一种增强核型多角体病毒生物防治棉铃虫效果的方法
【专利摘要】本发明属于生物防治棉铃虫【技术领域】，具体涉及一种增强核型多角体病毒生物防治棉铃虫效果的方法。该方法通过饲喂棉铃虫C型凝集素dsRNA（Ha-lectin1dsRNA）可以增强核型多角体病毒防治棉铃虫效果。按每只棉铃虫3ug棉铃虫C型凝集dsRNA和50PIB核型多角体病毒的用量，可以显著增强核型多角体病毒防治棉铃虫效果。本发明所提供的方法，杀虫起效快，可使棉铃虫核型多角体病毒（HaNPV）导致的棉铃虫死亡时间缩短1/3；杀虫效率高，可使前3天致死率增加35%；用量少，可大大降低核型多角体病毒的使用量，与现有单纯使用核型多角体病毒防治棉铃虫相比，具有较为显著的改进。
【专利说明】一种增强核型多角体病毒生物防治棉铃虫效果的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物防治棉铃虫【技术领域】，具体涉及一种增强核型多角体病毒生物防治棉铃虫效果的方法。
【背景技术】
[0002]棉铃虫是一种世界范围内的杂食性害虫，不仅危害棉花，还危害玉米、小麦等多种作物及番茄、辣椒等蔬菜。近年来，随着转基因棉花品种的培育，对于控制棉铃虫害发挥了巨大的作用，但是随着BT转基因棉的长期和大量种植，田间棉铃虫已开始产生抗性，因而棉铃虫的防治形势仍然非常紧迫。
[0003]核型多角体病毒((nuclear polyhedrosis viruses ,NPV)是一类具有很强专一性宿主的病毒，因其安全性高、持效期长、对环境友好，因此是最早一类被批准用于生物防治的病毒杀虫剂类农药。棉铃虫核型多角体病毒(/feyicorerpa armigera NPV, HaNPV)专一性寄生于棉铃虫，但因其杀虫效果较为缓慢，显效期较长，与农民所要求的“药到虫死”有较大差距，严重阻碍其推广使用。
【发明内容】
[0004]本发明目的在于提供一种可以缩短NPV生物防治棉铃虫显效时间，减少NPV使用量，增强NPV生物防治棉铃虫效果的方法。
[0005]本发明所采用的技术方案如下。
[0006]一种增强核型多`角体病毒生物防治棉铃虫效果的方法，在对棉铃虫施用核型多角体病毒时，施用棉铃虫C型凝集素dsRNA (Ha-lectinl dsRNA)可以增强核型多角体病毒防治棉铃虫效果。
[0007]所述增强核型多角体病毒生物防治棉铃虫效果的方法，棉铃虫C型凝集素dsRNA(Ha-lectinl dsRNA),按以下步骤制得:
Cl)以棉铃虫血细胞cDNA为模板，利用LectinIFl (RNA干扰正向引物1)，5’ -GGATCCTAATACGACTCACTATAGGTACAAGTTCCACAGAGTAC-3’ 和 Lectin IRl (RNA 干扰反向引物 1)，5，-TTCTTCATCAGCCGTAGG-3’ 以及 Lectin IF2 (RNA 干扰正向引物 2)，5’ -TACAAGTTCCACAGAGTAC-3’ 和 LectinIR2 (RNA 干扰反向引物 2)，5’ -GGATCCTAATACGACTCACTATAGGTTCTTCATCAGCCGTAGG-3，分别进行两个独立PCR反应，得到两端带有T7 RNA聚合酶启动子(序列中黑体部分即为启动子)的基因片段；
(2)将步骤(1)所获得的两端带有T7RNA聚合酶启动子的基因片段纯化；
(3)将步骤(2)所得纯化产物用T7RNA聚合酶体外转录单链RNA，混合等体积的互补RNA退火合成dsRNA ；
(4)将步骤(3)所得产物经单链RNase和DNase37°C孵育去除单链RNA和DNA模板，乙酸钠纯化后用琼脂糖凝胶电泳检测dsRNA的完整性。
[0008]所述增强核型多角体病毒生物防治棉铃虫效果的方法，按每只棉铃虫3ug棉铃虫C型凝集dsRNA和50 PIB核型多角体病毒的用量，防治效果最佳。以每平方米有4X IO4只棉铃虫计算，需喷洒120mg dsRNA和2X106 PIB病毒，此浓度下可以显著增强核型多角体病毒防治棉铃虫效果。
