一种八聚核苷酸结合蛋白表达基因的用途及其相关药物的制作方法

一种八聚核苷酸结合蛋白表达基因的用途及其相关药物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及人八聚核苷酸结合蛋白表达基因的用途及其相关药物。本发明公开了人八聚核苷酸结合蛋白表达基因在肿瘤治疗、肿瘤诊断及药物制备中的用途，并且进一步构建了针对人八聚核苷酸结合蛋白表达基因的小分子干扰RNA、基因干扰核酸构建体、基因干扰慢病毒，公开了他们的用途。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人八聚核苷酸结合蛋白的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中八聚核苷酸结合蛋白的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。
【专利说明】—种八聚核苷酸结合蛋白表达基因的用途及其相关药物
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，更具体地涉及人八聚核苷酸结合蛋白表达基因的用途及其相关药物。
【背景技术】
[0002]RNA干扰(RNA interference, RNAi)即用核苷酸组成的短的双链RNA(dsRNA)进行转录后基因沉默。它可高效、特异地阻断体内特定基因的表达，导致其降解，从而引起生物体内特异基因的沉默，使细胞表现出某种基因表型的缺失，是近年来新兴的一种常用的研究基因功能、寻找疾病治疗方法的实验室技术。研究表明，长度为21-23nt的双链RNA能够在转录和转录后水平特异性的引起RNAi (Tuschl T, Zamore PD, Sharp PA, BartelDP.RNA1: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21to 23 nucleotide intervals.Cell 2000; 101:25-33.)?肿瘤患者虽经化疗、放疗和综合治疗，但五年生存率仍很低，如能对肿瘤发病和进展有关的基因进行干预，将能为肿瘤的治疗开辟新途径。近年来，RNAi已成为肿瘤的基因治疗的有效策略。利用RNAi技术可以抑制原癌基因、突变的抑癌基因、细胞周期相关基因、抗凋亡相关基因等的表达来抑制肿瘤进程(Uprichard, Susan LThe therape utic potential of RNA interference.FEBS Letters2005;579:5996-6007.)。
[0003]Nono (non-POU domain containing，octamer-binding)是一种功能复杂的核蛋白(Yaron ST, Dov Z.PSF and p54nrb/Nono mut1-functional nuclear proteins.FEBSLetters.2002;531:109-114.)，它参与细胞核内 RNA 的加工(Zhang Z，Carmichael GG.Thefate of dsRNA in the nucleus: a p54nrb_containing complex mediates the nuclearretention of promiscuously A-to-1edited RNAs.Cell.2001;106(4):465-75.)、基因的转录调控(Mathur M, Tucker PW, Samuels HH.PSF is a novel corepressor thatmediates its effect through Sin3A and the DNA binding domain of nuclear hormonereceptors.Mol Cell Biol.2001; 21 (7): 2298-311.)、DNA 重组配对(Straub T，KnudsenBR，and Boege F.PSF/p54nrb Stimulates “Jumping” of DNA Topoisomerase I betweenSeparate DNA Helices.Biochemistry.2000; 39 (25): 7552-8.)等各种核反应的过程。作为一种核酸结合蛋白，Nono具有DNA/RNA双重结合能力，常以单体或异二聚体的形式与其他核因子结合发挥作用，或者形成DNA/RNA-核因子复合体参与细胞核内发生的各种反应(Yang YSj Hanke JHj Carayannopoulos L,and et al.NonOj a non-POU-domain-containing，octamer—binding protein, is the mammalian homolog of Drosophila nonAdiss.MolCell Biol.1993;13(9):5593 - 5603.) o目前，对Nono生物学功能的研究还不全面，关于Nono在肿瘤发生中的调节作用尚不明确。
