一种复制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1及其制备方法和其在治疗肿瘤中的用途
【专利摘要】本发明提供了一种复制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCS1及其制备方法，本发明的强化因子为沉默细胞因子信号抑制因子1（SOCS1）的重组复制缺陷型腺病毒rAd-sh-RNA-SOCS1;感染DCs后采用肿瘤特异的CTL表位多肽脉冲DCs使其成熟为mDCs,再然后与自身外周血体外扩增的CIK细胞共培养，它们之间的相互作用大大强化了对肿瘤细胞的特异性杀伤，突破机体对肿瘤细胞或病毒感染细胞的免疫耐受，在小鼠肿瘤模型的治疗性实验中，具有良好的治疗效果。此外，该病毒感染的DC细胞也可以与其他免疫效应细胞，如CTL、NK、γδT和TIL细胞等，联合用于肿瘤，包括但不限于宫颈癌的治疗。
【专利说明】一种复制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-S0CS1及其制备方 法和其在治疗肿瘤中的用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及强化树突状细胞（dendritic cells，DCs)-免疫效应细胞治疗肿瘤的 方法，具体地，涉及一种修饰的树突状细胞-效应细胞用于肿瘤治疗的方法，尤其是一种复 制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl及其制备方法，以及用该病毒强化DC-效应免疫细胞 在治疗肿瘤中的用途。
【背景技术】
[0002] 癌症问题日趋严峻，癌症的预防与控制面临巨大挑战。世界卫生组织国际癌症研 究中心认为，未来癌症发病人数年均将会以3%-5%的速度递增，预计2020年全球将有2000 万癌症新发病例，死亡病例将达1200万。从发病率来看，中低收入国家癌症发病率远高于 发达国家。我国癌症呈明显高发态势，目前，城市中癌症已经占到死亡总数的25%，农村为 21%，已出现癌症乡和癌症村。癌症患者年轻化趋势也比较明显。目前癌症治疗的主要方法 为手术、放化疗。这些治疗方法对癌症有一定疗效，但同时对患者有严重副作用，甚至加速 肿瘤的转移和对放化疗的耐受。肿瘤的绿色治疗已受到越来越多的关注。癌症的免疫治疗 是继上述手术、放疗和化疗的第四种治疗方法，是最有可能彻底治愈肿瘤的绿色治疗方法。
[0003] 树突状细胞（Dendritic cells, DCs)是最专业的抗原呈递细胞（antigen presenting cells, APCs),在先天性和适应性免疫中处于中心地位，能够加工处理和递呈 抗原肽给初始T细胞（naive T Cells)，从而诱发⑶4+辅助性T细胞（helper T cells， Th)和⑶8+细胞毒T细胞（cytotoxic T lymphocytes, CTLs)介导的细胞免疫应答；也 能激活自然杀伤细胞（natural killer cells，NK)【Fernandez NC，Lozier A, Flament Cj et al. Dendritic cells directly trigger NK cell functions:cross-talk relevant in innate anti-tumor immune responses in vivo.Nat Medl999,5:405 - 411.】 和 NK 样 T 细胞（NKT)【Kadowaki N，Antonenko S，Ho S，et al. Distinct cytokine profiles of neonatal natural killer T cells after expansion with subsets of dendritic cells. J Exp Med. 2001，193:1221 - 1226·】。但肿瘤组织微环境抑制其 产生和成熟，导致DCs数量减少而且存在功能缺陷【Aalamian M，Pirtskhalaishvili G. , Nunez A，et al. Human prostate cancer regulates generation and maturation of monocyte-derived dendritic cells.Prostate2001，46(l) :68-75.】。DCs 的缺乏和功能 不良是肿瘤免疫逃逸以及其他免疫治疗不能取得良好效果的一个重要原因。纠正肿瘤患者 DCs功能缺陷以诱发或增强机体对肿瘤的免疫应答，这已成为晚期肿瘤免疫治疗新的切入 点。例如，Waeckerle-Men等【Waeckerle-Men Y，Allmen EU, von Moos R.，et al. Dendritic cells generated from patients with androgen-independent prostate cancer are not impaired in migration and T-cell stimulation. Prostate2005, 64(4) :323-33L 】石开究 显示来源于HRPC病人的单核细胞来源的DCs在体外培养和修饰后能激活同源的CD4+和 ⑶8+T细胞并呈递抗原产生特异性的CTLs，有效地启动免疫应答。
[0004] 体外培养获得大量的DCs使得利用DCs疫苗进行免疫治疗成为可能，图9-1 【Karolina P, Jacques B. Cancer immunotherapy via dendritic cells[J]. Nature Reviews Cancer, 2012 (12) : 265-277】展示了数树突装细胞对肿瘤的免疫治疗途径，而选择 合适的肿瘤抗原及装载方式于体外构建的DCs疫苗成为DCs疫苗抗肿瘤免疫治疗的关键。 适合负载DCs的抗原有多肽、蛋白、DNA、RNA、灭活的肿瘤细胞以及含抗原的重组病毒。2010 年4月，美国食品药品监督局（FDA)批准前列腺癌疫苗Provenge (sipuleucel-T)上市，这 是一种新型的自体源性细胞免疫疗法药物【Sharma P, Wagner K, Wolchok JD and Allison JP. Novel cancer immunotherapy agents with survival benefit:recent successes and next steps. NATURE REVIEWS I CANCER2011, 11:805-812】，其负载方式是 GM-CSF和 PSA 融合 的蛋白抗原，这种抗原负载方式存在效率低下的缺陷。DCs疫苗临床使用效果存在个体差 异，其主要原因包括：缺乏刺激因子，抗原呈递弱化因子的作用和无效的抗原负载。自身耐 受仍然维持在原来的自然免疫抑制环境，从而妨碍了 DCs肿瘤疫苗的疗效和作用。因此，采 用某些方法和技术来增强DCs摄取提呈抗原等的功能是提高疫苗效能的关键。
