专利名称：一种猪流行性腹泻病毒m基因全序列的扩增方法
技术领域：
本发明涉及猪流行性腹泻病毒技术领域，具体地，涉及ー种猪流行性腹泻病毒M基因全序列的扩增方法。
背景技术：
毛雅元等(2010年)设计了 2对引物，用套式PCR检测在VERO细胞上不同培养代次的猪流行性腹泻病毒的M基因，其扩增的片段仅有412bp，不能扩增不同培养代次的猪流行性腹泻病毒的M基因全部序列(681bp)。
发明内容
为此，本发明提供了 ー种猪流行性腹泻病毒M基因全序列的扩增方法，该方法能 够扩增猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因全长，特别是在ST、VER0细胞上培养的不同代次的PEDV种毒的M基因全长。通过该方法可以捕捉到猪流行性腹泻病毒在细胞培养传代过程中M全基因的序列变化，从而通过M基因的遗传变异分析了解其与PEDV毒力或者免疫效力的相关性。该方法扩增的目的片段长761bp，包含681bp的猪流行性腹泻病毒的M基因。本发明的技术方案如下ー种猪流行性腹泻病毒M基因全序列的扩增方法，包括如下具体步骤I、提取病毒RNA:取原病料即猪的水样粪便，经12000rpm离心5分钟后取上清液或者不同代次病毒的细胞培养液-20°C反复冻融2-3次，然后采用TaKaRa miniBEST viral RNA/DNAextraction kit Ver. 4. 0 (DV819A)提取病毒 RNA;2、RT-PCR 扩增依据GENEBANK公开的猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因序列设计RT-PCR引物，引物序列为PEDVffF:5-TAAGCATTACTTTCGTCC-3PEDVffR:5-AACTGACAGAAGCCATAA-3以步骤I所得的病毒RNA为模板，用上述RT-PCR引物采用TaKaRa PrimeScriptone step RT-PCR Kit Ver. 2 (DRR055A)扩增猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因，目的片段长867bp ；3、套式PCR扩增依据GENEBANK公开的猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因序列设计PCR引物，弓丨物序列为PEDVNF:5-TTACATGCGAATTGACCC-3PEDVNR:5-AGCTGACAGAAGCCATAA-3以RT-PCR 产物为模板，用上述引物采用 TaKaRa Premix Taq Version2. O (D334S)扩增猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因片段；
4、PCR产物的克隆及测序分析(I)用 TransGen Biotech EasyPure PCR Purification Kit (目录号 EP101)对套式PCR产物进行纯化；(2)将纯化的PCR产物连接到pMD18-T Simple Vector上，筛选阳性克隆，将阳性克隆进行测序鉴定。本发明的有益效果为本发明所述猪流行性腹泻病毒M基因全序列的扩增方法，该方法能够扩增猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因全长，特别是在ST、VER0细胞上培养的不同代次的PEDV种毒的M基因全长。通过该方法可以捕捉到猪流行性腹泻病毒在细胞培养传代过程中M全基因的序列变化，从而通过M基因的遗传变异分析了解其与PEDV毒力或者免疫效カ的相关性。该方法扩增的目的片段长761bp，包含681bp的猪流行性腹泻病毒的M基因。
图I、将原病料、病毒在ST、vero细胞上培养的第5代、第10代、第15代毒的RNA分别用外围引物(PEDVWF/PEDVWR)扩增的RT-PCR产物以及其RT-PCR产物再用内部引物(PEDVNF/PEDVNR)扩增的套式PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。其中，M DL2000 ；1 :原病料RNA RT-PCR产物，目的片段为867bp ；2~4 :分别为病毒在ST细胞上培养第5代、第10代、第15代毒的RNA RT-PCR结果；5_7 :分别为病毒在Vero细胞上培养第5代、第10代、第15代毒的RNART-PCR结果；8 :原病料套式PCR产物，目的片段为761bp ；9-11 :分别为病毒在ST细胞上培养第5代、第10代、第15代毒的套式PCR产物，片段为761bp ；12-14 :分别为病毒在VeiO细胞上培养第5代、第10代、第15代毒的套式PCR产物，片段为761bp。说明此方法能扩增出猪流行性腹泻病毒在ST、Vero细胞上培养的F5、F10、F15代毒的M基因全长；
图2-1，2-2为Vero F15M序列用DNAstar软件进行序列比对的結果。
