专利名称：一种抗鹌鹑IgG单克隆抗体及其在制备鹌鹑血清中抗体检测试剂盒中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种以抗鹌鹑IgG单克隆抗体为介导的间接ELISA快速检测鹌鹑血清中抗体的试剂盒，并涉及一种使用该种试剂盒快速检测鹌鹑血清中抗体的方法。
背景技术：
鹌鹑，作为一种经济禽类，其肉和蛋中含有丰富的蛋白质，具有较高的营养价值和药用价值，在我国更有“动物人参”的美誉，从20世纪80年代开始，经过几十年的发展，鹌鹑的养殖规模已经仅次于鸡。随着养殖业的发展，其各种疾病也开始呈现上升趋势，包括新城疫，病毒性腹泻，大肠杆菌等，这给鹌鹑养殖业带来了巨大的经济损失，因而是否能够做到早期诊断和控制鹌鹑疾病显得尤为重要。IgG在血清免疫球蛋白总量中占了 70%-80%，是浓度最高的，在抗体介导的反应中起着主要作用，血清中特异性IgG水平的测定已是临·床免疫检测和体液免疫研究的常用指标，研制出抗鹌鹑IgG的单克隆抗体，建立鹌鹑血清中不同抗体的间接ELISA法对鹌鹑疾病的诊断，免疫监测，流行病学调查等可以提供一个特异的、可靠的检测方法，该方法所需成本较低廉，而且简便，快捷，适合在临床上应用。
发明内容
本发明提供了一种抗鹌鹑IgG单克隆抗体，以及利用该单克隆抗体制备的间接ELISA检测试剂盒。本发明所述的抗鹌鹑IgG单克隆抗体，命名为QIgG_5Fll，它是由抗鹌鹑IgG单克隆抗体杂交瘤细胞株QIgG-5Fll分泌的。所述抗鹌鹑IgG单克隆抗体杂交瘤细胞株QIgG-5Fll 的保藏号是CGMCC No. 6655 。本发明还公开了抗鹌鹑IgG单克隆抗体QIgG_5Fll在制备用于检测鹌鹑血清中抗体的试剂盒中的应用。一种检测鹌鹑血清中抗体的间接ELISA检测试剂盒，包括以下成分
(1)包被了不同抗原的ELISA包被板，在板上包被易于感染鹌鹑的各种不同病原；
(2)辣根过氧化物酶(HRP)标记抗的鹌鹑IgG单克隆抗体QIgG-5Fll；
(3)洗涤液0.01mol/L磷酸盐缓冲液；
(4)显色试剂TMB粉剂，3%H202，底物缓冲液。( 5 )阴性对照未免疫鹌鹑阴性血清
(6)阳性对照阳性血清
使用上述间接ELISA检测试剂盒检测鹌鹑血清中抗体的方法，其步骤包括
(I)待检血清作为第一抗体与酶标板上包被的抗原进行反应
将待检血清用O. 01mol/L磷酸盐缓冲液1:00稀释，在酶标板的每个孔中加入ΙΟΟμ ，于37°C恒温水浴箱中放置60min ;同时加阴性对照、阳性对照；(2)洗涤
用PBST洗3次，每次3min，甩干；
(3)加辣根过氧化物酶标记的抗鹌鹑IgG单克隆抗体为二抗
将标记的二抗QIgG_5FllE，稀释到最佳工作浓度，在酶标板的每个孔中加入ΙΟΟμ ，于37 °C恒温水浴箱中放置60min ；
(4)洗涤
用PBST洗5次，每次3min，甩干；
(5)显色加入新鲜配制的TMB底物，IOOPL/孔，37°C反应15_20min ；
(6)终止
显色后，每孔加入50 μ L 2mol/L H2SO4终止反应
(7)结果判定
酶标仪读值，测定各孔0D450nm值,进行结果判定。运用本发明的检测试剂盒可检测鹌鹑血清中的针对包被病原的特异性抗体，本发明可在临床上检测鹌鹑群体是否感染过某些疾病以及对疫苗免疫效果进行评估。本发明试剂盒具有成本低，操作简单，适合大规模推广应用。
具体实施例方式实施例I、抗鹌鹑IgG单克隆抗体的制备及标记 I.抗鹤 I IgG单克隆抗体的制备及鉴定
1.I单克隆抗体的制备