[0005] 在肿瘤的免疫细胞治疗中，诱发MHC限制性的CTLs应答是最有效的免疫治疗 方式之一。然而，CTLs的准备需要反复刺激，是一个复杂而耗时的过程。而且，在应用 DCs疫苗时，因肿瘤患者体内存在复杂的免疫抑制限制了疫苗诱导CTLs克隆的大量产 生，影响治疗效果，因此联合疫苗和体外诱导的大量特异性免疫效应细胞，将可能更有效 地提高抗肿瘤免疫能力。细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer cells, CIKs)是一群具有高增殖活性和非特异性细胞毒性的过继免疫杀伤细胞【Schmidt-Wolf IG1Negrin RS1Kiem HP, et al. Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine-induced killer cells with potent antitumor cell activity. J Exp Med. 1991, 174:139 - 149;Lu, PH, Negrin RS. A novel population of expanded human CD3+CD56+cells derived from T cells with potent in vivo antitumor activity in mice with severe combined immunodeficiency. J Immunol1994, 153:1687 - 1696.】,PBMC 在体外经过多种细胞因子共同诱导获得的一群异质细胞，并分泌大量的细胞因子，回输体 内后能进一步激活体内细胞免疫，能有效杀伤肿瘤细胞或可能转化的细胞。最近实验研究 [Marten A, Ziske C, Schottker B，et al. Interactions between dendritic cells and cytokine-induced killer cells lead to an activation of both populations. J Immunother. 2001, 24(6):502-510;Zhang S, Wang Q, Li WF, et al. Enhanced antitumor immunity by murine cytokine activated T lymphocytes after cocultured with bone marrow derived dendritic cells pulsed with whole tumor lysates. Leuk Res. 2004, 28 (10) : 1085-1088.】表明经特异性抗原刺激后的DCs能明显提高CIKs细胞对特 异性靶细胞的杀伤活性，提高抗肿瘤免疫能力。其机制可能是：成熟DCs高表达MHC I、MHC II类分子，⑶40、B7-1、B7-2等共刺激因子和细胞粘附因子ICAM-1、ICAM-3,使之有利于提 呈抗原并激活T细胞和CIKs ;DCs能分泌多种细胞因子如IL-2、IL-12和IFN-γ等，促进 CIKs的功能活性。另外，CIKs也可通过⑶40-⑶40L相互作用等途径促进DCs的成熟和共 刺激分子、抗原提呈分子的表达以及IL-12的分泌；而IL-12能诱导T细胞分泌IFN- Y，活 化CIKs和诱导Thl型免疫应答，使DCs、CIKs均被进一步激活。因此，经特异性抗原刺激后 的DCs与CIKs共培养的DC-CIKs细胞，既发挥CIKs细胞非MHC限制性细胞毒作用，同时激 发抗原负载DCs介导的MHC限制性细胞毒作用，增加了对靶细胞的特异性杀伤，比CIKs细 胞具有更强的杀伤活性和更高的增殖能力；同时CIKs可提高DCs的功能，回输体内能更好 激活体内抗原提呈系统，发挥DCs抗原提呈，从而激活体内抗肿瘤的免疫效应，具有广阔的 临床应用前景。
[0006] 抗原负载的DCs与包括CIKs效应细胞共培养明显促进抗肿瘤的细胞毒 性，已经在白血病[Zhang S, Wang Q, Li WF, et al. Enhanced antitumor immunity by murine cytokine activated T lymphocytes after cocultured with bone marrow derived dendritic cells pulsed with whole tumor lysates. Leuk Res. 2004, 28 (10): 1085-1088.】，多发性骨髓瘤【Marten A，Renoth S，von Lilienfeld-Toal M，et al. Enhanced lytic activity of cytokine-induced killer cells against multiple myeloma cells after co-culture with idiotype-pulsed dendritic cells. Haematologica. 2001，86，（10) : 1029-1037.】，骨肉瘤【Wongkajornsilp A，Sangsuriyong S，Hongeng S，et al. Effective osteosarcoma cytolysis using cytokine-induced killer cells pre-inoculated with tumor RNA-pulsed dendritic cells. J Orthop Res. 2005, 23，（6):1460-1466.】以及肝癌【Gonzalez-Carmona MA，Marten A，Hoffmann P，et al. Patient-derived dendritic cells transduced with an a -fetoprotein-encoding adenovirus and co-cultured with autologous cytokine-induced lymphocytes induce a specific and strong immune response against hepatocellular carcinoma cells. Liver Int. 2006,26(3):369-379.】等研究中得到证实。但DC-CIK的临床疗效明显但仍有 待进一步提尚。
