稳定表达鸡白介素10蛋白的细胞系及其构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了稳定表达鸡白介素10蛋白的细胞系及其构建方法和应用。本发明将去信号肽的鸡白介素10编码基因定向克隆于含有新霉素抗性基因的真核表达载体中，获得重组质粒并将其转染中国仓鼠卵巢细胞系CHO-K1细胞，经G418加压筛选、纯化、获得稳定、高效表达chIL-10蛋白的细胞系CHO-chIL-10M，其微生物保藏号是CGMCC?NO.7659。本发明所构建的细胞系CHO-chIL-10M在制备重组鸡白介素10蛋白以及鸡白介素10单克隆抗体等方面有广泛的应用前景。
【专利说明】稳定表达鸡白介素10蛋白的细胞系及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株表达重组鸡白介素的细胞系，尤其涉及一株稳定表达鸡白介素10融合蛋白的细胞系，本发明进一步涉及该细胞系的构建方法及其应用，属于重组鸡白介素10蛋白的制备领域。 【背景技术】
[0002]白细胞介素简称白介素，是由白细胞产生的、介导细胞间相互作用的细胞因子，在细胞的活化、增殖和分化中起调节作用。随着分子生物学的发展，有关鸡白介素基因和功能的研究已逐渐成为热点，迄今为止，已从鸡中分离出多种白介素，例如:IL-l、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-16、IL-18等，这些白介素能够应用于免疫治疗剂、免疫增强剂、构建新型基因工程疫苗等方面，利用白介素等细胞因子增强或调节机体的非特异性免疫，不仅会有效防控畜禽疾病，还能在畜牧业生产中产生巨大的经济效益。
[0003]现有的制备重组鸡白介素10蛋白的基因工程方法不同程度的存在着表达效率较低、表达不稳定等缺陷，有待改进。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一是提供一株稳定表达鸡白介素10蛋白的细胞系；
[0005]本发明的目的之二是提供构建所述稳定表达鸡白介素10蛋白的细胞系的方法；
[0006]本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的:
[0007]本发明分别扩增鸡chIL-10全部编码基因(euchIL-10F)和鸡去信号肽编码基因(euchIL-ΙΟΜ),分别定向克隆于含有报告基因eGFP和新霉素抗性基因(neo)的真核表达载体pEGFP-Nl中，经酶切及测序鉴定，获得重组质粒Nl-euchIL-10F和Nl-euchIL_10M。本发明将获得的重组质粒Nl-euchIL-10F和Nl-euchlL-lOM分别转染中国仓鼠卵巢细胞系CH0-K1细胞，经G418加压筛选、纯化，获得表达chIL-10蛋白的细胞系CH0-chIL-10M和CH0-chIL-1OFο CHO-chlL-lOM和CH0-chIL-10F细胞系经过连续2次单克隆纯化，传代培养至第26代，在FITC滤光通道下，CHO-chlL-lOM仍能够观察到报告基因eGFP蛋白激发的强绿色荧光，而CHO-chlL-lOF荧光较弱；实验结果表明2种重组真核表达质粒都能在CH0-K1细胞中表达重组鸡白介素10蛋白，但是细胞系CHO-chlL-lOM表达重组鸡白介素10蛋白的表达效率要远远高于CHO-chlL-lOF表达重组鸡白介素10蛋白的表达效率，且细胞系CHO-chlL-lOM表达重组鸡白介素10蛋白的稳定性要远远优于CH0-chIL-10F的稳定性。
[0008]RT-PCR鉴定结果表明，chIL-10全部编码基因(euchIL-10F)和鸡去信号肽编码基因(euchIL-ΙΟΜ)分别在CH0-chIL-10F和CH0-chIL-10M细胞系中获得稳定表达，但是CHO-chlL-lOM细胞系中鸡去信号肽编码基因的的表达强度是CHO-chlL-lOF细胞系中chIL-10全部编码基因的4-6倍左右。
[0009]Western blot检测结果显示，chIL-10全部编码基因(euchlL-lOF)和鸡去信号肽编码基因(euchIL-ΙΟΜ)均在细胞中得到正确表达，但是CH0-chIL-10M细胞系中鸡去信号肽的白介素10编码基因的表达量要远远高于CHO-ChIL-1OF中鸡白介素10全部编码基因的表达量。