[0009]本发明所提供的增强核型多角体病毒防治棉铃虫效果的方法，与现有单纯使用核型多角体病毒防治棉铃虫相比，杀虫起效快，可使棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)导致的棉铃虫死亡时间缩短1/3 ;提高杀虫效率，可使前3天致死率增加35% ;增强棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)对棉铃虫的敏感性，仅为正常使用量的1/100左右，大大降低核型多角体病毒的使用滴度，降低棉铃虫可能对病毒产生抗性的风险，从而减少喷施次数，节省体力，大大减少棉铃虫对作物的危害，提高作物产量。
【专利附图】
【附图说明】
[0010]图1为Ha-lectinl dsRNA完整性检测，其中a为体外合成dsRNA琼脂糖检测结果；b为室温下存放8h后dsRNA琼脂糖检测结果；
图2为Ha-1ectinUNPV F和Actin的扩增效率曲线；
图3为Real-time qPCR检测Ha-lectinl的沉默效果，图中点代表一只棉铃虫中Ha-lectinl/ actin mRNA相对量，水平线代表均值，P < 0.05水平差异显著；
图4为Real-time qPCR检测Ha-lectinl基因沉默后病毒滴度变化，每个点代表一只虫子中HaNPV/ Actin m RNA相对量，水平线代表均值，P < 0.05水平差异显著；
图5.为饲喂不同浓度dsRNA对Ha-1ectinl基因沉默的影响；
图6为饲喂2 X IO6浓度HaNPV与不同dsRNA浓度对棉铃虫致死率影响。
【具体实施方式】
[0011]下面结合具体实施例对本发明做进一步的阐释说明。
[0012]实施例1
发明人在工作实践以及对现有技术文献研究基础上，发现棉铃虫体内C型凝集素(Ha-lectinl)可抑制HaNPV在棉铃虫体内的增殖，为此发明人进行了一系列实验来证明此事实。
[0013](I) RNA干扰实验
根据我们克隆到的棉铃虫C型凝集素基因序列(NCBI基因ID:ABF83203)，选取417bp与棉铃虫其它序列具有较低相似性的区域为目的序列，设计RNAi引物。
[0014]上述417bp棉铃虫基因cDNA序列在现有文献中已有公布,为方便本领域技术人员实施本发明，重新公布如下:
-tacaagttccacagagtaccaggaacttttgatcgggctcactttgtttgttcggctgaaaacggccatcttgccattataaatagtgaagatgaagcggaagttttgagaaaagtctttgctgataatcctgctgcatggatacctggaaatttttggaaagacatagctttcatcggttttcacgattggggctcatggggcaattggaggacaatacatggagaaacgcttaaagaggctggttacgataaattctctggtggtgaacctaacaatgcaactccgggtgaacactgcggggccatctatcgttcagcacttctggatgacctctggtgcgataaaccagctccattcatttgtgagaaggacccagcgtatccacctatctgccagcctacggctgatgaagaa-3’，
利用 LectinIFl (RNA 干扰正向引物 I) (5，-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGTACAAGTTCCACAGAGTAC-3’ )和 Lectin IRl (RNA 干扰反向引物(5’ -TTCTTCATCAGCCGTAGG-3，)以及 Lectin IF2 (RNA 干扰正向引物 2) (5’ -TACAAGTTCCACAGAGTAC-3，)和LectinIR2 (RNA 干扰反向引物 2) (5，-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGTTCTTCATC
AGCCGTAGG-3’)分别进行两个独立PCR反应，得到两端带有T7 RNA聚合酶启动子(序列中黑体部分即为启动子)的基因片段；