[0004]Nono与p54mb具有高度同源性，他们在氨基酸组成上只相差几个氨基酸，并且表达谱范围广，在大多数组织和细胞中都有表达(Yang YSj Hanke JHj CarayannopoulosL, and et al.NonOj a non-POU-domain—containing，octamer-binding protein, is themammalian homolog of Drosophila nonAdiss.Mol Cell Biol.1993;13 (9):5593 -5603.)。已有研究表明，p54mb在人黑色素瘤细胞中表达明显上调，敲除该基因后，可有效抑制黑色素瘤细胞生长活性、增殖能力并阻滞细胞分裂，表明p54mb在肿瘤形成过程中起至Ij一定的作用(Schiffner S，Zimara N，Schmid R, et al.p54mb is a new regulator ofprogression of malignant melanoma.Carcinogenesis.2011; 32 (8):1176-1182.X 在肾乳头状细胞瘤中，PSF和p54mb/N0n0分别与位于X染色体上的TFE3基因发生易位，而染色体易位可能导致原癌基因被激活，与多种肿瘤的发生密切相关(Clark J，Lu YJ, SidharSK, et al.Fusion of splicing factor genes PSF and NonO(p54nrb)to the TFE3 genein papillary renal cell carcinoma.0ncogene.1997; 15 (18): 2233-2239.)。同时在前列腺组织中，也检测到p54mb表达异常上调(Ishiguro H，Uemura H，Fujinami K，et al.55kDaNUCLEAR MATRIX PROTEIN(nmt55)mRNA IS EXPRESSED IN HUMAN PROSTATE CANCER TISSUEAND IS ASSOCIATED WITH THE ANDROGEN RECEPTOR.1nt.J.Cancer.2003;105:26-32.)。以上研究提示P54mb与多种肿瘤的发生发展密切相关，Nono作为p54mb的高度同源蛋白，我们推测其可能也参与了恶性肿瘤的发生和发展。
[0005]为了深入研究N0N0在肿瘤发生中的调节功能，本发明选取胃癌、肺癌和胶质瘤细胞模型，以RNAi为手段研究N0N0在胃癌、肺癌和胶质瘤发生和发展中的作用。

【发明内容】

[0006]本发明的目的在于公开与人八聚核苷酸结合蛋白表达基因相关的治疗方法及药物，以RNA干扰(RNAi)为手段研究八聚核苷酸结合蛋白表达基因在肿瘤细胞的存活和凋亡过程中的作用。
[0007]本发明所述八聚核苷酸结合蛋白表达基因为N0N0(non_P0U domain containing,octamer-binding)基因。
[0008]本发明第一方面，`以RNA干扰为手段，研究了 N0N0基因在肿瘤发生和发展中的作用，公开了一种抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和/或存活的方法，该方法包括:向肿瘤细胞施用一种能够特异性抑制N0N0基因的转录或翻译，或能够特异性抑制八聚核苷酸结合蛋白的表达或活性的分子，以此来抑制肿瘤细胞的生长、增殖、分化和/或存活。
[0009]所述肿瘤细胞选自其生长与八聚核苷酸结合蛋白的表达或活性相关的肿瘤细胞。较优的，所述肿瘤细胞选自胃癌、肺癌和胶质瘤之任一。
[0010]所述抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和/或存活的方法中，所述分子的施用量为足够降低N0N0基因的转录或翻译，或者足够降低N0N0蛋白的表达或活性的剂量。进一步的，所述N0N0基因的表达至少被降低50%、80%、90%、95%或99%。
[0011]所述分子可选自但不限于:核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。
[0012]所述核酸包括但不限于:反义寡核苷酸、双链RNA (dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA CesiRNA)或者短发夹RNA (shRNA)。
[0013]所述双链RNA、核酶、esiRNA或者shRNA含有N0N0基因的启动子序列或N0N0基因的信息序列。
[0014]进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA( siRNA)。所述小干扰RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA 二聚体，并且所述第一链的序列与NONO基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。所述小分子干扰RNA能特异性结合靶序列所编码的mRNA片段，并特异性沉默人NONO基因的表达。
[0015]进一步的，所述小干扰RNA的第一链序列与NONO基因中的靶序列基本相同。较优的，所述NONO基因中的靶序列含有 SEQ ID NO: 1-7中之任一序列。
[0016]所述NONO基因中的靶序列即为所述小分子干扰RNA特异性沉默NONO基因表达时，与所述的小分子干扰RNA互补结合的mRNA片段所对应的NONO基因中的片段。
[0017]较佳的，所述NONO基因来源于人。
[0018]本发明第一方面还公开了一种分离的人NONO基因在制备或筛选肿瘤治疗药物，或者在制备肿瘤诊断药物中的用途。
[0019]进一步的，所述肿瘤选自胃癌、肺癌或胶质瘤。
[0020]所述将分离的NONO基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物包括两方面的内容:其一，将NONO基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物或制剂；其二，将NONO基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂。