[0010]IFA检测结果表明，鼠抗Ch IL-10血清与细胞系CH0_ch IL-1OF和CH0_ch IL-1OM均呈现特异性红色荧光，而兔抗chIL-10血清不与任何细胞株反应。
[0011]有无信号肽对IL家族成员体外表达的效果是事先难以预期的。李行(李行，稳定表达鸡IL-18蛋白细胞系的建立及鸡IL-18单克隆抗体的制备，2012，硕士论文)研究发现，在其它条件相同情况下，与不含信号肽相比，鸡IL-18有信号肽会明显促进其体外表达的效率或表达量；本发明的实验非常意外的发现，将鸡IL-18的信号肽去掉后，其在细胞中的表达效率或表达量要远远高出鸡白介素10全长基因的表达效率或表达量。
[0012]鉴于CHO-chlL-lOM细胞系中鸡去信号肽的白介素10编码基因的表达量或表达效率远远高于CHO-chlL-lOF中鸡白介素10全部编码基因的表达量或表达效率，本发明将细胞系CHO-chlL-lOM提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为=CGMCCN0.7659 ;分类命名为:中国仓鼠卵巢细胞系。保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2013年5月29日:保藏地址:中国北京朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所；
[0013]本发明所构建的细胞系CHO-chlL-lOM能够高效、稳定的表达重组鸡白介素10蛋白，在制备重组鸡白介素10蛋白以及鸡白介素10单克隆抗体等方面有广泛的应用前景。
[0014]本发明涉及到术语
[0015]术语“多核苷酸”或“基因”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述 类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA (肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer 等人,Nucleic Acid Res.19:5081 (1991) ; Ohtsuka 等人，J.Bio1.Chem.260:2605-2608(1985);和 Cassol 等人，(1992) ; Rossolini 等人，Mol Cell.Probes8:91-98(1994))。
[0016]术语“报告基因”是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。
[0017]术语“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。
[0018]术语“转化”:将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。
[0019]术语“表达”:内源性基因或转基因在细胞中的转录和/或翻译。
[0020]术语“编码序列”:转录成RNA的核酸序列。[0021]术语“真核表达载体”:一种或多种用于实现真核生物转化的DNA载体，包含真核细胞转录和翻译所需的调控元件，如启动子、多聚A加尾信号等；此外，还可以有选择标记基因、目的基因以及真核细胞能够识别的复制位点。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1G418加压筛选12d抗性集落的形成(F1，100X)。
[0023]图2转染24h后共聚焦显微镜扫描图。
[0024]图3chIL_10基因在CHO-Kl细胞中稳定表达(100X)的结果。
[0025]图4 稳定表达 chlL-lOCHO 细胞株的 RT-PCR 鉴定；1: CHO-chlL-lOF ;2: CH0-N1 ；3:CHO ；4:水；5:CH0-chIL-10M ；M:DNA 分子质量标准。
[0026]图5稳定表达chILlO融合蛋白的CHO细胞株Western blot分析；1:CH0-N1 ;2:CHO ；3:CH0-chIL-10F ;4:CH0-chIL_10M ；5:pET-chIL-10 ；M:DNA 分子质量标准；A:兔抗chIL-10血清;B:鼠源抗GFP标签单抗；C:鼠抗chIL-10血清。