扩增产物纯化后，T7 RNA聚合酶体外转录单链RNA，混合等体积的互补RNA退火合成dsRNA,经单链RNase和DNase 37°C孵育去除单链RNA和DNA模板，乙酸钠纯化后琼脂糖电泳检测dsRNA及室外存放8h后的完整性。
[0015]图1为合成的棉铃虫C型凝集素基因dsRNA完整性检测结果，结果显示在室外存放8h后dsRNA依然能够保持完整，为棉铃虫饲喂实验提供了支撑。需要说明的是，后续所有实验所采用的棉铃虫C型凝集素dsRNA均采用上述方法制备。
[0016]为检验棉铃虫C型凝集素基因dsRNA对目的基因表达干扰效果及对核型多角体病毒增殖的影响，将所合成的dsRNA注射入棉铃虫体内，实验过程如下:
实验组选取6龄12h棉铃虫幼虫共13只，用DEPC处理过的PBS将Ha-lectinl dsRNA溶液稀释成2.5 ug/uL，每只棉铃虫共注射3uL混合物，其中dsRNA IuL和100PBI核型多角体病毒2uL。注射过程中棉铃虫冰浴麻醉，用微量注射器从腹足间注射。对照组用GFPdsRNA (绿色荧光蛋白dsRNA)代替Ha-lectinl dsRNA，其它操作均相同。
[0017](2) Real-time qPCR 检测
48h后用Trizol ( Invitrogen, USA)提取每只棉铃虫总RNA。
[0018]提取的总RNA, DNase I处理后用于第一链cDNA的合成(Fermentas, Canada)。将cDNA稀释10倍后，再依次稀释成4-^4)4-14-4共四个梯度，优化反应条件，建立标准曲线。
[0019]如图2所示，Ha-lectinl及NPV F基因(囊膜融合蛋白F)分别与内参actin基因扩增效率相差在5%以内，适用于2_Λ Δε?算法。
[0020]用于Real-time qPCR 的引物分别为:Lectin RF2 (5’-AAGAGGCTGGTTACGATAA-3’)和 Lectin RR2 (5，-TGGCAGATAGGTGGATAC-3’);NPV RF (5，-AAC AACCGTGACAGTAAC-3’)和NPV RR (5，-AAGTAATTGCTGGAATCGTA-3’)。以 Actin 基因做为内参，引物分别为 actinRF2(5，-CGCCAAGTGTGACTATTC-3’)和 actinRR2 (5，-ACGATACCTTACAGCCTATT-3’)。所有引物通过软件Beacon Designer 7设计。
[0021 ] Rea-time qPCR反应体系为25μ?，其中40倍稀释的cDNA模板2μ?，2 X SYBRGreen Realtime PCR Master Mix-plus (Τ0Υ0Β0, Japan) 12.5KL, ΙΟμΜ 的正向和反向引物各 0.2μ?，ddH20 10.?μ?。Ha-lectin 扩增程序为:95 C，Imin ；95 C，30s;57 C，30s;72 C，30s ;40个循环。NPV F和内参actin基因扩增程序除了退火温度分别为59.3 C和55 C，其它同上。
[0022]Ha-lectin, NPV F和actin基因扩增的目的片段分别为163bp、152bp和122bp。荧光定量PCR仪采用62H0-100 Rotor Gene TM6000。数据采用2_Δ 法计算。独立实验
重复三次。
[0023]如图3所示，Rea-time qPCR检测结果表明:和注射等量GFP dsRNA对照组相比，实验组导致目标基因Ha-lectinl mRNA表达量下降。[0024]如图4所示，在Ha-1ectinl基因沉默后，Rea-time qPCR检测HaNPV的数量(检测标志为HaNPV囊膜融合蛋白F，即NPV F)，和注射等量GFP dsRNA对照组相比，结果显示HaNPV在棉铃虫中的滴度急剧升高，均值增高1268倍。
[0025]上述数据表明，Ha-1ectinl作为免疫相关基因抑制HaNPV在棉铃虫虫体内增殖，保护棉铃虫免受病毒感染，因而可作为害虫防治的重要靶标分子。
[0026]实施例2