采用饱和硫酸铵盐析法纯化鹌鹑血清，用此纯化后的IgG作为免疫原腹腔注射免疫6-8周龄Balb/c小鼠，共三次，每次间隔10天，剂量均为255 μ g/只，融合前加强免疫，382 μ g/只。加强免疫后72-96 h按常规方法进行细胞融合。采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的单克隆化。用纯化鹌鹑IgG包被酶标板，采用间接ELISA法检测杂交瘤细胞培养上清，用ICR小鼠血清作为阴性对照，融合小鼠的血清为阳性对照。筛选到能稳定分泌抗鹌鹑IgG的单克隆抗体的杂交瘤细胞后收集细胞上清保存备用，并取10周龄BALB/c小鼠制备腹水，_20°C保存备用，共得到四株单克隆抗体，分别命名为QIgG-3D4，QIgG_5Fll，QIgG_5G2，QIgG-5G6。杂交瘤细胞株QIgG-5Fll于2012年10月11日，送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所；分类命名为抗鹌鹑IgG单克隆抗体杂交瘤细胞株；保藏编号为CGMCCNo. 6655 ο1.2单克隆抗体的鉴定
用间接ELISA法检测建株的单克隆抗体的上清及腹水效价,并用Western-blotting法检测单抗与鹌鹑IgG的反应性，结果显示单克隆抗体有较好的反应特异性；亚类鉴定结果表明 QIgG-3D4 与 QIgG-5G6 为 IgM，而 QIgG_5Fll 和 QIgG_5G2 为 IgGl。2. HRP标记抗鹌鹑单克隆抗体
2.I单克隆抗体腹水的制备和纯化常规方法制备QIgG-5Fll腹水。利用GE公司的Protein G预装柱进行IgG纯化。收集后利用SDS-PAGE鉴定纯化效果，于_70°C保存备用。2. 2酶标单克隆抗体的制备
利用加强型活化过氧化物酶及标记试剂盒对单抗QIgG-5Fll进行HRP酶标记。具体标记步骤如下
1)将干粉剂PBS溶于500μ 超纯水中；
2)将Img纯化的IgG加入O.5-lml的PBS中；
3)将纯化的单抗样品直接加入冻干活化的辣根过氧化物酶中；
4)在通风橱中，立即向反应体系中加入IOPL的氰基硼氢化钠，室温作用Ih； 5)在反应体系中加入20μ 的淬灭缓冲液(3Μ的氨基乙醇，pH为9)，室温作用15min；
6)用ProteinG柱将标记抗体进行纯化。7)QIgG-5Fll经过HRP过氧化物酶标记后，标记为QIgG_5FllE，活性鉴定结果显示它的工作浓度最高可达1:2000。8)将标记抗体冻入_70°C保存备用。实施例2、按下列方法制作间接ELISA检测试剂盒
1.包被用抗原包被酶标板，每孔10(^L，4°C作用10-14h；
2.封闭用PBST稀释的5%脱脂乳满孔封闭，37°C作用2h;
3.封闭完用PBST洗涤2遍，每次3min，甩干；
4.一抗将待检鹌鹑血清用O. 01mol/L磷酸盐缓冲液1:100稀释，在酶标板的每个孔中加入100μ ，于37°C恒温水浴箱中放置60min ;同时加阴性对照、阳性对照；
5.二抗用PBST洗3次,每次3min,甩干,加辣根过氧化物酶标记的抗鹤鹁IgG单克隆抗体为二抗，将标记的二抗QIgG_5FlIe稀释到最佳工作浓度，在酶标板的每个孔中加入100μ ,于37°C恒温水浴箱中放置60min ；
6.洗涤用PBST洗5次，每次3min，甩干；
7.显色加入新鲜配制的TMB底物，IOOPL/孔，37°C反应15_20min；
8.终止显色后，每孔加入50μ L 2mol/L H2SO4终止反应
9.结果判定酶标仪读值，测定各孔0D450nm值,进行结果判定。实施例3、鹌鹑血清中IBV抗体检测间接ELISA方法的建立
(1)包被抗原=IBV抗原用pH为9.6的碳酸盐包被缓冲液稀释后每孔10(^L，4°C作用10-14h ；
(2)封闭用PBST稀释的5%脱脂乳满孔封闭，37°C作用2h;
(3)封闭完用PBST洗涤2遍，每次3min，甩干；
(4)一抗将待检血清用0.01mol/L磷酸盐缓冲液1:100稀释，在酶标板的每个孔中加入100μ ，于37°C恒温水浴箱中放置60min ;同时加阴性对照、阳性对照；
(5)二抗用PBST洗3次,每次3min,甩干,加辣根过氧化物酶标记的抗鹤鹁IgG单克隆抗体为二抗，将标记的二抗QIgG_5FllE稀释到最佳工作浓度，在酶标板的每个孔中加入100μ ,于37°C恒温水浴箱中放置60min ；
(6)洗涤用PBST洗5次，每次3min，甩干；
(7)显色加入新鲜配制的TMB底物，ΙΟΟμ ν孔，37°C反应15_20min；(8)终止显色后,每孔加入50μ L 2mol/L H2SO4终止反应
