鸡白介素-10单克隆抗体及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了鸡白介素-10单克隆抗体及其制备方法和应用。本发明以原核表达的重组蛋白ChIL-10为免疫原，真核细胞系表达的ChIL-10蛋白为筛选原，细胞融合后以IFA筛选杂交瘤细胞，筛选获得3株分泌鸡白介素-10单抗的细胞株；其中杂交瘤细胞株2F6所分泌的单抗效价最高、稳定性最高、特异性最强，其微生物保藏号为CGMCC?NO.7657。本发明进一步提供了杂交瘤细胞株2F6及其分泌的单克隆抗体在检测或纯化鸡白介素-10蛋白中的应用。
【专利说明】鸡白介素-10单克隆抗体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及单克隆抗体，尤其涉及鸡白介素-10单克隆抗体以及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，本发明进一歩涉及该单克隆抗体在检测或纯化鸡白介素-10蛋白中的应用，属于鸡白介素-10单克隆抗体的制备及应用领域。
【背景技术】
[0002]白细胞介素简称白介素，是由白细胞产生的、介导细胞间相互作用的细胞因子，在细胞的活化、増殖和分化中起调节作用。随着分子生物学的发展，有关鸡白介素基因和功能的研究已逐渐成为热点，从鸡中分离出多种白介素，能够应用于免疫治疗剂、免疫增强剂、构建新型基因工程疫苗等方面，利用白介素等细胞因子增强或调节机体的非特异性免疫，不仅会有效防控畜禽疾病，还能在畜牧业生产中产生巨大的经济效益。
[0003]目前，用于分泌鸡白介素-10单克隆抗体的杂交瘤细胞株存在效价低、稳定性差等缺陷，所分泌的单克隆抗体特异性较差，严重制约了生产应用，亟待改迸。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之ー是提供一株稳定、高效分泌鸡白介素-10单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
[0005]本发明的目的之二是提供由该杂交瘤细胞株分泌的鸡白介素-10单克隆抗体；
[0006]本发明的目的之三是将所述的鸡白介素-10单克隆抗体应用于检测或纯化鸡白介素-10蛋白。
[0007]本发明的上述目的是通过以下技术`方案来实现的:
[0008]一株稳定、高效分泌鸡白介素-10单克隆抗体的杂交瘤细胞株CHIL-10 2F6，其微生物保藏编号为=CGMCC N0.7657 ;分类命名为:鸡IL-10单克隆抗体杂交瘤细胞株；保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2013年5月29日:保藏地址:中国北京朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0009]本发明以原核表达的重组蛋白ChIL-1O为免疫原，真核细胞系表达的ChIL-1OF和ChIL-1OM蛋白为筛选原，细胞融合后以IFA筛选杂交瘤细胞上清，将初步判定为阳性的杂交瘤细胞经2次克隆化，获得3株分泌ChIL-1O单抗的细胞株:2F6，3E6和3C12。本发明用IFA检测3株分泌ChIL-1O单抗的细胞株培养上清，测定这3株阳性杂交瘤细胞株的效价，从效价測定结果来看，2F6阳性杂交瘤细胞株的单抗腹水IFA效价为1:2800，3E6阳性杂交瘤细胞株的单抗腹水IFA效价为1:1300，3C12阳性杂交瘤细胞株的单抗腹水IFA效价为1:1200 ;从效价測定结果来看，2F6阳性杂交瘤细胞株的单抗腹水IFA效价要显著高于其它2株阳性杂交瘤细胞株的单抗腹水IFA效价。
[0010]本发明将阳性杂交瘤细胞株2F6、3E6和3C12所分泌的单克隆抗体分别与原核重组蛋白ChIL-1O进行Western blot,试验结果发现,2F6阳性杂交瘤细胞株的单抗只与重组蛋白ChIL-1O起反应，而不与空载体菌体反应，说明2F6阳性杂交瘤细胞株的单抗的特异性最好；阳性杂交瘤细胞株3E6和3C12所分泌的单克隆抗体与空载体菌体存在反应，特异性较差。
