专利名称：一种编码木糖异构酶的基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体是一种编码木糖异构酶的基因以及由该编码木糖异构酶的基因编码的蛋白质在以木糖为原料直接生产木酮糖的应用或以葡萄糖为原料直接生产果糖的应用。
背景技术：
木糖异构酶(xyloseisomerase,XI) (EC5. 3. I. 5)又称为葡萄糖异构酶(glucoseisomerase, GI),是一种具有重要应用价值的工业用酶。它能将木糖异构化为木酮糖,在利用木质纤维素微生物发酵生产乙醇的过程中起着关键作用；也能转化葡萄糖形成果糖，是工业上用于生产高果糖衆(high fructose corn syrup, HFCS)或果葡糖衆或异构糖楽■的重要的酶制剂(Jensen, V. J. and Rugh, S. 1987. Industrial scale application ofimmobilized glucose isomerase. Methods Enzymol. 136，356-370.)。 木糖异构酶，是戊糖磷酸途径的关键酶。半纤维素在木质组织中占总量的50%，而木糖异构酶能够将木糖转化为木酮糖，是将木聚糖转化为乙醇途径中不可缺少的酶。根据有关数据，利用木质纤维素生产乙醇将会降低现有技术生产乙醇所花成本的将近20%(Dawid Brat, Eckhard Boles, and Beate Wiedemann, 2009,Functional Expressionof a Bacterial Xylose Isomerase in Saccharomyces cerevisiae, Appl. Environ.Microbiol. 75⑶2304-2311.)。因此，研发木糖异构酶用于工业生产酒精是开发生物能源又一研究途径(Barbel Hahn- HilgerdaI, Kaisa Karhumaaj Marie Jeppssonjetal. 2007.Metabolic Engineering for Pentose Utilization in Saccharomycescerevisiae, Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 108，147-177·)。木糖异构酶也可应用于葡萄糖异构化为果糖的食品产业中。世界上食糖(包括甘蔗糖、甜菜糖、高果糖浆)供不应求，消耗量大于生产量，并且国际市场上糖价上涨。另外，高果糖浆被广泛用作饮料、果冻、糖果、冰激凌和调味食品的甜味剂，亦可代替蜂蜜用于制药工业，或用于化工上生产甘露醇等，与蔗糖相比，价格稍低，甜度相当，因此高果糖浆的市场需求在不断增加，自然的，研究葡萄糖异构酶是具有重要意义的。最早在1957年嗜水假单孢菌中发现GI活性，后来发现有近百种细菌和放线菌产GI，且多是产胞内酶，极少数菌株产胞外酶(朱国萍，程阳，宫春红等，2000.葡萄糖异构酶的生物工程研究进展，生物化学与生物物理进展，27 (2) :127-130. )。70年代我国开始研究葡萄糖异构酶，出现了大肠杆菌的葡萄糖异构酶基因在链霉菌中克隆和表达，还出现了酵母工程菌(易国辉，尹慧祥，张爱联，2011，用P. pastoris的pAOXl表达系统表达木糖异构酶，生物技术，21 (1):17-19.)和大肠杆菌工程菌(丁莉，许伟，严明等，2006，Thermus thermophilus HB8葡萄糖异构酶在大肠杆菌中表达，生物加工过程，4 (2) :42-45.)，但目前研究较多的是将大肠杆菌中含有的葡萄糖异构酶基因在异源的酵母或链霉菌中表达，少数研究还致力于从海洋藻类中提取木糖异构酶基因产乙醇(Yoshiaki Umemoto, Toshiyuki Shibata, Toshiyoshi Araki.2012, D-Xylose Isomerasefrom a Marine Bacterium,Vibrio sp. Strain XY-214, and D-Xylulose Productionfromβ -I, 3-Xylan. Mar Biotechnol. 14:10 - 20)，还有的研究是在大肠杆菌中构建重组菌并表达有活性酶，并研究其酶学性质，并进行适当的基因突变，以构建适合高果糖浆生产的突变体。