[0021]所述将NONO基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物或制剂具体是指:将NONO基因作为RNA干扰作用的靶标，来研制针对肿瘤细胞的药物或制剂，从而能降低肿瘤细胞内NONO基因的表达水平。
[0022]所述将NONO基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂具体是指:将NONO基因作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制或促进人NONO基因表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。如本发明所述的NONO基因小分子干扰RNA (siRNA)即是以人NONO基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制肿瘤细胞增殖作用的药物。除此之外，诸如抗体药物，小分子药物等也可将NONO基因及其蛋白作为作用对象。
[0023]所述将NONO基因用于制备肿瘤诊断药物，是指将NONO基因表达产物作为一项肿瘤诊断指标应用于肿瘤诊断药物的制备。
[0024]所述肿瘤治疗药物为能够特异性抑制NONO基因的转录或翻译，或能够特异性抑制NONO蛋白的表达或活性的分子，从而降低肿瘤细胞中NONO基因的表达水平，达到抑制肿瘤细胞的增殖、生长、分化和/或存活的目的。
[0025]所述通过分离的NONO基因制备或筛选获得的肿瘤治疗药物或者肿瘤诊断药物包括但不限于:核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。
[0026]所述核酸包括但不限于:反义寡核苷酸、双链RNA (dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA (esiRNA)或者短发夹RNA (shRNA)。
[0027]所述肿瘤治疗药物的施用量为足够降低人NONO基因的转录或翻译，或者足够降低人NONO蛋白的表达或活性的剂量。以使人NONO基因的表达至少被降低50%、80%、90%、95% 或 99%。
[0028]采用前述肿瘤治疗药物治疗肿瘤的方法，主要是通过降低人NONO基因的表达水平抑制肿瘤细胞的增殖来达到治疗的目的。具体的，治疗时，将能有效降低人NONO基因表达水平的物质给药于患者。
[0029]本发明第二方面公开了一种降低肿瘤细胞中NONO基因表达的分离的核酸分子，所述核酸分子包含:
[0030]a)双链RNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与NONO基因杂交的核苷酸序列；或者
[0031]b) shRNA，所述shRNA中含有能够在严紧条件下与NONO基因杂交的核苷酸序列。 [0032]进一步的，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA 二聚体，并且所述第一链的序列与NONO基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。较佳的，所述第一链的序列与NONO基因中19-23个连续的核苷酸序列基本相同；更佳的，所述第一链的序列与NONO基因中19、20或者21个连续的核苷酸序列基本相同。
[0033]更进一步的，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA 二聚体，并且所述第一链的序列与NONO基因中的靶序列基本相同。
[0034]进一步的，所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与NONO基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。所述shRNA经加工后可成为小干扰RNA (siRNA)进而起到特异性沉默肿瘤细胞中内源NONO基因表达的作用。
[0035]更一步的，所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与NONO基因中的靶序列基本相同。
[0036]所述双链RNA的第一链或所述shRNA的正义链片段与NONO基因中的靶序列基本相同，所述NONO基因的靶序列即为siRNA用于特异性沉默NONO基因表达时，被所述siRNA识别并沉默的mRNA片段所对应的NONO基因中的片段。
[0037]较佳的，所述NONO基因中的靶序列含有SEQ ID NO: 1-7之任一序列。
[0038]进一步的，所述NONO基因来源于人。
[0039]所述双链RNA第一链和第二链的长度均为15-27个核苷酸；较佳的，长度均为19-23个核苷酸；最佳的，长度均为19、20或者21个核苷酸。
[0040]进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA (siRNA)。更进一步的，所述小干扰RNA第一链的序列如 SEQ ID NO:19 所示，具体为 5’ -GCAGGCGAAGUCUUCAUUCAU-3’。