具体实施例方式以下将结合具体实施例对本发明所述猪流行性腹泻病毒M基因全序列的扩增方法进ー步说明。ー种猪流行性腹泻病毒M基因全序列的扩增方法，包括如下具体步骤I、提取病毒RNA:取原病料即猪的水样粪便，经12000rpm离心5分钟后取上清液或者不同代次病毒的细胞培养液-20°C反复冻融2-3次，然后采用TaKaRa miniBEST viral RNA/DNAextraction kit Ver. 4· 0 (DV819A)提取病毒 RNA;用 TaKaRa miniBEST viral RNA/DNAextraction kit Ver. 4. 0 (DV819A)提取病毒 RNA 的方法如下①取200 μ I病料处理液或冻融的细胞培养液放入I. 5ml离心管中，加入200 μ I的Solution A,剧烈振荡混匀后，室温放置5分钟；②加入75 μ I的Solution B,混合均勻后，12000rpm离心5分钟;③将上清转移到新的Collection Tube (2ml,试剂盒中提供)中，加250μ1异丙醇(1%冰こ酸)，上下颠倒混匀；④将试剂盒中的Spin column安置于另一新的Collection Tube (2ml,试剂盒中提供)上，将③中的上清液转移至Spin column中，12000rpm离心I分钟,弃滤液；⑤将500 μ I的Rinse A加入至Spin column中，室温静置I分钟，12000rpm离心I分钟，弃滤液；⑥将800 μ I的Rinse B加入至Spin column中,12000rpm离心I分钟,弃滤液。⑦再次进行12000rpm离心I分钟；⑧将Spin column安置于新的I. 5ml离心管上,在Spin column膜的中央处加入50 μ I的灭菌蒸馏水或者Elution Buffer,室温静置I分钟；⑨12000rpm离心I分钟洗脱病毒RNA;提取的病毒RNA立即用于后续试验或-20°C保存。
2、RT-PCR 扩增依据GENEBANK公开的猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因序列设计RT-PCR引物，引物序列为PEDVffF:5-TAAGCATTACTTTCGTCC-3PEDVffR:5-AACTGACAGAAGCCATAA-3以步骤I所得的病毒RNA为模板，用上述RT-PCR引物采用TaKaRa PrimeScriptone step RT-PCR Kit Ver. 2 (DRR055A)扩增猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因。RT-PCR反应体系为
PrimeScript one step enzyme MixI u!
2 x I step buffer12.5μ1
PEDVWF (IΟμΜ)2μΙ
PEDVWR (IΟμΜ)2ui
RNA样品3μ1
RNase Free d.H204.5μΙRT-PCR反应程序为
50 C30min;
94 C2min;
94 C30s 〕
51-55 tC30s [ 30 cycles
72'Olmirt -
721C7min;
16で保存。用琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR扩增产物，结果如图I所示。
3、套式PCR扩增依据GENEBANK公开的猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因序列设计PCR引物，弓丨物序列为PEDVNF:5-TTACATGCGAATTGACCC-3PEDVNR:5-AGCTGACAGAAGCCATAA-3以RT-PCR 产物为模板，用上述引物采用 TaKaRa Premix Taq Version2. O (D334S)扩增猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因片段。PCR反应体系为
Premix Taq12.5μ1 RT-PCR 产物1.5μΙ PEDVNF (IΟμΜ)2μ
PEDVNR (I ΟμΜ)2μ1
灭菌蒸馏水7μ1PCR反应程序为
权利要求
1. 一种猪流行性腹泻病毒M基因全序列的扩增方法，其特征在于，包括如下具体步骤 1、提取病毒RNA: 取原病料，即猪的水样粪便，经12000rpm离心5分钟后取上清液或者不同代次病毒的细胞培养液，-20 °C反复冻融2-3次，然后采用TaKaRa miniBEST viral RNA/DNAextraction kit Ver. 4. 