[0007] 无论是DC疫苗还是DC-CIK在体外的培养需要一组细胞因子。细胞因子是一类调 节细胞生长、分化、增殖的多肽小分子，其不能直接进入细胞内发挥作用，需通过细胞因子 受体介导，经相应信号传导途径发挥其生物学效应。细胞因子信号抑制因子（Suppressor of cytokine signaling，S0CS)是信号传导通路JAK/STAT的一个负调控分子家族，为 S0CS1 ?7 和 CIS (cytokine-inducible SH2domain_containing protein)等 8 种起负免 疫调节作用胞质分子组成的超家族，含有WD-40重复序列及SOCS盒的蛋白（WSB)，锚蛋白 重复序列及SOCS盒的蛋白（ASB)，SPRY结构域及SOCS盒的蛋白（SSB)等成员【Gilboa E.DC-Bsaed cancer vaccines[J].J Clin Invest，2007，117(5) :1195】。S0CS1 定位在 16pl2-pl3. 1，人类SOCSl基因编码211个氨基酸，鼠和人的SOCSl蛋白有95%?99%氨 基酸同源【Julie P，Delphine L，Frank P，et al. The many faces of the SOCS box[J]· Cytokine & Growth Factor Reviews，2008, 19:371-381 】。其中，SOCSl 通过 SH2 结构域与 细胞因子受体胞内段Janus激酶（Janus kinases，JAK)结合，使其泛素化后降解，从而阻 滞IFN-α、IFN-7、IL-2、IL-6、IL-7、IL-12和IL-15等多种因子信号，抑制DCs和其他细 胞内JAK-STAT信号通路。S0CS1被认为是防止自身免疫的重要调节分子，近年发现，S0CS1 在DCs中发挥了相当的作用，是抗原提呈负性调控的一种重要机制【Yandava CN，Pillari A, Drazen JM. Radiation hybrid and cyto-genetic mapping of SOCSland S0CS2to chromosomesl6pl3andl2q, respectively[J]. Genomics,1999,61 :108-111 ；Yoshimura A， NakaTiKubo M. SOCS proteins,cytokine signaling and immune regulation[J]. Nat Rev Immunol，2007,7(6) :454-465】。SOCS 结构及其功能见图 9-2 和图 9-3【Julie P，Delphine L, Frank P, et al. The many faces of the SOCS box[J]. Cytokine & Growth Factor Reviews, 2008, 19:371-381. ]〇
[0008] SOCSl参与DCs的发生、成熟和活化，SOCSl缺陷的DCs释放细胞因子如IL-4和 IFN- γ，可抑制GM-CSF介导人⑶14+单核细胞来源的DCs发生，并负调控LPS和IL-4诱导 的DCs成熟【于鸿，刘玉侠，贾艳华，等.S0CS1调节树突状细胞抗肿瘤免疫的研究进展 [J]·中国免疫学杂志，2009,25 (6):571-575】。S0CS1是一个独特的抑癌基因，S0CS1异 位表达抑制某些造血特异性癌基因的转化活动。研究发现【Involvement of suppressors of cytokine signaling in toll-like receptor mediated block of dendritic cell differentiation[J]· Blood，2006, 108(13) :4102-4108】发现 SOCSl 缺陷转基因小鼠支持 在炎症相关的肿瘤的发展中SOCSl的负性作用，这种小鼠除T、B细胞外，其它所有类型细 胞S0CS1表达都被敲除，发展成慢性结肠炎和结肠癌，显示缺乏S0CS1时IFN- γ -STATl通 路持续激活诱发结肠癌。大多数人肝细胞癌中S0CS1表达常常通过S0CS1启动子CpG岛 的过度甲基化而被沉默，当敲除S0CS1后能增强IL-6介导的细胞增殖【Yoshida T，Ogata H, Kanmo M, et al. SOCSlis a suppressor of liver fibrosis and hepatitil-induced carcinogenesis[J].J Exp Med，2004，199(12) :1701_1707】。研究表明【Evel-Kabler K, Song XT, Aldrich M, et al. SOCSlrestricts dendritic cells' ability to break self tolerance and induce antitumor immune by regulating IL_12production and signaling[J].J Clin Invest，2006，116(l):90-100】，SOCSl 沉默导致抗原呈递 DCs 的 IL-12信号和下游细胞因子网络不受约束，从而导致宿主水平自身耐受的打破和自身免疫 性病理反应。在抗原呈递DCs中SiRNA技术沉默S0CS1基因强烈加强抗原特异性抗肿瘤免 疫。与对照的siRNA转染的DCs相比，SOCSlsiRNA转染的DCs对LPS或IFN- γ的应答更 强。抗原（OVA)肽脉冲的SOCSl-siRNA转染的DCs比对照组DCs更强烈地激发OVA-特异 性 CTL [Shen L. Evel-Kabler K. Strube R, et al. Silencing of SOCSlenhances antigen presentation by dendritic cells and antigen-specific anti-tumor immunity[J]. Nat Biotechnol ,2004, 22 (12) :1546-1553】。