[0041]SEQ ID NO:19所示的siRNA为以SEQ ID NO:1所示的序列为RNA干扰靶序列设计的、针对人NONO基因的小干扰RNA的一条链，另一条链即第二链的序列与第一链序列互补，该siRNA可以起到特异性沉默肿瘤细胞中内源NONO基因表达的作用。
[0042]进一步的，所述shRNA的茎环结构的序列可选自以下任一:UUCAAGAGA、AUG、CCC,UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU 和 CCACACC。
[0043]更进一步的，所述shRNA的序列如SEQ ID NO: 20所示，具体为:5’ -GCAGGCGAAGUCUUCAUUCAUUUCAAGAGAAUGAAUGAAGACUUCGCCUGC-3，。
[0044]shRNA经酶切加工后可成为siRNA，进而起到特异性沉默肿瘤细胞中内源性人NONO基因表达的作用。
[0045]编码本发明所述shRNA的基因片段的干扰慢病毒载体含有SEQ ID NO: 1-7中之任一序列及其互补序列。[0046]本发明第三方面，公开了一种NONO基因干扰核酸构建体，含有编码本发明所述分离的核酸分子中的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA。
[0047]所述的人NONO基因干扰核酸构建体可以是将编码前述人NONO基因shRNA的基因片段克隆入已知载体获得。进一步的，所述NONO基因干扰核酸构建体为NONO基因干扰慢病毒载体。
[0048]本发明的NONO基因干扰慢病毒载体是将编码前述NONO基因shRNA的DNA片段克隆入已知载体获得，所述已知载体多为慢病毒载体，所述NONO基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染肿瘤细胞，进而转录出本发明所述shRNA，通过酶切加工等步骤，最终获得所述siRNA，用于特异性沉默NONO基因的表达。
[0049]进一步的，所述NONO基因干扰慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码肿瘤细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列；较优的，所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白(GFP)0
[0050]进一步的，所述慢病毒载体可以选自:pLK0.1-puro、pLK0.1-CMV-tGFP、pLK0.1-puro-CMV-tGFP, pLK0.1-CMV-Neo, pLK0.l_Neo、 pLK0.l-Neo-CMV-tGFP、pLK0.1-puro-CMV-TagCFP、pLK0.l-puro-CMV-TagYFP、pLK0.l-puro-CMV-TagRFP、pLK0.l-puro-CMV-TagFP635, pLK0.1-puro-UbC-TurboGFP、pLK0.l-puro-UbC_TagFP635、pLKO-puro-1PTG-lxLacO、pLK0-puro-1PTG_3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BL0CK-1T-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl.2/V5_GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6.2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ 中的任一。
[0051]本发明实施例具体列举了以pGCSIL-GFP为载体构建的人N0N0基因干扰慢病毒载体,命名为 pGCSIL-GFP-N0 N0-siRNA。
[0052]本发明分离的核酸分子可用于制备预防或治疗肿瘤的药物，所述肿瘤为胃癌、肺癌或胶质瘤。
[0053]本发明的N0N0基因siRNA可用于抑制肿瘤细胞的增殖，进一步地可以用作治疗肿瘤的药物或制剂。N0N0基因干扰慢病毒载体则可用于制备所述N0N0基因siRNA。当用作治疗肿瘤的药物或制剂时，是将安全有效量的所述核酸分子施用于哺乳动物。具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0054]本发明第四方面，公开了一种N0N0基因干扰慢病毒，由前述N0N0基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染肿瘤细胞并产生针对N0N0基因的小分子干扰RNA，从而抑制胃癌、肺癌或胶质瘤肿瘤细胞的增殖。该N0N0基因干扰慢病毒可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。
[0055]本发明第五方面，公开了一种用于预防或治疗肿瘤的药物组合物，其有效物质含有前述的分尚的核酸分子，N0N0基因干扰核酸构建体，和/或N0N0基因干扰慢病毒。
[0056]进一步的，所述药物组合物含有I~99被％所述双链RNA、shRNA、N0N0基因干扰核酸构建体或N0N0基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0057]在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括:湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。
[0058]本发明还公开了所述药物组合物在制备治疗胃癌、肺癌和胶质瘤之任一的肿瘤治疗药物中的应用。
