C3min, 然后 94°C 30s, 57°C 15s，72°C 2min 45 个循环，72°C延伸 lOmin。
13.如权利要求1-4任一权利要求所述的乙型肝炎病毒突变体或权利要求5-10任一权利要求所述的HBV突变扩增试剂盒在制备重症乙型肝炎疾病早期诊断及预防试剂中的应用。
14.一种重症乙型肝炎疾病早期诊断及预防的方法，为检测对象血液中是否含有权利要求1-4任一权利要求所述的乙型肝炎病毒突变体。
15.如权利要求14所述重症乙型肝炎疾病早期诊断及预防的方法，所述检测对象血液中是否含有所述乙型肝炎病毒突变体的步骤如下DDNA模板的制备抽取检验对象外周静脉血并提取HBV基因组作为DNA模板；2)PCR扩增将步骤1)制备的DNA模板加入到PCR反应体系中，扩增包括乙肝病毒基因组序列第216位和第285位的基因片段；3)纯化PCR产物；4)PCR产物测序将步骤幻纯化获得的PCR产物通过基因测序技术进行测序；5)结果分析将步骤4)的测序结果与SEQID NO :1、SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 11 的序列进行比对，确认PCR产物对应的乙肝病毒基因组序列第216位和/或285位是否存在突变。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述的PCR反应体系包括引物、 dNTP、PCR缓冲液、DNA聚合酶、ddH20 ；所述引物包括上游引物和下游引物。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述引物序列为SEQID NO :8 9。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述DNA聚合酶为I^rimeStar,所述PCR 缓冲溶液为 5Xft~ime Star buffer
19.如权利要求15所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述PCR反应体系的扩增程序为预变性 94°C 3min，然后 94°C 30s, 57°C 15s，72°C 2min 45 个循环，72°C延伸 IOmin0
20.如权利要求15所述的方法，其特征在于，步骤4)中所述的基因测序技术为sanger 测序技术或solexa测序技术。
21.如权利要求15所述的方法，其特征在于，步骤5)中所述的PCR产物对应的乙肝病毒基因组序列第216位发生的突变为碱基T突变为C，所述的PCR产物对应的乙肝病毒基因组序列第285位发生的突变为碱基G突变为A。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，公开了一种乙型肝炎病毒突变体、突变扩增试剂盒及应用。本发明的HBV突变体在乙型肝炎病毒基因组序列第216位和/或第285位发生突变，所述第216位发生的突变为碱基T突变为C，所述第285位发生的突变为碱基G突变为A。这两个突变与乙型肝炎炎症加重密切相关。本发明还提供了检测前述突变的HBV突变扩增试剂盒、试剂盒的使用方法及应用，从而为重型乙肝的临床早期诊断和干预提供帮助，为深入研究HBV基因突变引起的功能改变提供参考依据。
文档编号C12Q1/68GK102492660SQ20111038473
公开日2012年6月13日 申请日期2011年11月28日 优先权日2011年11月28日
发明者徐航娣, 楼园华, 陈智 申请人:浙江大学