研究葡萄糖异构酶或木糖异构酶的生物学性质发现，该酶热稳定性高，一般都在60°C以上甚至达到90°C，这个特性与其紧密的空间结构和特异的活性保守序列有关；其底物除了葡萄糖和木糖外，还有D-核糖、L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-阿洛糖和脱氧葡萄糖；各种二价金属离子还对其酶活有促进或抑制作用。很多研究都致力于基因突变达到改良其生物学特性，以期获得有学术和商业价值的结果。以木糖异构酶为关键词查找国家知识产权局专利检索数据库，共出现33项发明专利，涉及木糖异构酶基因及其应用的有10项，其中有3项分别是关于鸟苷二磷酸木糖异构酶、粳稻的木糖异构酶和大麦的木糖异构酶的基因及其应用，2项是关于木糖异构酶突变体及其应用，有5项是关于不同来源的木糖异构酶基因及其应用一一分别来自拟南芥、牛瘤胃液宏基因组文库、人胎脑总RNA、纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum) 157-2、梭菌 (Clostridium)和梭杆菌(Fusobacterium)属细菌或者玻璃海鞘(Ciona)属的被囊动物(tunicate);其它的专利是关于含有木糖异构酶的各种菌株及木糖异构酶在不用领域中的应用。以葡萄糖异构酶为关键词查找国家知识产权局专利检索数据库，共出现42项发明专利，只有I项是关于温葡萄糖异构酶基因及其应用；12项发明专利是描述利用基因工程的方法构建葡萄糖异构酶突变体，并描述了它们的特性和应用；其它发明专利是描述固定化的葡萄糖异构酶的应用和葡萄糖异构酶的在生产酒精、高果糖浆、甘露醇等方面中的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种编码木糖异构酶的基因，并将由该编码木糖异构酶的基因所编码的蛋白质用于以木糖为原料生产木酮糖或以葡萄糖为原料生产果糖，从而实现拓宽木糖异构酶基因的来源及其应用。本发明实现上述目的所采取的技术方案是一种编码木糖异构酶的基因Pgi，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. I中所示。本发明所述的编码木糖异构酶的基因Pgi，是从实验室筛选的克氏类芽孢杆菌中分离得到。木糖异构酶基因序列的保守区、碱基序列的外源DNA是由768个碱基组成，含有完整的木糖异构酶基因Pgi的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)，Pgi基因的起始密码为ATG，终止密码子为TAA。一种由所述的编码木糖异构酶的基因Pgi所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQID NO. 2 所示。本发明所述的由基因Pgi所编码的蛋白质，是基因Pgi编码的木糖异构酶产物Pgi，由255个氨基酸组成，和Pgi催化功能域同源性最高的为多粘类芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa E681 的 sugar phosphate isomerase/epimerase 的催化功倉泛域Ce-值为 9e-lll)，两者的相似性=159/255 (62%)，相同性=203/255 (80%)。
本发明还涉及含有本发明所述的编码木糖异构酶的基因Pgi的表达载体，及利用该表达载体转化得到的宿主细胞。本发明所述的由基因Pgi所编码的蛋白质用于以木糖为原料生产木酮糖或以葡萄糖为原料生产果糖。本发明从克氏类芽孢杆菌中分离得到编码木糖异构酶的基因Pgi，能够拓宽木糖异构酶基因的来源及其应用，更好地服务于木酮糖或果糖的工业生产。