[0059]该药物组合物的应用为肿瘤的治疗提供了一种方法，具体为一种预防或治疗对象体内肿瘤的方法，包括将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。
[0060]所述药物组合物用于预防或治疗对象体内肿瘤时，需要将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。采用该方法，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的部分被抑制。
[0061]本发明第六方面，公开了一种用于降低肿瘤细胞中的NONO基因表达的试剂盒，所述试剂盒包括:存在于容器中的所述分离的核酸分子，NONO基因干扰核酸构建体，和/或所述的NONO基因干扰慢病毒。
[0062]综上所述，本发明设计了针对人NONO基因的7个RNAi靶点序列，构建相应的NONORNAi载体，其中编码序列SEQ ID NO:1的RNAi载体pGCSIL-GFP-N0N0_siRNA能够显著下调NONO基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒(lentivirus，简写为Lv)作为基因操作工具携带RNAi载体pGCS I L-GFP-NONO-si RNA能够靶向地将针对NONO基因的RNAi序列高效导入人胃癌SGC7901细胞、肺癌H1299细胞和胶质瘤U87细胞，降低NONO基因的表达水平，显著抑制上述肿瘤细胞的增殖能力。 因此慢病毒介导的NONO基因沉默是恶性肿瘤潜在的临床非手术治疗方式。
[0063]本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人NONO基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中NONO基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。
【专利附图】

【附图说明】
[0064]图1:pGCSIL_GFP 质粒 DNA 图谱
[0065]图2 =NONO-RNAi慢病毒侵染人胃癌SGC7901细胞、肺癌H1299细胞和胶质瘤U87细胞5天后，NONO mRNA的表达水平显著降低
[0066]图3 =NONO-RNAi慢病毒侵染人胃癌SGC7901细胞5天后，引起细胞增殖抑制
[0067]图4 =NONO-RNAi慢病毒侵染人肺癌H1299细胞5天后，引起细胞增殖抑制
[0068]图5 =NONO-RNAi慢病毒侵染人胶质瘤U87细胞5天后，引起细胞增殖抑制
【具体实施方式】
[0069]本发明涉及了一组针对人NONO基因的小分子干扰RNA (siRNA)序列、RNA干扰载体和RNA干扰慢病毒。选取人NONO mRNA编码区序列作为siRNA的靶位点，根据靶位点中连续的10-30 (优选15-27，更优选19-23)个碱基序列设计siRNA靶点序列。通过基因克隆，构建表达上述siRNA的核酸构建体，包装表达上述siRNA的慢病毒。细胞实验证明，上述siRNA序列能够特异性沉默人肿瘤细胞中内源NONO基因的表达。
[0070]发明人发现，采用RNAi方法下调人NONO基因的表达后可有效地抑制肿瘤细胞的增殖，这一研究成果表明NONO基因是原癌基因，可作为肿瘤治疗的靶点。发明人进一步合成和测试了多种针对NONO基因的siRNA，筛选出了可有效抑制NONO的表达进而抑制人胃癌SGC7901细胞、肺癌H1299细胞和胶质瘤U87细胞增殖和生长的siRNA，在此基础上完成了本发明。
[0071]本发明提供了一系列干扰人NONO基因的小干扰RNA (siRNA)序列，构建了可特异性沉默NONO基因表达的慢病毒。本发明研究发现，针对人NONO基因设计的小干扰RNA及RNAi慢病毒，稳定并特异地下调NONO基因的表达，并有效地抑制人肿瘤细胞的增殖。本发明表明NONO基因可促进肿瘤细胞生长，有望成为肿瘤早期诊断和治疗的靶点。而且，通过RNAi方式沉默NONO基因的表达，可作为抑制肿瘤发展的有效手段。
[0072]本发明的设计思路为:
[0073]本发明通过如下方法来筛选获得一种人NONO基因RNAi慢病毒:从Genbank中调取人NONO基因序列；预测siRNA位点；合成针对NONO基因的有效的siRNA序列，两端含酶切位点粘端的双链DNA Oligo ;慢病毒载体双酶切后与双链DNA Oligo连接，构建表达NONO基因siRNA序列的RNAi质粒；将RNAi质粒和慢病毒包装需要的辅助载体(Packing Mix,Sigma-aldrich公司)共转染人胚肾细胞293T，产生重组慢病毒颗粒，即可制得高效沉默NONO基因的慢病毒。
[0074]基于上述方法，本发明提供了 7个干扰NONO基因的有效靶点(具体如SEQ IDNO: 1-7所示)，构建了特异干扰人NONO基因的慢病毒。
[0075]同时本发明还公开一种人NONO基因RNAi慢病毒(NONO-RNAi)及其制备与应用。
[0076]本研究发现，利用慢病毒介导的RNAi方法，在降低NONO基因在肿瘤细胞中的表达后，可以有效抑制肿瘤细胞的`增殖。本研究表明，NONO基因是一个原癌基因，可促进肿瘤细胞增殖，在肿瘤发生和发展中具有重要的生物学功能，NONO基因可以为肿瘤治疗的靶标，慢病毒介导的NONO基因特异性沉默可作为肿瘤治疗的一种新手段。