[0011]本发明应用杂交瘤细胞株2F6所分泌的单克隆抗体检测经LPS刺激的外周血淋巴细胞中的IL-10蛋白，试验结果发现，不同B单倍型鸡的外周血淋巴细胞中均检测到一条17kDa大小的蛋白，检测到的蛋白均与天然ChIL-1O蛋白17kDa相符。
[0012]本发明鸡白介素-10单克隆抗体具有良好的特异性，可制备成检测或诊断鸡体内的IL-10蛋白的诊断试剂，例如，可以将本发明鸡白介素-10单克隆抗体制备成诊断或检测IL-10蛋白的ELISA检测试剂盒。
[0013]此外，本发明鸡白介素-10单克隆抗体还可应用于纯化鸡白介素-10蛋白；例如，将本发明单克隆抗体吸附在惰性的固相基质上制备成层析柱；当样品流经层析柱时，待分离的抗原与固相的单克隆抗体发生特异性结合，其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离子强度或PH，欲分离的抗原与抗体解离，收集洗脱液便可得到纯化的鸡白介素-10蛋白。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1单克隆抗体亚类的鉴定结果；分别为2F6、3E6，3C12的细胞培养液的上清。
[0015]图2腹水的IFA反应结果(200X) ；A:腹水稀释50倍时的IFA结果；B:腹水稀释2000倍时的IFA结果；C:阴性对照。
[0016]图3单抗与原核重组蛋白ChIL-1O的Western blot的結果；1:原核重组蛋白ChIL-1O ；2:空载体菌体;M:蛋白质分子质量标准。
[0017]图4利用单抗2F6检测经LPS刺激的鸡外周血淋巴细胞中的IL-10蛋白结果；1_2:两只鸡个体;M:蛋白质分子量质量标准。
【具体实施方式】
[0018]下面结合具体实施例来进ー步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0019]1.生物材料和试剂
[0020]1.1实验动物和细胞
[0021]BALB/c雌性小鼠购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心；小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0由本发明人实验室保存。
[0022]1.2主要试剂
[0023]50XHAT、100XHT 添加剂均购自 GIBCO ;胎牛血清:B10CHR0M, Berlin ；DyLight594标记羊抗鼠IgG购自Jackson ImmunoResearch公司；IRDye?680标记山羊抗鼠IgG购自L1-COR生命科学公司；IgG抗体亚类试剂盒购自Southern Biotech公司；T-PERk组织裂解液购自Thermo Fisher科技公司；鼠抗P-Actin的单抗购自中杉金桥公司。
[0024]实验例I鸡白介素-10单克隆抗体的制备及鉴定
[0025]1.实验方法[0026]1.1小鼠的免疫
[0027](I)制备含ChIL-1O重组蛋白的SDS-PAGE胶条。具体操作如下:将ChIL-1O基因与原核表达载体pET-30a进行双酶切，连接，转染大肠杆菌BL21 (DE3)，收获经终浓度为
0.lmmol/L的IPTG诱导5h后的菌体，经超声处理后，进行SDS-PAGE电泳。准确切取目的条带所在凝胶，即为上述的ChIL-1O重组蛋白胶条
[0028](2)免疫前加入少量PBS用研磨棒研磨，加入适量双抗溶液，以胶粒能够通过ImL注射器针头为且，即免疫原； [0029](3)选取5只6-8周龄清洁级BALB/c小鼠，用制备的免疫原通过腹腔注射对其免疫，每只每次300 u L,每隔2w免疫一次；
[0030](4)第三次免疫后Iw眶下窦采血，按照常规方法分离血清；
[0031](5)将免疫鼠的抗血清与CHO-ChIL-1OF细胞做IFA验证试验，检测二者能否反应，并测定血清的效价；
[0032](6)选取血清效价最高的小鼠进行加强免疫，72h后融合。
[0033]1.2细胞融合
[0034]1.2.1饲养层细胞制备
[0035]细胞融合前一天，按照以下方法制备饲养层细胞:
[0036](I)取8-10周龄BALB/c雌性小鼠，摘除眼球取血，分离血清作为阴性对照，颈椎脱臼致死，用75%的酒精浸泡消毒5min ；