利用各种SOCS蛋白的小分子类似物结合药物传递 系统可有效治疗炎症性疾病及癌症。宋海峰等【宋海峰，周军，潘科，等.抑制S0CS1联 合0K-432刺激的DC疫苗抗肿瘤效应的初步研究[J]·癌症，2008, 27 (7) :685-691】通过 设计siRNA片段能有效下调iDC中S0CS1的表达，0K-432刺激DC成熟，CD80、CD83、CD86、 HLA-DR等DC表面抗原明显表达上调，而负载肝癌抗原对DC表型无明显影响。S0CS1的下 调可以促进DC成熟，负载肝癌抗原的DC能有效刺激自体淋巴细胞增殖，T细胞增殖率为 (110. 7±22. 2) %，同时产生针对H印G2细胞的特异性杀伤作用，特异性细胞毒T淋巴细胞 活性为（54.0±13.2)%。而针对K562 细胞和EC109细胞杀伤率仅为（14.5±15.5)%和 (10. 0± 30. 7) %。结果显示RNAi下调S0CS1表达，0K-432刺激负载肝癌全细胞抗原的DC， 可以产生高效而特异性的抗肝癌的免疫应答。S0CS1在DCs介导的系统性自身免疫反应中 起着不可忽视的抑制作用。S0CS1缺陷DCs免疫诱导了一种超Thl型免疫应答和抗肿瘤活 性。江敏等【姜敏，秦霞，胡青海，等.S0CS1基因沉默增强DO疫苗对肺癌动物模型的治疗 效果[JL现代免疫学，2007, 27 (4) :294-299】研究发现，荷瘤小鼠接受疫苗治疗后，虽然 未沉默S0CS1的DC也有一定疗效，但沉默S0CS1可使疗效显著增强，肺肿瘤生长明显趋缓， ⑶8+CTL在体外对肿瘤的特异性杀伤大幅提高，分泌Thl型细胞因子IFN- γ、TNF- α亦进一 步增加。可见，SOCSl是DC功能负性调节的重要分子，沉默SOCSl可以显著增强DC提呈抗 原、启动T细胞免疫的能力。于鸿等【于鸿，张健，刘玉侠.RNA干扰抑制SOCSl表达增强树 突状细胞抗肿瘤作用[J].中国实验诊断学，2009, 13(5) :598-601】针对SOCSl基因，采用化 学合成法合成3对SOCSlsiRNA，并转染树突状细胞。Western blot检测树突状细胞SOCSl 的表达情况，结果与空白对照组相比，SOCSl沉默的树突状细胞抗肿瘤活性显著提高，可以 用于临床的肿瘤免疫治疗。
[0009] 为躲避宿主免疫系统攻击，肿瘤发展出多种多样的逃逸机制，在抗原提呈阶段，就 可能存在肿瘤抗原免疫原性低下、MHC分子表达减少、协同刺激分子缺如、分泌抑制性细胞 因子等因素[50, 51]。如何打破肿瘤免疫耐受状态，进一步提高肿瘤DCs疫苗临床疗效； 如何体外获得大量有稳定功能DCs ;如何确保DCs肿瘤免疫治疗安全性等方面是新一代 DCs疫苗研究急需解决问题。根据上述分析，本专利以宫颈癌的免疫治疗为研究对象，阐释 SOCSl的沉默对DC-CIK治疗宫颈癌的加强作用。
[0010] 增强宿主的免疫反应、突破机体对肿瘤的自身耐受是成功研发宫颈癌治疗性疫苗 的重要一环。专业的APCs网络控制免疫和耐受，通过提供前炎性细胞因子和加工处理抗原 并递呈给T细胞和其它细胞，介导对病毒感染和癌细胞的先天性和获得性免疫反应。在组 织中能捕获病原体编码的抗原的DCs被病原体诱导的炎性反应激活，DCs的激活分为两期， 即成熟期和执行功能期，使负载抗原的DCs迁移到外周淋巴结激活T细胞是一个基本步骤 [Gliboa E. DC-based cancer vaccines. J. Clin. Invest. 2007;117:1195- 1203】。肿瘤不同 于感染性病原体，不产生有助于DCs激活的有效的炎症反应，结果是其免疫反应非常弱且 无效。对于肿瘤患者，免疫治疗的主要目的在于克服这种缺陷，提供使DCs成熟的条件，使 之成为有免疫刺激功能的APCs。
[0011] 沉默SOCSl即为抑制抑制因子或抑制免疫减弱因子，从而加强DC的免疫作用。实 现这个目标有不同的方法，如化学合成RNAi、质粒转染、多肽或其相应的抗体。但抗体及质 粒转染如何进入细胞的问题，多肽和化学合成的RNAi存在稳定性问题，其中合成的RNAi 还存在对细胞的毒性问题，而复制缺陷型的腺病毒能有效地解决这个问题。本专利基于以 上目的，以宫颈癌为对象，其他肿瘤的治疗原理类似宫颈癌，但需要寻求特异性CTL表位 肽。首先采用HPV16E7表位肽，使DCs负载宫颈癌特异性癌蛋白HPV16E7. 49-57,同时，沉默 DCs细胞内的SOCSl基因，增强其抗原提呈能力，提高肿瘤疫苗的效能，深入研究HPV16E7表 位肽脉冲刺激和SOCSl沉默后DCs功能变化及其对CIKs效应细胞治疗宫颈癌动物模型的 影响，为研究宫颈癌疾病的发生发展机理、寻找相应防治措施提供新方法。
【发明内容】
[0012] 为了克服现有技术的不足，本申请提供了 一种强化树突状细胞-免疫效应细 胞治疗肿瘤的方法，该方法为复制缺陷型重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl对DC-免疫效应 细胞对肿瘤的杀伤作用的方法，具体而言，本发明提供了一种复制缺陷型重组腺病毒 rAd-RNAi-SOCSl及其制备方法和用该病毒强化DC-效应免疫细胞在治疗肿瘤中的用途。本 发明以宫颈癌为研究对象，也适用其他肿瘤的治疗。效应细胞在本发明中为细胞因子杀伤 细胞（cytokine-induced killers, CIKs),也适应 NK、CTL 等细胞。
[0013] 本发明的技术方案如下：一种复制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl，该制缺陷 性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl表达如下序列的双链RNA :
[0014] 5 ' -GATCCCTACCTGAGTTCCTTCCCCTTCAAGAGAGGGGAAGGAACTCAGGTAGTTTTTTG-3 '
[0015] 5 ' -AATTCAAAAAACTACCTGAGTTCCTTCCCCTCTCTTGAAGGGGAAGGAACTCAGGTAGG-3，
[0016] 所述复制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl的表达系统为Adeno-X。