[0027]图6 稳定表达 chIL-10 的 CHO 细胞株 IFA 鉴定(100X) ;A: CHO-chlL-lOF ；B:CHO-chlL-lOM ;C:CH0-N1 ;D:CH0。
【具体实施方式】
[0028]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0029]I实验材料
`[0030]1.1实验材料
[0031]真核表达质粒载体pEGFP-Nl和CH0-K1细胞由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物组保存；无特定病原体(SPF)鸡、清洁级雄性新西兰兔、BALB/c小鼠由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供，实验动物生产许可证编号为SCXK (黑)2011-007。
[0032]1.2主要试剂
[0033]Ex Taq, EcoR 1、Xho 1、Pst I和感受态大肠杆菌DH5 α购自宝生物工程大连有限公司；Lipofectamine?2000转染试剂购自Invitrogen公司；预染蛋白Marker购自富酶泰斯生物技术(深圳)有限公司；胎牛血清、RPMI 1640、DMEM/F12培养基购自HyClone公司；质粒小量提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒均购自Omega公司；G418硫酸盐购自Amresco公司；DyLight 594标记的羊抗兔IgG购自EarthOx公司，DyLight 594标记的羊抗鼠IgG购自Jackson公司，IRDye?700DX标记的山羊抗兔IgG和IRDye?700DX标记的山羊抗鼠IgG (1:5000)购自Rockland公司，抗GFP标签单抗购自Rockland公司；鸡淋巴细胞分离液购自BD公司；脂多糖(LPS)和刀豆素A (ConA)购自Invitrogen公司，其它试剂均为国产分析纯。
[0034]实施例1稳定表达鸡白介素10蛋白细胞系的构建
[0035]1、实验方法[0036]1.1鸡外周血淋巴细胞的分离、培养及总RNA的提取
[0037]无菌翅静脉采集一只成年SPF鸡枸橼酸钠抗凝血10mL，按产品说明书用鸡淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细胞。用含10%胎牛血清的完全RPMI1640培养基调整细胞密度到IXlO6 / mL，加入到6孔细胞板培养，并向其中加入终浓度分别为10ug/mL、20ug/mL的LPS和终浓度分别为10ug/mL、25ug/mL、30ug/mL的ConA作为刺激剂，于37°C，5%C02培养箱中培养，每隔4h晃动一次,于不同时间收集细胞。用Trizol Reagents总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，具体方法按说明书进行。 [0038]1.2chIL-10原核表达载体的构建、表达和抗血清的制备
[0039]根据GenBank登录的chIL_10基因(NM_001004414.2)，设计原核表达引物扩增编码chIL-10成熟蛋白的基因；
[0040]上游引物序列为:
[0041]proChlLlO-F:5/ ~CGGAATTCTTGGAGCCCACCTGCCTG~3' (EcoR I) (SEQ ID N0.1),
[0042]下游引物序列为:
[0043]proChlLlO-R:5 ' -CCCTCGAGTCACTTCCTCCTCCTCATCAGC-3 ' (Xho I) (SEQ IDN0.2)。
[0044]PCR 反应程序:95°C 5min ；94°C 30s,68.3°C 30s、72°C 30s, 32 个循环；72°C IOmin0以限制性内切酶EcoR I和Xho I对扩增并纯化后的目的基因及pET-30a(+)进行双酶切，酶切产物经胶回收试剂盒纯化后用T4DNA Ligase连接，转化感受态DH5a细胞。用PCR法、限制性内切酶分析及核酸序列测定，鉴定转化后所得的原核重组表达质粒，命名为pET-chIL-10。将 pET-chIL-10 转化 Ε.coli BL21 (DE3)，0.lmmol/L IPTG 诱导表达。收集菌体，在冰浴中超声波破碎，分别收集沉淀和上清，SDS-PAGE分析目的蛋白表达形式。大量诱导表达重组菌，切下目的蛋白所在胶条，研磨，用适量PBS重悬，分别免疫新西兰兔和BALB/c小鼠，制备兔抗血清和鼠抗血清。