图I是木糖异构酶Pgi纯化物的SDS-PAGE图。从图I 了解到，木糖异构酶Pgi纯化物的分子量为29kDa。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的技术方案做进一步描述在本发明的实施例中所用到的材料包括大肠杆菌(Escherichia coli)株系XLl-Blue、载体pMD19-T (购自大连TaKaRa公司)；表达载体pQE30、大肠杆菌株系M15 (购自Novagen公司)；限制性内切酶、修饰酶等试剂。(I) Paenibacillus cookii GX-4 基因组文库的构建P. cookii GX-4的基因组DNA是按照BioFlux公司的细菌基因组DNA提取试剂盒Biospin Bacteria Genomic DNA Extraction Kit (目录号 BSC12S1)的使用说明来提取的。P. cookii GX_4的基因组文库构建是按照Epicentre公司的文库制备试剂盒CopyControI Fosmid Library Production Kit (目录号 CCF0S110)的使用说明书来进行的。构建好的P. cookii GX-4的基因组文库涂布到在含氯霉素(12. 5 μ g/mL)的LA平板(LA培养基[每IOOml含蛋白胨lg，酵母粉0. 5g，NaCl :0. 5g，琼脂粉1. 5g)上。结果共获得约4231个转化子。(2)木糖异构酶基因Pgi序列的测定随机从含氯霉素(12. 5μ g/mL)的LA平板上挑取一个转化子接种到LB液体培养基(培养基[每IOOml含蛋白胨lg，酵母粉0. 5g，NaCl :0. 5g，)中，37°C震荡培养12小时。提取该转化子的质粒DNA，用限制性内切酶BamHI酶切后，将获得的DNA片段与经BamHI酶切的去磷酸化的PUC19质粒进行连接。再将连接产物转化到大肠杆菌XLl-blue中(转化方法为CaCl2法)，在含氨苄青霉素(100 μ g/mL)的LA平板上筛选亚克隆转化子。结果共获得约312个亚克隆转化子。进一步提取其中6个亚克隆转化子的质粒DNA，用限制性内切酶BamHI完全酶切后，进行O. 9%琼脂糖凝胶电泳分析，结果这6个亚克隆转化子都能酶切下一个2.7kb的载体片段外，其中一个亚克隆子还能给出一条大小为9. 4kb的DNA片段。于是，对这个亚克隆子进行测序，并命名为D3-9。D3-9送交华大基因公司测定DNA核苷酸序列。(3)木糖异构酶基因Pgi的核苷酸序列分析用NCBI (National Center for Biotechnology Information,)上的软件如 ORFfinder、Blast对DNA序列进行分析。基因Pgi的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)由768个核苷酸组成，序列如SEQ ID NO: I。其中，Pgi基因的起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。(4)木糖异构酶基因Pgi编码的产物Pgi的氨基酸序列分析木糖异构酶基因Pgi编码一个含255个氨基酸的蛋白质，用DNAStar软件预测该蛋白质的理论分子量大小为29028. 74道尔顿。用简单组件结构研究工具(SimpleModular Architecture ResearchTool, SMART, http://smart, embl-heidelberg. de)分析木糖异构酶 Pgi 的组件结构，结果是自N端的第23 — 204位为木糖异构酶(AP_endonuc_2)功能域。(5)木糖异构酶基因Pgi的克隆和表达使用上游引物5’ -CGTGGATCCTTGAAGCTGGGCTTGCAACTTTATAC-3’ 和下游引物 5’ -GTGAAGCTTGACATGAACAGGTCCTCCATTTTTTG-3，，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增木糖异构酶基因Pgi，用限制性内切酶BamH I和Hind III酶切木糖异构酶基因Pgi后，与经BamH I和 Hind III酶切的表达载体PQE30进行连接。再将连接产物转化到大肠杆菌XLl-blue中(转化方法为CaCl2法)，涂布到含氨节青霉素(100 μ g/mL)的LA平板上,将平板置于37°C恒温箱培养14小时。然后进一步提取平板上的克隆子的质粒DNA，并将其命名为pQE-Pgi，用限制性内切酶BamH I和Hind III酶切pQE-Pgi后，进行O. 9%琼脂糖凝胶电泳分析，结果PQE-Pgi除有一个3. 4kb的载体DNA片段外，还有一条大小约为768bp的外源DNA片段。