一种烯醇脱氢酶、编码基因、载体、工程菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种烯醇脱氢酶及其编码基因，含有该编码基因的载体、工程菌及其应用。所述烯醇脱氢酶的氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，其编码基因如SEQ?ID?No.2所示。本发明提供了一种来源于约克氏菌WZY002（Yokenella?sp.WZY002）的烯醇脱氢酶基因核苷酸序列；该烯醇脱氢酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的胞内表达重组质粒，再转化至大肠杆菌菌株中，获得重组大肠杆菌；该重组大肠杆菌经细胞破碎，分离纯化获得重组烯醇脱氢酶；该重组烯醇脱氢酶具有还原烯醛、烯酮、芳香醛和芳香酮等底物生成对应的醇的能力；利用重组大肠杆菌或重组烯醇脱氢酶为生物催化剂同时催化醇的氧化和醛的还原，可以生成巴豆醛、苯甲醇、橙花醇和香叶醇。
【专利说明】一种烯醇脱氢酶、编码基因、载体、工程菌及其应用
(-)【技术领域】
[0001]本发明涉及一种烯醇脱氢酶及其编码基因，含有该编码基因的载体、工程菌及其应用。
(二)【背景技术】
[0002]a, (6-不饱和化合物如烯醇、烯醛和烯酮等在化学工业的许多领域中具有重要应用，常用于生产精细化学品、药物和香精香料等。目前，a，(6-不饱和烯醇通常是利用化学催化剂对烯醛或烯酮进行选择性加氢而制备。化学法还原a，3-不饱和烯醛或烯酮制备烯醇往往选择性较低，并且伴随着副产物饱和醇的生成。作为化学法的替代，生物催化法制备a，3 -不饱和烯醇具有高效、经济、选择性高、条件温和等优点，已越来越受研究者所重视。与化学催化剂只能催化还原反应不同，生物催化剂既可以用于a，(6-不饱和烯醛或烯酮的选择性加氢，也可以用于a，(6-不饱和烯醇的选择性氧化制备烯醛或烯酮。
[0003]用于生物法制备a，0 -不饱和烯醇的生物催化剂既可以是整细胞，也可以是酶。因为细胞内含有多种酶，整细胞催化往往会遇到副反应的问题，副反应的存在会降低目标反应产物的得率。对于像烯醛还原生成烯醇这种一步反应来说，酶法催化更具优势，既可以彻底避免副反应的问题，也可以克服细胞膜阻碍底物和产物跨膜传递的问题。因而，通过基因工程技术高产烯醇脱氢酶，将为其在生物法制备a，(6-不饱和化合物中的应用奠定良好的基础。
[0004]烯醇脱氢酶能够催化烯醛或烯酮的还原生成烯醇，也能够催化烯醇的氧化生成烯醛或烯酮。烯醇脱 氢酶属于含锌中链醇脱氢酶家族，以NAD (P) H为辅酶，一般来说都具有苄醇脱氢酶的活力。目前，已从微生物中发现多种烯醇脱氢酶，如醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、贝氏不动杆菌(Acinetobacter baylyi)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。这些野生菌中烯醇脱氢酶含量极低，利用其作为生物催化剂进行大规模的工业化生产存在一定的难度，因而构建烯醇脱氢酶基因工程菌从而大量生产重组烯醇脱氢酶具有重要意义。
(三)
【发明内容】
[0005]本发明目的是提供一种烯醇脱氢酶基因、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌，及其在生物法制备a，(6-不饱和醇/醛中的应用。
[0006]本发明采用的技术方案是:
[0007]一种烯醇脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]SEQ ID N0.1:
[0009]MSIIKSYAAK EAGSELELYE YDAGELRPED VEVQVDYCGI
[0010]CHSDLSMIDN EffGFSQYPLV AGHEVIGRVA ALGSAAQEKG
[0011]VKVGQRVGVG WTARSCGHCD ACISGNQINC LEGAVATILN
[0012]RGGFAEKLRA DffQffVIPLPE SIDIESAGPL LCGGITVFKP[0013]LLMHHITATS RVGVIGIGGL GHIAIKLLHA MGCEVTAFSS
[0014]NPSKEQEVLA MGADKVVNSR DPDALNALAG QFDLIINTVN
[0015]VDLDffQPYFE ALAYGGHFHT VGAVMKPLPV PAFTLIAGDR
[0016]SISGSATGTP YELRKLMKFA GRSKVSPTTE LFPMSQINEA[0017]IQHVRDGKAR YRWLQADF。
[0018]由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在90%以上、且具有相同的酶活性，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
[0019]本发明所述蛋白的片段、衍生物或类似物是指基本上保持本发明所述的蛋白酶相同的生物学功能或活性的蛋白，可以是下列情形:(I ) 一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；(II) 一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代；(III)成熟蛋白与另一种化合物(比如延长蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；(IV)附加的氨基酸序列融合进成熟的蛋白而形成的蛋白序列(如用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列)。
[0020]所述蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白或合成蛋白，可以是纯天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如:细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白可以是糖基化的。本发明的蛋白还可以包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
[0021]本发明还涉及所述烯醇脱氢酶的编码基因。
[0022]具体的，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示:
[0023]
【权利要求】
1.一种烯醇脱氢酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.权利要求1所述烯醇脱氢酶的编码基因。
3.权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。
4.含有权利要求2或3所示编码基因的重组载体。
5.一种用权利要求4所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。
6.权利要求2或3所述基因在制备重组烯醇脱氢酶中的应用。
7.权利要求1所述的烯醇脱氢酶在催化还原醛或酮制备相应的醇中的应用；所述的醛为下列之一:巴豆醛、反式2-己烯醛、2-甲基-2-戊烯醛、反式2-辛烯醛、反式2-癸烯醛、香叶醛、橙花醛或苯甲醛；所述的酮为下列之一:4-甲基-3-戊烯-2-酮、3-辛烯-2-酮、2-溴苯乙酮。
8.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述催化还原在pH5.5~9.5、20~70°C条件下进行。
9.权利要求1所述的烯醇脱氢酶在催化氧化巴豆醇制备巴豆醛中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述催化氧化在pH6.1~10.0,20~70°C条件下进行。
【文档编号】C12P7/24GK103614349SQ201310578047
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月18日 优先权日:2013年11月18日
【发明者】应向贤, 汪钊, 王一芳, 郑建永, 章银军 申请人:浙江工业大学