[0037](2)移入超净台，四肢用ImL注射器针头固定在已灭菌的泡沫固定板上，腹面向上，无菌操作将小鼠腹部皮肤剪开一小ロ，钝性分离皮肤与腹膜，用5mL注射器吸取5mLDMEM培养基注入腹腔，用酒精棉球轻轻揉动小鼠腹部，再用注射器缓慢吸出腹腔内的液体，反复操作2次；
[0038](3)加入约90mL HAT培养液轻轻悬浮细胞，按照100 U L/孔分装到96孔细胞培养板，置5%C02 , 37 °C培养箱中培养。
[0039]1.2.2骨髓瘤细胞5?2/0的制备
[0040](I)于融合前2w复苏SP2/0，在超净工作台配制含10%FBS、1%谷氨酰胺的DMEM培
养液；
[0041](2)从液氮中取出含SP2/0细胞冻存管，迅速放入37°C水浴中，在Imin内融化；以75%酒精消毒管ロ，移入超净工作台内，吸出细胞悬液加入到培养瓶中，置于37°C、5%C02培养箱中培养；
[0042](3) 12h后，更换新鲜DMEM完全培养液。
[0043]1.2.3脾细胞的制备(研磨法)
[0044](I)选择血清抗体效价较高的免疫小鼠，眼球采血，收集血清供检测时阳性对照用；颈椎脱白致死，放入75%酒精浸泡5min进行体表消毒；
[0045](2)将小鼠移入超净台，四肢用ImL注射器针头固定在已灭菌的泡沫固定板上，腹面向上；
[0046](3)无菌将小鼠腹部皮肤剪开一小口，钝性分离皮肤与腹膜，然后剪开腹膜，暴露脾脏，将脾脏移入一放有IOmL DMEM平皿内，剔除周围的结缔组织，取出脾脏，然后将其放入另ー提前倒入IOmL DMEM的平皿中清洗；[0047](4)然后将其转移至灭菌的铜网上，铜网放在另外ー个盛有DMEM的平皿上；用注射器的活塞部轻轻地在铜网上研磨，将铜网浸在培养液中使脾细胞被分离；
[0048](5)将脾细胞悬液转移到15mL离心管中，1500rpm离心8min。
[0049]1.2.4细胞融合
[0050](I)将生长状态良好的SP2/0及脾细胞，按照1:5-1:10的体积比，在50mL尖底离心管中混合，补加DMEM于一定的体积，轻轻混匀；
[0051](2)于水平离心机1500rpm离心8min，倒干净上清液，用手指轻弹离心管底部，使两种细胞松散混匀，放于装有37°C水的烧杯中保温；
[0052](3)用移液器沿管内壁在Imin内逐滴加入lmL50%的PEG3350，同时匀速转动离心管；
[0053](4)用30mL DMEM培养液终止PEG3350的作用，90s内加完，静置IOmin ；
[0054](5) 1500rpm 离心 8min。吸弃上清，加入 50mL37°C保温的含 HAT、10%FBS 的 DMEM，混匀；
[0055](6)在长好饲养细胞的细胞板上每孔加入100 UL融合细胞悬液，置于37°C，5%的CO2培养箱中培养；
[0056](7)融合5天后，更换HAT培养液，采用半换液的方式进行换液；
[0057](8)培养至9天左右，观察培养液颜色，若培养液变为黄色时可进行检测。
[0058]1.3以IFA筛选阳性杂交瘤细胞
[0059](I)将CHO-ChIL-1OF和CHO-ChIL-1OM细胞系按常规方法传代铺于96孔细胞培养板上，置于37°C，5%C02培养箱中培养；
[0060](2)当细胞单层长至80%-90%，倒掉培养液，用PBS洗涤3次，每次5min，用室温的丙酮:甲醇(1:1) (v/v)室温固定15min，甩掉固定液，敞开培养板自然干燥后待用；
[0061](3)当细胞培养液变黄后，吸取IOOii L上清液加在固定的CHO细胞板上，以免疫鼠血清为阳性对照(1:50稀释，稀释液为PBS)，以制备饲养层细胞的小鼠血清为阴性对照，以PBS为空白对照，37°C水浴Ih ；PBS洗涤3次，每次5min ;加入50 y L DyLight594标记羊抗鼠IgG为二抗(1:200稀释，PBS稀释)，37°C水浴40min，PBS洗涤3次，每次5min ;在荧光倒置显微镜下观察红色荧光；
[0062](4)选择红色荧光最强的孔的细胞进行单克隆。
[0063]1.4阳性杂交瘤细胞的单克隆化
[0064] 采用有限稀释法单克隆化。根据实际情况确定克隆的次数。按如下步骤进行:
[0065](I)克隆化的前一天按照上述2.1的方式制备饲养层细胞；
[0066](2)用移液器将待克隆的孔内细胞吹打混匀，用含20%血清的HT选择培养液稀释至I个细胞/孔的密度；