0 (DV819A)提取病毒 RNA; 2、RT-PCR扩增 依据GENEBANK公开的猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因序列设计RT-PCR引物，引物序列为PEDVffF:5-TAAGCATTACTTTCGTCC-3PEDVffR:5-AACTGACAGAAGCCATAA-3 以步骤I所得的病毒RNA为模板，用上述RT-PCR引物采用TaKaRa PrimeScript onestep RT-PCR Kit Ver. 2 (DRR055A)扩增猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因； 3、套式PCR扩增 依据GENEBANK公开的猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因序列设计PCR引物，引物序列为PEDVNF:5-TTACATGCGAATTGACCC-3PEDVNR:5-AGCTGACAGAAGCCATAA-3 以RT-PCR产物为模板，用上述引物采用TaKaRa Premix Taq Version2. O (D334S)扩增猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因片段； 4、PCR产物的克隆及测序分析 (1)用TransGen Biotech EasyPure PCR Purification Kit (目录号 EP101)对套式PCR产物进行纯化； (2)将纯化的PCR产物连接到pMD18-TSimple Vector载体上，筛选阳性克隆，将阳性克隆进行测序鉴定。
2.如权利要求I所述的猪流行性腹泻病毒M基因全序列的扩增方法，其特征在于，用TaKaRa miniBEST viral RNA/DNA extraction kit Ver. 4· 0 (DV819A)提取病毒 RNA 的方法如下 ①取200μ I病料处理液或冻融的细胞培养液放入I. 5ml离心管中，加入200 μ I的Solution A,剧烈振荡混勻后,室温放置5分钟； ②加入75μ I的Solution B,混合均勻后，12000rpm离心5分钟; ③将上清转移到新的CollectionTube (2ml，试剂盒中提供)中，加250 μ I异丙醇(1%冰乙酸)，上下颠倒混匀； ④将试剂盒中的Spincolumn安置于另一新的Collection Tube (2ml,试剂盒中提供)上，将③中的上清液转移至Spin column中，12000rpm离心I分钟,弃滤液； ⑤将500μ I的Rinse A加入至Spin column中，室温静置I分钟，12000rpm离心I分钟，弃滤液； ⑥将800μ I的Rinse B加入至Spin column中,12000rpm离心I分钟,弃滤液。
⑦再次进行12000rpm离心I分钟； ⑧将Spincolumn安置于新的I. 5ml离心管上,在Spin column膜的中央处加入50 μ I的灭菌蒸馏水或者Elution Buffer,室温静置I分钟； ⑨12000rpm离心I分钟洗脱病毒RNA;提取的病毒RNA立即用于后续试验或_20°C保存。
3.如权利要求I所述的猪流行性腹泻病毒M基因全序列的扩增方法，其特征在于，采用 TransGen Biotech EasyPure PCR Purification Kit (目录号 EP101)进行 PCR 产物纯化的方法如下 ①取50-100μ I的PCR产物，加入5倍体积的溶液ΒΒ，混匀后加入吸附柱中，静置I分钟IOOOOrpm离心I分钟,弃去流出液。
②加入650μ I溶液WB，IOOOOrpm离心I分钟，弃去流出液。
③IOOOOrpm离心1-2分钟，去除残留的WB。
④将吸附柱放于一新的1.5ml离心管中，在柱的中央加入30-50μ IEB或灭菌蒸馏水(65-70°C预热EB或灭菌蒸馏水)。室温静置I分钟，IOOOOrpm离心I分钟，洗脱DNA。洗脱的DNA立即用于后续试验或_20°C保存。
全文摘要
本发明提供了一种猪流行性腹泻病毒M基因全序列的扩增方法，包括如下具体步骤1、提取猪流行性腹泻病毒RNA；2、依据猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因序列设计RT-PCR引物，并扩增猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因；3、依据猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因序列设计套式PCR引物，以RT-PCR产物为模板，扩增M基因全部片段；4、PCR产物的克隆及测序分析将套式PCR产物进行纯化并连接到pMD18-TSimpleVector上，筛选阳性克隆，将阳性克隆进行测序鉴定。该方法能够扩增猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因全长，通过该方法可以捕捉到猪流行性腹泻病毒在细胞培养传代过程中M全基因的序列变化，从而通过M基因的遗传变异分析了解其与PEDV毒力或者免疫效力的相关性。
文档编号C12N15/50GK102851301SQ20121017371
公开日2013年1月2日 申请日期2012年7月6日 优先权日2012年7月6日
发明者何玲, 唐满华, 陈瑞爱, 梁珪益 申请人:广东大华农动物保健品股份有限公司, 肇庆大华农生物药品有限公司