[0077]下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件，如[美]Sambrook.J等著；黄培堂等译。分子克隆试验指南，第三版。北京:科学出版社2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
[0078]实施例1针对人NONO基因RNAi慢病毒的制备
[0079]1.筛选针对人NONO基因的有效的siRNA靶点
[0080]从Genbank调取ΝΟΝΟ (NM_007363)基因信息；利用上海吉凯基因化学技术有限公司的设计软件Genechem设计针对NONO基因的有效的siRNA靶点。在NONO基因的编码序列(CDS)区域内，每隔一个碱基起始获得21个碱基的序列，表1列出了其中7条针对NONO基因的有效siRNA靶点序列。
[0081]表1靶向于人NONO基因的siRNA靶点序列
[0082]
SEQ ID NO TargetSeq起始位点
"IGCAGGCGAAGTCTTCATTCAT 469
【权利要求】
1.一种分离的人NONO基因在制备或筛选肿瘤治疗药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肿瘤选自胃癌、肺癌或胶质瘤。
3.一种降低肿瘤细胞中NONO基因表达的分离的核酸分子，所述核酸分子包含: a)双链RNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与NONO基因杂交的核苷酸序列；或者 b)shRNA，所述shRNA中含有能够在严紧条件下与NONO基因杂交的核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA 二聚体，并且所述第一链的序列与NONO基因中的靶序列基本相同；所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与NONO基因中的靶序列基本相同。
5.如权利要求3或4所述分离的核酸分子，其特征在于，所述NONO基因的靶序列含有SEQ ID NO: 1-7 中任一序列。
6.如权利要求3或4所述分离的核酸分子，其特征在于，所述双链RNA为小干扰RNA，该小干扰RNA第一链的序列如SEQ ID NO:19所示。
7.如权利要求3或4所述分离的核酸分子，其特征在于，所述shRNA的序列如SEQIDNO:20所示。
8.—种NONO基因干扰核酸构建体，含有编码权利要求3-7任一权利要求所述分离的核酸分子中的shRNA的基因片段`，能表达所述shRNA。
9.如权利要求8所述NONO基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述NONO基因干扰核酸构建体为干扰慢病毒载体。
10.如权利要求9所述NONO基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述干扰慢病毒载体由将编码所述shRNA的基因片段克隆入慢病毒载体后获得，所述慢病毒载体选自:pLK0.1-pur。、pLK0.1-CMV-tGFP、pLK0.l-puro-CMV-tGFP、pLK0.1-CMV-Neo,pLK0.l-Neo、pLK0.l-Neo-CMV-tGFP、pLK0.l-puro-CMV-TagCFP、pLK0.l-puro-CMV-TagYFP、pLK0.1-puro-CMV-TagRFP, pLK0.l-puro-CMV_TagFP635、pLK0.1-puro-UbC-TurboGFP,pLK0.l-puro-UbC-TagFP635> pLKO-puro-1PTG-lxLacO、pLK0-puro-1PTG-3xLac0> pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BL0CK-1T_DEST、pLenti6-GW/U6_laminshrna、pcDNAl.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5_DEST、pGCSIL-GFP 或pLenti6.2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ 中的任一。
11.一种N0N0基因干扰慢病毒，由权利要求9-10任一权利要求所述干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。
12.一种用于预防或治疗肿瘤的药物组合物，其有效物质含有权利要求3-7任一权利要求所述的分离的核酸分子，权利要求8-10任一权利要求所述N0N0基因干扰核酸构建体，和/或权利要求11所述的N0N0基因干扰慢病毒。
13.权利要求12所述药物组合物在制备治疗胃癌、肺癌或胶质瘤的肿瘤治疗药物中的应用。
14.一种用于降低肿瘤细胞中N0N0基因表达的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:存在于容器中的，权利要求3-7任一权利要求所述的分离的核酸分子，权利要求8-10任一权利要求所述NONO基因干扰核酸构建体，和/或权利要求11所述的NONO基因干扰慢病毒。
【文档编号】C12N15/113GK103667430SQ201210349845
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月18日 优先权日:2012年9月18日
【发明者】朱向莹, 孙琴, 高博, 杨敏, 金杨晟, 瞿红花, 曹跃琼 申请人:上海吉凯基因化学技术有限公司