[0045]1.3chIL-10基因真核表达质粒的构建
[0046]根据NM_001004414.2的基因序列，设计2对真核表达引物，分别扩增chIL_10全长(称为euchIL-10F)和去信号肽(称为euchIL-ΙΟΜ)序列。
[0047]euchIL-10F的引物序列为:
[0048]euChIL10F-U:5 ' ~CTCGAGACCATGCAGACCTGCTGCCAAG~3 ' (Xho I)(其中 ACC 为Kozak 序列)(SEQ ID N0.3)；
[0049]euChIL10F-L:5/ ~AACTGCAGCTTCCTCCTCCTCATCA~3' (Pst I)(去掉终止密码子)(SEQ ID N0.4)。
[0050]euchIL-ΙΟΜ的引物序列为:
[0051]euchIL-10M-U:5/ ~CTCGAGGCCATGTTGGAGCCCACCT~3' (XhoI) (SEQ ID N0.5)；
[0052]euchIL-10M-L:5/ ~AACTGCAGCTTCCTCCTCCTCATC~3' (PstI) (SEQ ID N0.6)。
[0053]以Xho I和Pst I对扩增并纯化后的目的基因及含有报告基因eGFP的真核表达载体pEGFP-Nl进行双酶切，酶切产物经胶回收试剂盒纯化后用T4DNA Ligase连接，转化DH5a感受态细胞。用PCR法、限制性内切酶分析及核酸序列测定，鉴定转化后所得的阳性克隆。用去内毒素小量质粒提取试剂盒从鉴定正确的克隆菌中提取质粒。所得到的真核重组表达质粒分别命名为Nl-chlL-lOF和Nl-chIL-10M。[0054]1.4建立稳定表达chIL-10基因的CHO-Kl细胞系
[0055]将CHO-Kl细胞传代于96孔细胞板中，待细胞达80%时，加入含有不同浓度(100-1200mg/L)G418和10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，连续培养约2周，确定G418最小细胞致死量。参考试剂盒说明书，利用Lipofectamine?2000转染CHO-Kl细胞，载体pEGFP-Nl同样转染作为阴性对照。24h后用含终浓度800mg/L G418的DMEM/F12完全培养液进行抗性筛选。以有限稀释法对转染阳性细胞连续单克隆化；同时建立表达空载体pEGFP-Nl的对照组细胞株(CHO-Nl)。常规胰酶消化，连续传代培养细胞。
[0056]2实验结果
[0057]图1为G418加压筛选12d抗性集落的形成结果(F1，100X );图2为转染24h后共聚焦显微镜扫描图。从图3的结果可见，CHO-chlL-lOM和CHO-chlL-lOF细胞经过连续2次单克隆纯化，传代培养至第26代，在FITC滤光通道下，CHO-chlL-lOM仍能够观察到报告基因eGFP蛋白激发的强绿色荧光，而CHO-chlL-lOF荧光较弱(图3)，表明2种重组真核表达质粒都能在CH0-K1细胞中进行表达，但报告基因的表达强度或效率存在非常显著差异，CH0-chIL-1OM的表达效率及表达稳定性要显著优于CHO-chlL-lOF的表达效率及表达稳定性。实验结果说明，将鸡IL-18的信号肽去掉后，其在细胞中的表达效率或表达量要远远高出鸡白介素10全长基因的表达效率或表达量。
[0058]实施例2稳定表达鸡白介素10蛋白的细胞系的鉴定
[0059]1.实验方法
[0060]1.1RT-PCR 检测
[0061]用Trizol Reagents提取试剂盒提取实施例1所构建的CH0-chIL-10F和CH0-chIL-1OM细胞总RNA，具体方法按试剂盒说明书进行。取逆转录产物cDNA，经PCR扩增鉴定 chIL-10 基因，反应程序为:95°C 5min ；94°C 30s,64°C 30s,72 °C 40s, 30 个循环；72°C IOmin。
`[0062]1.2IFA 检测