(9)结果判定酶标仪读值，测定各孔0D450nm值，结果判定(检测孔的读值-阴性孔平均读值)/ (阳性孔平均读值-阴性孔平均读值)兰O. 21的孔判为阳性，否则判为阴性。实施例4、鹌鹑血清中NDV抗体检测间接ELISA方法的建立 (1)包被抗原=NDV抗原用pH为9.6的碳酸盐包被缓冲液稀释后每孔10(^L，4°C作用10-14h ；
(2)封闭用PBST稀释的5%脱脂乳满孔封闭，37°C作用2h;
(3)封闭完用PBST洗涤2遍，每次3min，甩干；
(4)一抗将待检血清用O.01mol/L磷酸盐缓冲液1:100稀释，在酶标板的每个孔中加入ΙΟΟμ ，于37°C恒温水浴箱中放置60min ;同时加阴性对照、阳性对照；
(5)二抗用PBST洗3次,每次3min,甩干,加辣根过氧化物酶标记的抗鹤鹁IgG单克隆抗体为二抗，将标记的二抗QIgG_5FllE稀释到最佳工作浓度，在酶标板的每个孔中加入ΙΟΟμ ,于37°C恒温水浴箱中放置60min ；
(6)洗涤用PBST洗5次，每次3min，甩干；
(7)显色加入新鲜配制的TMB底物，ΙΟΟμ ν孔，37°C反应15_20min；
(8)终止显色后,每孔加入50μ L 2mol/L H2SO4终止反应
(9)结果判定酶标仪读值，测定各孔0D450nm值，结果判定(检测孔的读值-阴性孔平均读值)/ (阳性孔平均读值-阴性孔平均读值)兰0. 21的孔判为阳性，否则判为阴性。
权利要求
1.一种抗鹌鹑1gG单克隆抗体杂交瘤细胞株QIgG-5Fll分泌得到，所述抗鹌鹑IgG单克隆抗体杂交瘤细胞株QIgG_5Fll的保藏编号是CGMCC No. 6655。
2.一种检测鹌鹑血清中抗体的间接ELISA检测试剂盒，包括以下成分 (1)包被了不同抗原的ELISA包被板； (2)辣根过氧化物酶标记的抗鹤鹁IgG单克隆抗体； (3)洗涤液0.01mol/L磷酸盐缓冲液； (4)显色试剂TMB粉剂，3%H202，底物缓冲液； (5)阴性对照未免疫鹌鹑阴性血清 (6)阳性对照阳性血清。
3.根据权利要求I所述的一种间接ELISA检测试剂盒检测鹌鹑血清中抗体的方法，其步骤包括 (1)待检血清作为第一抗体与酶标板上包被的抗原进行反应将待检血清用O. 01mol/L磷酸盐缓冲液1:00稀释，在酶标板的每个孔中加入ΙΟΟμ ，于37°C恒温水浴箱中放置60min ;同时加阴性对照、阳性对照； (2)洗涤 用PBST洗3次，每次3min，甩干； (3)加辣根过氧化物酶标记的抗鹌鹑IgG单克隆抗体为二抗 将标记的二抗QIgG_5FllE，稀释到最佳工作浓度，在酶标板的每个孔中加入ΙΟΟμ ，于.37 °C恒温水浴箱中放置60min ； (4)洗涤 用PBST洗5次，每次3min，甩干； (5)显色 加入新鲜配制的TMB底物，IOOPL/孔，37°C反应15_20min ； (6)终止 显色后，每孔加入50 μ L 2mol/L H2SO4终止反应； (7)结果判定 酶标仪读值，测定各孔0D450nm值,进行结果判定。
全文摘要
本发明涉及一种以抗鹌鹑IgG单克隆抗体以及由其制备的试剂盒及检测方法。所述抗鹌鹑IgG单克隆抗体由杂交瘤细胞株CGMCC No.6655分泌。所述试剂盒包括包被了不同抗原的酶标板，辣根过氧化物酶(HRP)标记抗鹌鹑IgG单克隆抗体，洗涤液，显色试剂。通过将待检血清样品与包被于酶标板上的抗原发生反应，用特异性的辣根过氧化物酶标记的抗鹌鹑IgG单克隆抗体作为二抗进行反应，最后加入底物进行显色反应，从而检出血清中是否产生针对不同包被抗原的抗体，进而判断检测鹌鹑群体是否感染过某些疾病以及对疫苗免疫效果进行评估。此方法简便，快速，可以检测鹌鹑血清中多种抗体，成本低廉，适合广泛推广应用。
文档编号C12R1/91GK102875682SQ20121038635
公开日2013年1月16日 申请日期2012年10月12日 优先权日2012年10月12日
发明者金文杰, 罗燕, 秦爱建, 于恩琪, 张勇攀, 张笛, 杨振, 钱文正, 邵红霞, 钱琨, 单玉平 申请人:扬州大学