[0067](3)按照I个细胞/孔加到已有饲养细胞的细胞板，置5%C02、37°C的培养箱中进行培养；
[0068](4)培养至第4天时，在倒置显微镜下观察并记录细胞单克隆生长孔；培养Iw左右，当细胞培养液变黄吋，做好标记，吸取100 u L上清，用建立的IFA方法检测细胞孔。
[0069](5)隔3天左右待培养液变黄，再次对初检阳性孔做IFA检测；
[0070](6)将两次检测均为强阳性的孔内细胞进行2次亚克隆，直至每孔都能检测到强红色荧光；
[0071](7)扩大培养并冻存强阳性单克隆杂交瘤细胞；
[0072]以原核表达的重组蛋白ChIL-1O为免疫原，真核细胞系表达的ChIL-1OF蛋白为筛选原，细胞融合后以IFA进行筛选杂交瘤细胞上清，阳性杂交瘤细胞克隆经2次克隆化，获得3株分泌ChIL-1O单抗的细胞株:2F6、3E6和3C12。
[0073]1.5强阳性杂交瘤细胞的稳定性检测
[0074](I)用弯头吸管将生长状态良好的处于对数生长期的阳性杂交瘤细胞轻轻从瓶壁上吹下；
[0075](2) 1000rpm 离心 5min,弃上清；
[0076](3)将细胞沉淀悬浮用冻存液(DMEM培养液:FBS:DMS0=5:4:1)，将细胞分装至无菌冻存管中，4°C 30min, -20°C Ih，_70°C过夜，放入液氮罐中长期保存；做好相应记录；
[0077](4)按照CHO细胞的复苏方法复苏。培养后，用IFA检测细胞培养上清，測定效价。
[0078]1.6单抗腹水的制备
[0079](I)选取10-13周龄BALB/c小鼠4只，腹腔注射液体石蜡0.5mL/只；
[0080](2)7天后，腹腔接种经PBS稀释的培养至对数期的阳性杂交瘤细胞，每只小鼠5X105/0.2mL ；
[0081](3)5天后观察，当小鼠腹部明显膨胀时，用5mL的注射器抽取腹水，每隔3天收集一次，直到小鼠死亡。`
[0082](4)将腹水以2000rpm，离心5min ;留上清分装后_70°C冰箱保存。
[0083]1.7单克隆抗体亚类的鉴定
[0084]利用免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒(Southern Biotech公司)对2F6, 3E6和3C12共3株单抗进行亚类鉴定，具体试验方法如下:
[0085](I)将ChIL-1O重组蛋白经SDS-PAGE电泳，切下目的胶条，在EP管中尽可能地碾碎，加入适量PBS，4°C过夜；
[0086](2)次日，5000rpm离心5min ;取上清,测蛋白浓度；
[0087](3)按照4ug/mL包被酶标板，每孔100 U L，37°C过夜；
[0088](4)次日，甩掉未结合的蛋白，PBST洗涤3次，每次5min ;每孔加入100 ii L的
0.5%BSA 封闭，37°C放置 Ih ；
[0089](5)在封闭好的酶标板中分别加入2F6，3E6，3C12细胞培养液上清，100 U L/孔，37°C孵育Ih ；PBST洗涤3次，每次5min ；
[0090](6)向酶标板中依次加入用PBSl:250稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗
[0091](分别为抗鼠K、入 UgMUgAUgG1UgG2aUgG21^P IgG3), 100 y L/孔，37°C放置 Ih,PBST洗涤3次，每次5min;
[0092](7)加入 ABTS 底物，显色，IOOii L/孔，孵育 10_15min ;
[0093](8)用酶标仪在405nm波长处读取吸光值(0D值)。
[0094]1.8单抗腹水IFA效价的测定
[0095]将3株单抗分泌的腹水分别用PBS按照以下比例稀释，1:50、1:100、1:200、1:400、1:600、1:800、1:1000、1:1200、1:1500、1:2000、1:3000，测定 IFA 效价。
[0096]1.9单抗与原核重组蛋白ChIL-1O的western blot的反应性[0097]分别将原核重组蛋白ChIL-1O和空载体菌体经SDS-PAGE电泳后，转印至PVDF膜，以2F6，3E6，3C123株分泌单抗的细胞培养液为ー抗，以IRDyeTM700DX标记山羊抗鼠IgG(1:5000稀释)为二抗进行western blot反应。