[0017] 所述复制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl感染树突状细胞（DCs)，并使细胞内 的SOCSl表达沉默。
[0018] 所述复制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl感染DC后，用合成的HPV16E7. 49-57 表位多肽脉冲被腺病毒感染的DCs，用TNF-α使DCs成熟，与自身外周血体外扩增的CIK细 胞继续共培养后一周回输体内，对肿瘤细胞进行特异性杀伤。所述复制缺陷性重组腺病毒 rAd-RNAi-SOCSl感染DC后，也可以与其他免疫效应细胞CTL、NK、γ δ T和TIL细胞联合 使用治疗肿瘤。
[0019] 所述复制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl的制备方法如下：
[0020] 1)将所述双链RNA的编码DNA插入Adeno-X表达系统的RNAi-Ready pSIRN-Shuttle的多克隆位点，得到重组表达载体RNAi-SOCSl-pShuttle ;
[0021] 2)用PI-Sce I与I-Ceu I双酶切所述重组表达载体RNAi-SOCSl-pShuttle，将得 到的含有所述双链RNA的编码DNA的酶切片段与Adeno-X表达系统的Adeno-X病毒DNA连 接，将得到的连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，得到重组腺病毒DNA，再将该重组 腺病毒DNA转染ΗΕΚ293细胞，得到复制缺陷型重组腺病毒。
[0022] 所述复制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl在治疗宫颈癌中的用途。
[0023] 本发明为了突破机体对肿瘤的免疫耐受，选用诸如IFN- Y、IL-2、IL-7、IL-12和 IL-15等细胞因子的负调节因子S0CS1为靶标，用RNA沉默技术（RNA silencing)使S0CS1 基因沉默，然后将其转入腺病毒载体中构建成重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl。将重组腺病毒 rAd-RNAi-SOCSl感染分离培养的DCs，然后合成的HPV16E7. 49-57表位多肽脉冲被腺病毒 感染的DCs，用TNF-α使DCs成熟，与CIK细胞继续共培养后一周回输体内，对荷瘤的个体 产生强烈的免疫反应，突破机体对肿瘤细胞或病毒感染细胞的免疫耐受，在小鼠肿瘤模型 的治疗性实验中，具有良好的治疗效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1、本发明所述强化树突状细胞-免疫效应细胞治疗肿瘤的方法的总体技术方 案路线图。
[0025] 图2A、用菌落PCR方法鉴定插入外源基因的重组腺病毒，其中1泳道为DNA marker DL2000,第3和第4泳道为psh-SOCSl的阳性克隆，第7泳道为psh-mSOCS的阳性克隆。
[0026] 图2B、重组腺病毒rAd-EGFP感染293T后不同时间点24,48,72,96在荧光显微镜 下观察的结果，其中A和E为时间点24, B和F为时间点48, C和G为时间点72, D和H为 时间点96。
[0027] 图 3、用 Western Blot 分析重组腺病毒 rAd-RNAi-SOCSl 和 rAd-RNAi-mSOCSl 对 B16细胞中S0CS1表达的影响。
[0028] 图4、DCs培养第4天，40倍和100倍显微镜下观察细胞状态图。
[0029] 图5、CIKs增值期克隆团。
[0030] 图6A、流式细胞仪分析CIKs的表面分子⑶3、⑶4、⑶8和⑶56。
[0031] 图6B、流式细胞仪分析CIKs及共培养的DCs-CIKs表型。
[0032] 图7.腺病毒载体抑制的DCs中SOCSlmRNA水平测定。
[0033] 图8A、显微镜观察的DC-CIK对靶细胞TC-I细胞的杀伤作用。
[0034] 图8B、用LDH释放实验分析DC-CIK对TC-I的杀伤活性。
[0035] 图9-1树突状细胞对肿瘤的免疫治疗途径；
[0036] 图 9-2S0CS 家族结构：（a) CIS 和 S0CS1-7 结构域草图；（b) S0CS2 和 Elongin b 和 c的结合复合物的结构；（c) S0CS4和Elongin b和c的结合复合物的结构。图9-3S0CS 蛋白功能。
【具体实施方式】
[0037] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见： ((Molecular Cloning:A Laboratory Manual))(Sambrook,J. ,Russell, David ff. ,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harbor)。
[0038] 所用引物及DNA序列如无特别说明均由上海生工合成。
[0039] 本发明所述强化树突状细胞-免疫效应细胞治疗肿瘤的方法的总体技术方案路 线图，如图1所示。
[0040] 一、SOCSlshRNA 的设计以及重组表达载体 RNAi-SOCSl-pShuttle 和 RNAi-mSOCSl-pShuttle 的构建
[0041] I. SOCSlshRNA的设计登录上海吉玛生物公司网站进行，设计序列说明如下：
[0042] SOCSlshRNA 的正义链为 shRNA-SOCSl (F):
[0043] 5' -GATCCCTACCTGAGTTCCTTCCCCTTCAAGAGAGGGGAAGGAACTCAGGTAGTTTTTTG-3' (自 5'末端第6位至第58位是序列表中序列9) ;S0CSlshRNA的反义链为shRNA-SOCSl (R):
[0044] 5' -AATTCAAAAAACTACCTGAGTTCCTTCCCCTCTCTTGAAGGGGAAGGAACTCAGGTAGG-3' (自 5'末端第6位至第58位是序列表中序列10);mS0CSlshRNA的正义链为shRNA-mSOCSl (F):
[0045] 5' -GATCCACTATCTAAGTTACTACCCCTTCAAGAGAGGGGTAGTAACTTAGATAGTTTTTTTG-3 ,；
[0046] mSOCSIshRNA 的反义链为 shRNA-mSOCSl (R):