通过实施例1的一系列实验，已经可以充分证明C型凝集素(Ha-lectinl)可抑制HaNPV在棉铃虫体内的增殖，因此通过抑制棉铃虫C型凝集素(Ha-lectinl)基因的转录和表达，使棉铃虫C型凝集素(Ha-lectinl)基因沉默，即可增强HaNPV的杀虫作用。
[0027]研究发现在昆虫中饲喂dsRNA也可引起目标基因的沉默，因而针对棉铃虫C型凝集素(Ha-lectinl) dsRNA的饲喂用量,发明人做了进一步研究,具体实验研究如下:
(I)饲喂不同浓度dsRNA引起的基因沉默
选取6龄12h棉铃虫幼虫每组各20只，共分4组，经饥饿处理12h后，饲喂喷洒Iul浓度分别为 0.5 ug/ul、2.5 ug/ul、3.0 ug/ul 和 5.0 ug/ul 的Ha-lectinl dsRNA人工饲料，饲料用量以8h内吃完为宜。
[0028]每组分别提取饲喂0h、24h、48h和96h后整虫的总RNA，反转录成cDNA后，Real-time qPCR检测Ha-lectinl基因的沉默状况。每组实验重复二次。
[0029]如图5所示为Rea-time qPCR检测结果:和Oh相比,饲喂3.0 ug/ul dsRNA能够导致目标基因Ha-lectinl`快速下降，且基因沉默持续时间较长。
[0030](2 ) dsRNA与HaNPV同时饲喂与单独饲喂HaNPV致死率对比
在上述验证饲喂dsRNA可使棉铃虫内C型凝集素基因沉默，从而增强HaNPV杀虫效果的基础上，进一步需要确定的即是HaNPV用量与多少浓度的dsRNA防治棉铃虫效果最佳，为此发明人做了进一步的验证实验。
[0031]每组选取3龄棉铃虫幼虫各100只，共分15组，用5、50、500、5000和50000 PIBHaNPV,即 2X IO5 PIB/m2、2X106 PIB/m2、2X IO7 PIB/m2、2X IO8 PIB/m2 和 2X IO9 PIB/m2HaNPV 和 Iul 浓度分别为 0 ug/ul (对照)，3 ug/ul,及 5 ug/ul Ha-1ectin dsRNA 预混后喷洒于面积约0.25cm2棉铃虫饲料表面，饲料用量以8h内吃完为宜。
[0032]分别统计棉铃虫在不同时间内死亡率，具体统计结果见下表。
[0033]和HaNPV同时饲喂棉铃虫幼虫死亡率
【权利要求】
1.一种增强核型多角体病毒生物防治棉铃虫效果的方法，其特征在于，在对棉铃虫施用核型多角体病毒时，施用棉铃虫C型凝集素dsRNA。
2.如权利要求1所述增强核型多角体病毒生物防治棉铃虫效果的方法，其特征在于，棉铃虫C型凝集素dsRNA，按以下步骤制得: (1)以棉铃虫血细胞cDNA 为模板，利用 LectinIFl，5’ -GGATCCTAATACGACTCACTATAGGTACAAGTTCCACAGAGTAC-3’和 Lectin IR1，5’-TTCTTCATCAGCCGTAGG-3’ 以及 Lectin IF2，5’-TACAAGTTCCACAGAGTAC-3’ 和 LectinIR2，5’-GGATCCTAATACGACTCACTATAGGTTCTTCATCAGCCGTAGG-3’分别进行两个独立PCR反应，得到两端带有T7 RNA聚合酶启动子的基因片段； (2)将步骤(1)所获得的两端带有T7RNA聚合酶启动子的基因片段纯化； (3)将步骤(2)所得纯化产物用T7RNA聚合酶体外转录单链RNA，混合等体积的互补RNA退火合成dsRNA ； (4)将步骤(3)所得产物经单链RNase和DNase37°C孵育去除单链RNA和DNA模板，乙酸钠纯化后用琼脂糖凝胶电泳检测dsRNA的纯度和完整性。
3.如权利要求1所述增强核型多角体病毒生物防治棉铃虫效果的方法，其特征在于，按每只棉铃虫3ug棉铃虫C型 凝集dsRNA和50 PIB核型多角体病毒的用量。
【文档编号】C12N15/113GK103814950SQ201310558834
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2013年11月12日 优先权日:2013年11月12日
【发明者】柴连琴, 孟景会, 王树芳, 王楠, 周文杰 申请人:河南大学