[0063]将克隆纯化后的CH0-chIL-10F和CH0-chIL-10M细胞株以IX IO4个/孔接种于96孔板，以CH0-N1细胞为阴性对照，CH0-K1细胞作为空白对照，分别以制备的chIL-10兔抗血清和鼠抗血清为一抗(I:50),以DyLight 594标记羊抗兔IgG和DyLight 594标记羊抗鼠IgG为二抗(1:200)，进行IFA检测。
[0064]1.3ffestern blot 检测
[0065]将CH0-chIL-10F和CH0-chIL-10M细胞用PBS洗涤后收集，用RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白。经SDS-PAGE分离后，转印至PVDF膜，分别以制备的兔抗血清(1:50)、鼠抗血清(1:50)、抗GFP标签单抗(1:1000)为一抗，以IRDyeTM700DX标记的山羊抗兔IgG和IRDye?700DX标记的山羊抗小鼠IgG(l:5000)为二抗，进行Western blot检测。利用Odyssey近红外双色激光成像系统扫描。同时以空载体转染的CH0-N1细胞为阴性对照，以CH0-K1细胞作为空白对照。
[0066]2实验结果
[0067]2.1RT-PCR 鉴定结果
[0068]分别对CH0-chIL-10F、CHO-chlL-lOM、CH0-N1 和 CHO 细胞提取总 RNA。分别用两对引物 euChIL10F-U/euChIL10F-L 和 euchlL-lOM-U/euchlL-lOM-L 进行 RT-PCR 扩增，结果从CHO-chlL-lOF和CHO-chlL-lOM分别扩增出533bp和473bp的条带，与全长和去信号肽的chIL-10基因理论大小相一致，而CHO-Nl和CHO均没有相应的扩增产物，说明目的基因已在细胞中获得稳定表达(图4);表达结果表明，去信号肽(称为euchIL-ΙΟΜ)的chIL-10在体外的表达量大约比chIL-10全长(称为euchIL-10F)的表达量高出了 4_6倍。
[0069]2.2Western blot 检测结果
[0070]Western blot检测结果显示(图5),利用GFP特异性单抗和鼠多抗血清分别能在CH0-chIL-10F和CHO-chlL-lOM的蛋白裂解产物中分别检测到46ku和44ku大小的条带，符合eGFP基因与chIL-10基因的融合蛋白理论值，但利用兔抗血清没有检测到条带。表明全长和去信号肽的chIL-10基因均在细胞中得到正确表达，但重组蛋白的免疫原性存在兔体和鼠体的种属差异。
[0071]2.3IFA检测结果
[0072]IFA检测结果表明，鼠抗chIL-10血清与CH0-chIL-10F和CH0-chIL-10M均呈现特异性红色荧光，而兔抗chIL-10血清不与任何细胞株反应(图6)。
【权利要求】
1.稳定表达鸡白介素10蛋白的细胞系CHO-chlL-lOM，其特征在于，其微生物保藏编号为:CGMCC N0.7659。
2.—种构建权利要求1所述细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤:将去信号肽的鸡白介素10编码基因定向克隆于含有新霉素抗性基因的真核表达载体中，获得重组质粒；将获得的重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞系CHO-Kl细胞，经G418加压筛选、纯化、获得稳定表达chIL-10蛋白的细胞系CH0-chIL-10M。
3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于:所述的真核表达载体是pEGFP-Nl。
4.权利要求1所述的细胞系在制备重组鸡白介素10蛋白中的用途。
5.权 利要求1所述的细胞系在制备鸡白介素10单克隆抗体中的用途。
【文档编号】C12N5/10GK103614340SQ201310572460
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月15日 优先权日:2013年11月15日
【发明者】韩凌霞, 廉传江, 文辉强, 司昌德, 林欢, 陈洪岩 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所, 哈尔滨动物生物制品国家工程研究中心有限公司