[0047] 5' -AATTCAAAAAAACTATCTAAGTTACTACCCCTCTCTTGAAGGGGTAGTAACTTAGATAGTG-3 ,。
[0048] 上述4条序列中，在每条链两端分别引入BamH I和EcoR I的粘性末端，中间加横 线部分为环序列，TTTTTT为转录终止区。
[0049] 2.制备双链DNA
[0050] 将合成的 shRNA-SOCSl (F)和 shRNA-SOCSl (R)退火成为双链 DNA， shRNA-mSOCSl(F)和 shRNA-mSOCSl(R)退火成为双链 DNA。
[0051] 20μ 1复性反应体系为：正义链1μ 1、反义链1μ 1、20XSSC (sigma公司，Cat. S6639) 1 μ 1，水 17μ 1。
[0052] 反应条件为：95°C加热2min，72°C 2min，34°C 2min。室温下冷却lh，分别稀释至终 浓度为40ng/y 1。
[0053] 3.制备载体：
[0054] 取载体RNAi-Ready pSIREN-Shuttle (购自BD公司），用限制性内切酶BamH I和 EcoRI酶切。
[0055] 4.连接转化
[0056] 将上述稀释后的双链DNA (shRNA-SOCSl和shRNA-mSOCSl)分别与经限制性内切 酶 BamH I 和 EcoRI 酶切的载体 RNAi-Ready pSIREN-Shuttle (购自 BD 公司）用 T4DNA 连接 酶进行连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，Amp抗性平板筛选阳性克隆。
[0057] 5、阳性克隆鉴定
[0058] 用PCR方法鉴定插入外源基因的重组腺病毒，结果如图2A所示。分析图2A表明 出现了阳性克隆。对鉴定得到的阳性克隆摇菌，提质粒。抽提质粒用BamH I和EcoR I双 酶切及测序鉴定，将获得的序列及插入位置均正确的含有抑制基因表达的小干扰RNA编码 基因的重组 RNAi 载体分别命名为 RNAi-SOCSl-pShuttle 和 RNAi-mSOCSl-pShuttle。
[0059] 二、重组腺病毒 rAd-RNAi-SOCSl 和 rAd-RNAi-mSOCSl 的构建
[0060] 将重组表达载体 RNAi-SOCSl-pShuttle 和 RNAi-mSOCSl-pShuttle 分别用 PI-Sce I和I-Ceu I (购自BD Clontech公司）进行双酶切，回收酶切产物，用Takara ligation Mixture分别连入Adeno-X表达系统（购自BD Clontech公司）中的Adeno-X病 毒DNA中，置PCR仪中16°C连接过夜。将连接产物用Swa I酶切消化（Swa I酶切位点位 于PI-Sce I与I-Ceu I之间），以去除未能与Adeno-X病毒DNA连接的基因片段。再次 回收酶切产物，将shRNA-SOCSl与Adeno-X病毒DNA正确连接的重组腺病毒载体命名为 pAdeno-X-RNAi-SOCSl，将pshRNA-mSOCSl与Adeno-X病毒DNA正确连接的重组腺病毒载体 命名为 Adeno-X-RNAi-mSOCSl。
[0061] 用重组腺病毒载体 pAdeno-X-RNAi-SOCSl 和 pAdeno-X-RNAi-mSOCSl 分 别转化大肠杆菌DH5ci，Amp抗性平板挑选阳性克隆。分别提取重组腺病毒载体 pAdeno-X-RNAi-SOCSl和pAdeno-X-RNAi-mSOCSl的DNA，将所得的重组质粒分别命名为 pAdeno-X-RNAi-SOCSl 和 pAdeno-X-RNAi-mSOCSl。对重组质粒 pAdeno-X-RNAi-SOCSl 和 pAdeno-X-RNAi-mSOCSl进行PCR扩增、酶切鉴定，将酶切鉴定正确的重组质粒送上海博亚 生物技术有限公司测序。PacI酶切pAdeno-X-RNAi-SOCSl和pAdeno-X-RNAi-mSOCSl使之 线性化。
[0062] 用线性化后的重组质粒 pAdeno-X-RNAi-SOCSl 和 pAdeno-X-RNAi-mSOCSl 分 别转染HEK293细胞，培养转染后的细胞至细胞出现明显的病态效应（cytopathic effect, CPE)。如图2B所示，从293T细胞得到了重组腺病毒Ad-EGFP。随着培养的时间的 延长，分泌到培养液中的腺病毒再感染新的293T细胞，但后期会出现特有的细胞病变反应 (CPE)。
[0063] 重组腺病毒 rAd-RNAi-SOCSl 和 rAd-RNAi-mSOCSl 的制备按照 Adeno-XTM Expression System User Manual 进行，具体过程如下：
[0064] (1)用PBS洗涤上述出现明显病态效应的HEK293细胞2次，直接将HEK293细胞吹 打下来（不用胰酶），1，500rpm室温下离心5min ;500 μ I PBS重悬细胞；
[0065] (2) _20°C和37°C水浴反复冻融细胞3次，每次融化后短时间混匀细胞悬液；
[0066] (3) 12000rpm室温离心lOmin，收集含病毒的上清，加入10%甘油，过滤除菌后作为 重组病毒原液置_70°C冻存备用；
[0067] (4)培养HEK293细胞，待细胞铺满瓶底50-70%时，加入步骤（3)制备的病毒原液 250 μ 1，继续培养；
[0068] (5)观察细胞的病态效应，待50%以上的细胞从培养板底浮起时，重复上述 (1)_(3)步骤制备重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl和rAd-RNAi-mSOCSl，_20°C存放，以备测定 病毒滴度或进一步制备高滴度病毒用。
[0069] 三、重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl和rAd-RNAi-mSOCSl的滴度测定
[0070] 用超高速离心机回收上述步骤一制备的重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl和 rAd-RNAi-mSOCSl，然后用腺病毒滴定试剂盒测定重组腺病毒的滴度。结果表明，重组腺 病毒rAd-RNAi-SOCSl的滴度为2. 8xl07pfu/ml，重组腺病毒rAd-siDNA-mSOCSl的滴度为 2.5xl07pfu/ml〇