将含有质粒pQE-Pgi重组大肠杆菌M15菌株接种到600mL含氨苄青霉素(100 μ g/mL)的LB培养基中，37°C振荡培养，待0D600为O. 4时，加入IPTG使其终浓度为O. 5mmol/L,20°C诱导20小时。IlOOOrpm离心3min,收集菌体，用4mL pH7. 0100mmol/L的憐酸缓冲液重悬菌体，超声波破胞9分钟。12000rpm离心20min，取上清进行后面的蛋白质纯化。按每4mL上清液加入lmL50%的镍亲和层析胶体，在4°C用200转摇60分钟，把混合物灌注到柱子，收集流出物。力口 ImL 冲洗缓冲液(50mmol/LNaH2P04，300mmol/LNaCl，20mmol/L 咪唑，PH8.0)到柱子里，缓慢搅拌，收集流出物。重复冲洗步骤4次。加入洗脱缓冲液(50mmol/LNaH2P04，300mmol/LNaCl，250mmol/L咪唑，pH8. 0)洗脱蛋白质。收集洗脱的蛋白质溶液，用变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)验证，发现有目的大小的蛋白质条带。(6)木糖异构酶Pgi的活性测定Pgi以木糖为底物转化成木酮糖的酶活力测定采用半胱氨酸-咔唑法取3μ I纯化的木糖异构酶Pgi酶液、50 μ IlOmM MgCl2溶液、50 μ 10. lmol/L D-木糖溶液(溶于PH7. O、IOOmM的磷酸缓冲液中)混合，在80°C作用15分钟后，沸水浴终止反应。取100 μ I酶反应液立即加入6mL13mol/L的H2S04、200 μ 11. 5%半胱氨酸盐酸盐和200 μ 10. 12%咔唑酒精溶液(用无水乙醇溶解咔唑，放置棕色瓶中24小时后使用)混匀，25°C反应30分钟。用分光光度计测吸光度OD54tl。吸光度测定值与不同含量的木酮糖吸光度标准曲线图作比较计算酶活。在标准反应混合物中，木糖异构酶的酶活力单位(U)定义为每分钟催化产生I μ moL木酮糖所需的酶量。Pgi转化木糖生成木酮糖的酶活力达到最高为21. 789U/mg。Pgi以葡萄糖为底物生成果糖的酶活力测定取3μ I纯化的木糖异构酶Pgi酶液、50 μ 13mol/L葡萄糖溶液、400 μ IlOOmM ρΗ7. O邻苯二甲酸氢钾-咪唑缓冲液(含5mm/LMg2+, lmm/L Co2+)混合，在80°C作用15分钟后，用500 μ 150%三氯乙酸中止反应。取100 μ I反应液立即加入6mL13mol/L的H2S04、200 μ 11. 5%半胱氨酸盐酸盐和200 μ 10. 12%咔唑酒精溶液(用无水乙醇溶解咔唑，放置棕色瓶中24小时后使用)混匀，25°C反应30分钟。用分光光度计测吸光度OD54tl。吸光度测定值与不同含量的果糖吸光度标准曲线图作比较计算酶活。 在上述反应混合物中，木糖异构酶的酶活力单位(U)定义为每分钟催化产生I μ moL果糖所需的酶量。Pgi转化葡萄糖生成果糖的酶活力达到最高为1356U/mg。
权利要求
1.一种编码木糖异构酶的基因Pgi，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. I中所示。
2.一种由权利要求I所述的基因Pgi所编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。
3.—种表达载体,其特征在于,含有权利要求I所述的基因Pgi。
4.一种宿主细胞，其特征在于，含有权利要求3所述的表达载体转化的原核细胞或真核细胞。
5.权利要求2所述的蛋白质在以木糖为原料生产木酮糖的应用或以葡萄糖为原料生产果糖的应用。
全文摘要
一种编码木糖异构酶的基因Pgi，属于基因工程技术领域。该基因含有SEQ ID NO.1的核苷酸序列，该基因编码的蛋白质含有SEQ ID NO.2的氨基酸序列，该蛋白质用于以木糖为原料生产木酮糖或以葡萄糖为原料生产果糖。本发明能够拓宽木糖异构酶基因的来源及其应用，更好地服务于木酮糖或果糖的工业生产。
文档编号C12P19/24GK102888420SQ20121038737
公开日2013年1月23日 申请日期2012年10月12日 优先权日2012年10月12日
发明者杜丽琴, 黄日波, 黄金群, 韦宇拓, 闭海, 王子龙 申请人:广西大学