[0098]2.实验结果
[0099]2.1单克隆抗体亚类的鉴定结果
[0100]亚类鉴定结果为3株单抗重链均为IgM，轻链均为Kappa链(图1)。
[0101]2.2强阳性杂交瘤细胞的稳定性检测
[0102]稳定性检测结果发现，强阳性杂交瘤细胞2F6分泌ChIL-1O单抗的稳定性最好，明显优于3E6和3C12的稳定性。
[0103]2.3单抗腹水IFA效价的测定
[0104]单抗腹水IFA效价测定结果见图2。从效价測定结果来看，2F6阳性杂交瘤细胞株的单抗腹水IFA效价为1:2800，3E6阳性杂交瘤细胞株的单抗腹水IFA效价为1:1300，3C12阳性杂交瘤细胞株的单抗腹水IFA效价为1:1200 ;从效价測定结果来看，2F6阳性杂交瘤细胞株的单抗腹水IFA效价要显著高于其它2株阳性杂交瘤细胞株的单抗腹水IFA效价。
[0105]2.4单抗与原核重组蛋白ChIL-1O的western blot的反应性结果
[0106]图3为2F6阳性杂交瘤细胞株的细胞培养上清为ー抗的western blot结果；结果表明2F6阳性杂交瘤细胞株的单抗只与重组蛋白ChIL-1O起反应，而不与空载体菌体反应，具有较强的特异性；而3E6以及3C12阳性杂交瘤细胞株的单抗除了与重组蛋白ChIL-1O起反应外，还与空载体菌体反应，说明3E6以及3C12的特异性较差。
[0107]实验例2利用本发明单克隆抗体2F6检测经LPS刺激的鸡外周血淋巴细胞中的IL-10蛋白
[0108]1.实验方法
[0109]分离B19和B21单倍型鸡外周血淋巴细胞，含10%FBS的DMEM培养液培养2h后，加入浓度为30ii g/mL的LPS刺激36h，提取蛋白，利用2F6细胞株细胞培养液为ー抗，以IRDye?700DX标记山羊抗鼠1gG (1:4000稀释)为二抗，进行western blot反应。
[0110]2.实验结果
[0111]实验结果见图4。经LPS刺激36h后的B19和B21单倍型鸡外周血淋巴细胞中均检测到一条17kDa大小的蛋白，与天然ChIL-1O蛋白大小相符。
【权利要求】
1.一株分泌鸡白介素-10单克隆抗体的杂交瘤细胞株CHIL-1O 2F6，其特征在于，其微生物保藏号为:CGMCC N0.7657。
2.由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
3.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备检测或诊断鸡体内的IL-10蛋白试剂中的用途。
4.权利要求1所述的杂交瘤细胞株CHIL-102F6在制备纯化IL-10蛋白试剂中的用途。
5.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测或诊断鸡体内的IL-10蛋白试剂中的用途。
6.权利要求2所述的单克隆抗体在制备纯化IL-10蛋白试剂中的用途。
7.按照权利要求4或6所述的用途，其特征在干，包括:将权利要求1杂交瘤细胞株CHIL-10 2F6分泌的单克隆抗体吸附在惰性的固相基质上制备成层析柱；当样品流经层析柱时，待分离的抗原与 固相的单克隆抗体发生特异性结合，其余成分不能与之结合；将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离子强度或PH，欲分离的抗原与抗体解离，收集洗脱液便得到纯化的鸡白介素-10蛋白。
8.—种诊断或检测IL-10蛋白的ELISA检测试剂盒，其特征在于:含有权利要求1所述杂交瘤细胞株CHIL-10 2F6分泌的单克隆抗体。
【文档编号】C12N5/20GK103571796SQ201310572486
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年11月15日 优先权日:2013年11月15日
【发明者】韩凌霞, 廉传江, 文辉强, 司昌德, 林欢, 陈洪岩 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所, 哈尔滨动物生物制品国家工程研究中心有限公司