[0071] 四、重组腺病毒 rAd-RNAi-SOCSl 和 rAd-RNAi-mSOCSl 对 B16 细胞中 S0CS1 表达的 影响
[0072] B16细胞的培养按照常规细胞培养的方法进行。待B16细胞生长汇合达70-80%后， 用重组腺病毒感染复数（MOI)为50或100感染，72小时后收集细胞并裂解液裂解细胞，用 Western Blot分析S0CS1的表达，结果如图3所示，结果表明从293T细胞获得并纯化的腺 病毒rAd-sh-RNA-SOCSl感染B16细胞后，降低了 B16细胞中S0CS1的表达，从而证明了我们 得到的重组腺病毒rAd-sh-RNA-SOCSl具有再感染的活性，以及能够使B16细胞内的S0CS1 沉默。
[0073] 五、DC细胞的培养。
[0074] 1、DC细胞的培养
[0075] 小鼠骨髓来源的DCs(BMDCs)是根据Shen L's的实验方法进行诱导的。即用注射 器从其后肢将骨髓冲出，通过一个尼龙网收集骨髓细胞。加入含氯化铵的红细胞裂解液裂 解红细胞。然后用含10%FCS的RPMI1640完全培养液进行培养，置37°C，5%C02的孵箱中培 养4h后弃去悬浮细胞，经过RPMI1640多次洗涤后用含rmGM-CSF(20ng/ml，P印roTech)和 rmIL-4(20ng/ml，P印roTech)的完全培养液进行培养。在细胞培养滴4d，在40倍和100倍 显微镜下观察细胞形态，如图4所示。可见细胞贴壁成团，部分呈半悬浮状态。细胞在培 养第2d和第4d，弃培养液上清，并用新鲜含mGM-CSF和mIL-4培养基代替。经过48h培养， 没有粘附的粒细胞被去掉。培养至第6d的DCs分别经不同感染倍数腺病毒感染8-12h，然 后加入LPS (0. 5 μ g/ml)刺激培养24h，第二天轻轻吹打收集所有的悬浮细胞，即为体外扩 增的小鼠骨髓来源的树突状细胞。每日用相差显微镜观察细胞的生长和形态变化。将DCs 接种于12孔平板，400 μ I RPMI-1640培养液中，细胞浓度为I X 105/孔。
[0076] 2、DCs表型检测
[0077] 经腺病毒感染和在含或者不含LPS的新鲜培养液进行刺激24h后进行流式检测。 调细胞浓度为2 X IO5Ail，分别加入1μ I FITC标记的小鼠⑶80、⑶83、⑶86单抗。设立空 白对照。4°C避光反应30min，洗涤后上流式细胞仪检测。流式细胞检测操作流程：
[0078] I) DCs细胞培养7d后，离心800r/min，7min，弃上清；
[0079] 2 )含2%牛血清的PBS洗液Iml洗涤2次；
[0080] 3)分别加标记抗体（⑶80,⑶83,⑶86) 1 μ 1至终浓度为5mg/L ;阴性对照组加入 FITC标记羊抗鼠 lgG，终浓度为5mg/L ;
[0081] 4) 4°C避光轻度震荡30min，用Iml PBS洗涤2次；
[0082] 5)加入400 μ 11%多聚甲醛进行固定；
[0083] 6) 4°C暗处保存，上机分析。
[0084] 六、CIK细胞的培养。
[0085] 1、CIK单核细胞（PBMC)的分离培养
[0086] 1)用断颈的方法处死C57BL/6(H-2b)小鼠（购自广东省实验动物中心)，用75%乙 醇浸泡数分钟，无菌取脾，用注射器的一端碾磨，过200目铜网，用无菌吸管加入一定体积 PBS稀释，防细胞成团，提高分离效果；
[0087] 2)取50ml离心管，加入Ficoll淋巴细胞分离液，静脉血在距分层液界面上Icm 处沿离心管壁缓慢加到淋巴细胞分离液上，切勿混匀；稀释血与淋巴分离液的柱高之比为 1. 5 :1，且两者总柱高不超过试管2/3 ;
[0088] 3)将离心管置水平离心机内，室温中2000r / min离心20min。离心后，管内可分 为4层：①上层为血浆、大部分血小板和血液稀释液；②下层为粒细胞和红细胞；③中层为 淋巴细胞分离液；④分离液与血浆交界部位的灰白色层为单个核细胞层；
[0089] 4)用毛细吸管轻轻插入灰白色层，沿管壁轻轻吸出灰白色单个核细胞，移入另一 支无菌离心管；
[0090] 5)将所得到PBMC悬液用1倍体积PBS洗涤1次，lOOOr/min离心5min，弃上清；
[0091] 6)再加入2倍体积的PBS洗漆，悬浮细胞，手工计数板计数，1000r/min离心5min, 弃上清，获取底层淋巴细胞；
[0092] 7)用含量5%胎牛血清（FCS) RPMI1640培养液悬浮PBMC，获得终浓度为5x106 / ml的悬浮细胞；
[0093] 8)用台盼蓝染液检查所分离的细胞活性：取2滴细胞悬液加 1滴2%台盼蓝染液， 5min后高倍镜检，死细胞染成蓝色，活细胞不着色，计数200个细胞，计算活细胞百分率，一 般细胞活性应在95%以上。
[0094] 2、CIK细胞的培养
[0095] 将上述细胞以5xl06 / ml加到75cm2的细胞培养瓶中，CIKs中加入IL-Ia、 IFN - γ和抗鼠⑶3抗体各IOul/瓶，24h后补加 IL-210 μ 1/瓶，继续培养，每2天添加与 以前体积等量的培养基，第10天用CD3-PE，CD56-FITC，CD4-FITC，CD8-FITC抗体流式细胞 仪检测其表面标记。
[0096] 3、显微镜下观察DCs，CIKs分离后增殖
[0097] 显微镜下观察DCs细胞增殖成熟情况，有无 DCs细胞典型的树突状形态。如图5所 示，CIKs加入刺激因子培养24?48h开始出现小的克隆团，72h达高峰。如出现大量悬浮 细胞克隆团，需用滴管吹散，并补充培养液。每天观察2次细胞生长情况，根据细胞克隆团 生长情况和培养液颜色补充培养液，该过程不换液，只加液，随着细胞的扩增，传代分瓶。
[0098] 流式细胞仪检测DCs，CIKs表型
[0099] 在分离培养第3天至第8天，使用流式细胞仪技术检测不成熟和成熟DCs、CIKs的 表型。
[0100] 在上述不同时间收集DCs细胞PBS洗涤一次，lOOOr/min离心IOmin收集细胞。每 管IO5个细胞分装5测定管，分别加入抗小鼠的单抗⑶80 (FITC)，⑶83 (FITC)，⑶86 (PE)。 同型对照为鼠 IgG，室温孵育30min。PBS洗涤1次，加入500 μ I PBS上流式细胞仪检测分 析。利用软件分析数据。
[0101] 在上述不同时间收集CIKs细胞PBS洗涤1次，1000r/min离心IOmin收集细胞， 每管IO 5个细胞分装5测定管，分别加入抗小鼠的单抗⑶3 (FITC)/⑶4 (PE)，⑶3 (FITC)/ CD8 (PE)，CD3 (FITC) /CD56 (PE)。同型对照为鼠 IgG，室温孵育30min。PBS洗涤1次，加入 500μ I PBS上流式细胞仪检测分析，利用软件分析数据。
[0102] 流式细胞仪分析CIK的表面分子结果如图6Α所示，表面CIK的表面分子有CD3、 CD4、CD8 和 CD56。
[0103] 4、DCs-CIKs 共培养
[0104] 在培养第9天，分别收集DCs与CIKs，用PBS洗涤2次，lOOOr/min离心IOmin收 集细胞。分别计数DCs与CIKs。将DCs与CIKs混合培养，混合比DCs = CIKs为1 :50-100。 显微镜观察细胞生长情况，流式细胞仪检测共培养细胞表型变化。l〇〇〇r/min离心IOmin 收集细胞，分装4测定管，每管约105个细胞，分别加入鼠抗人的单抗CD3 (FITC) /CD4 (PE)， CD3 (FITC) /CD8 (PE)，CD3 (FITC) /CD56 (PE)。同型对照为鼠 IgG ;室温孵育 30min，PBS 洗涤 2次，加入500 μ I PBS上流式细胞仪检测分析，利用软件分析数据。流式细胞仪分析CIKs 及共培养的DCs-CIKs表型如图6Β所示。
[0105] 结果表明用一组细胞因子可以在体外培养CIKs和DC细胞。DC细胞成熟后其表面 标记分子⑶83和⑶80显著增加，而⑶14则显著减少，但⑶40和⑶86变化不明显。
[0106] 5、SOCSl 表达分析
[0107] (1)实时定量PCR检测SOCSl表达
[0108] DTrizol法提取细胞总RNA (按试剂盒说明书操作）
[0109] 2)逆转录及 Realtime PCR (Super Script First-Strand Synthesis kits， Invitrogen)
[0110] a) RNA变性：65°C变性5min，立即放入冰上冷却；
[0111] b)逆转录：
[0112]
【权利要求】
1. 一种复制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl，其特征在于，该制缺陷性重组腺病毒 rAd-RNAi-SOCSl表达如下序列的双链RNA : 5 ' -GATCCCTACCTGAGTTCCTTCCCCTTCAAGAGAGGGGAAGGAACTCAGGTAGTTTTTTG-3 ' ； 5 ' -AATTCAAAAAACTACCTGAGTTCCTTCCCCTCTCTTGAAGGGGAAGGAACTCAGGTAGG-3 '。
2. 如权利要求1所述的复制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl，其特征在于，所述复 制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl的表达系统为Adeno-X。
3. 如权利要求1所述的复制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl，其特征在于，所述复 制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl感染树突状细胞（DCs)，并使DCs内的S0CS1表达沉 默。
4. 如权利要求1所述的复制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl，其特征在于，所述复 制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl的病毒滴度为2. 5-2. 8X107pfu/ml。
5. 如权利要求1所述的复制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl，其特征在于，所述复 制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl感染DCs后，用合成的HPV16E7. 49-57表位多肽脉冲 被腺病毒感染的DCs，用TNF-a使DCs成熟，与自身外周血体外扩增的CIK细胞继续共培养 后一周回输体内，对肿瘤细胞进行特异性杀伤。
6. 如权利要求1所述的复制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl，其特征在于，所述复 制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl感染DCs后，与免疫效应细胞CTL、NK、y S T和TIL 细胞联合使用治疗肿瘤。
7. 如权利要求1-6任一项所述的复制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl，其特征在 于，所述复制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl的制备方法如下： 1) 将所述双链RNA的编码DNA插入Adeno-X表达系统的RNAi-Ready pSIRN-Shuttle 的多克隆位点，得到重组表达载体RNAi-SOCSl-pShuttle ; 2) 用PI-Sce I与I-Ceu I双酶切所述重组表达载体RNAi-SOCSl-pShuttle，将得到的 含有所述双链RNA的编码DNA的酶切片段与Adeno-X表达系统的Adeno-X病毒DNA连接， 将得到的连接产物转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，得到重组腺病毒DNA，再将该重组腺病 毒DNA转染HEK293细胞，得到复制缺陷型重组腺病毒。
8. 如权利要求1-6任一项所述的复制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl在治疗肿瘤 中的用途。
9. 如权利要求1-6任一项所述的复制缺陷性重组腺病毒rAd-RNAi-SOCSl在治疗宫颈 癌中的用途。
【文档编号】C12N15/66GK104388466SQ201310585973
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2013年11月20日 优先权日:2013年11月20日
【发明者】都会, 郑义, 李智龙 申请人:深圳市金佳禾生物医药有限公司