检测番茄溃疡病菌的交叉引物恒温扩增试剂盒及专用引物的制作方法

检测番茄溃疡病菌的交叉引物恒温扩增试剂盒及专用引物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了检测番茄溃疡病菌的交叉引物恒温扩增试剂盒及专用引物。本发明提供了检测或辅助检测番茄溃疡病菌的交叉引物恒温扩增引物组，由置换引物F3、置换引物B3、正向检测引物DF5B、反向检测引物DF5F、交叉引物CPR1、交叉引物CPR2和交叉引物CPR3组成；本发明的实验证明，本发明提供了检测番茄溃疡病菌的交叉引物恒温扩增引物，以样品基因组DNA或菌液为模板，利用上述引物进行恒温扩增，反应结束后利用封闭式的胶体金标记DNA检测装置即可直接进行结果判定。本发明特异性好，准确性高，灵敏度高，操作简便快速，为进出口安全提供了保证。
【专利说明】检测番茄溃疡病菌的交叉引物恒温扩增试剂盒及专用引物
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及检测番茄溃疡病菌的交叉引物恒温扩增试剂盒及专用引物。
【背景技术】
[0002]番爺溃瘍病(Bacterialcanker and wilt of tomato)是番爺(LycopersiconescuLentum Mill)生产中最为严重的一种毁灭性病害，该病病原为密执安棒形菌密执安亚种 Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis,简称Cmm,该病菌主要随带菌种子、病残体、土壤等传播。自1909年在美国密歇根州发现番茄溃疡病以来，逐渐在多个国家广泛分布，给大田和温室番茄生产区造成了巨大的经济损失，成为世界各国关注的重点病害。目前多个国家将其列为检疫性有害生物，欧洲和地中海植物保护组织(EPPO)于1982年将番茄溃疡病菌列为A2类检疫性有害生物，欧盟植物检疫法规中也明确列出该病菌为出入境检疫性有害生物，我国于2007年将其列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。
[0003]目前已有多种方法用于番茄溃疡病菌的检测，例如脂肪酸甲酯分析法、噬菌体定型法、血清学检测法。由于脂肪酸甲酯分析法和噬菌体定型法在实际检测中存在局限性，目前应用较少。血清学检测技术在番茄溃疡病菌检测中应用比较广泛，灵敏度较高、特异性较好，但很容易出现假阳性，实验结果可靠性低，需要相应病原菌的特异性抗体，测定过程均比较繁琐，限定了血清学方法在番茄溃疡病菌检测中的进一步推广应用。与脂肪酸甲酯分析法、噬菌体定型法以及血清学检测技术相比，利用分子生物学技术检测番茄溃疡病菌具有快速、灵敏度高、特异性强等特点。目前多种分子生物学方法也逐渐应用于番茄溃疡病菌的检测与鉴定。

【发明内容】

[0004]本发明的一个目的是提供检测或辅助检测番茄溃疡病菌的交叉引物恒温扩增引物组。
[0005]本发明提供的引物组，由置换引物F3、置换引物B3、正向检测引物DF5B、反向检测引物DF5F、交叉引物CPRl、交叉引物CPR2和交叉引物CPR3组成；
[0006]所述置换引物F3的核苷酸序列为序列表中的序列I ;
[0007]所述置换引物B3的核苷酸序列为序列表中的序列2 ；
[0008]所述正向检测引 物DF5B的核苷酸序列为序列表中的序列3 ；
[0009]所述反向检测引物DF5F的核苷酸序列为序列表中的序列4 ；
[0010]所述交叉引物CPRl的核苷酸序列为序列表中的序列5 ；
[0011]所述交叉引物CPR2的核苷酸序列为序列表中的序列6 ；
[0012]所述交叉引物CPR3的核苷酸序列为序列表中的序列7。
[0013]上述引物组中，所述正向检测引物DF5B的5’末端标记生物素；[0014]所述反向检测引物DF5F的5’末端标记FITC。
[0015]上述弓丨物组中，所述置换引物F3、置换引物B3、正向检测弓丨物DF5B、反向检测弓丨物DF5F、交叉引物CPRl、交叉引物CPR2和交叉引物CPR3的摩尔比为1:1:1:3:8:8:8。
[0016]本发明的的另一个目的是提供检测或辅助检测番茄溃疡病菌的交叉引物恒温扩增试剂。
[0017]本发明提供的交叉引物恒温扩增试剂，由上述的引物组、扩增缓冲液、dNTP、DNA聚合酶、MgSO4和水组成；
[0018]所述置换引物F3和所述置换引物B3在所述扩增试剂中的终浓度均为0.1 μ mol/L ；
[0019]所述正向检测引物DF5B在所述扩增试剂中的终浓度为0.1 μ mol/L ；
[0020]所述反向检测引物DF5F在所述扩增试剂中的终浓度为0.3 μ mol/L ；
[0021]所述交叉引物CPRl、所述交叉引物CPR2和所述交叉引物CPR3在所述扩增试剂中的终浓度均为0.8 μ mol/L。
[0022]上述扩增缓冲液为10 X反应缓冲液，DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，均购自NEB(北京)有限公司)。
[0023]本发明的第三个目的是提供检测或辅助检测番茄溃疡病菌的交叉引物恒温扩增试剂盒。
[0024]本发明提供的 试剂盒，包括上述的引物组或上述扩增试剂。
[0025]上述的引物组或上述扩增试剂或上述试剂盒在检测和/或辅助检测待测样品是否感染番茄溃疡病菌中的应用也是本发明保护的范围。
[0026]本发明的第四个目的是提供一种检测和/或辅助检测待测样品是否感染番茄溃疡病菌的方法。
[0027]本发明提供的方法，包括如下步骤:用上述的引物组或上述扩增试剂或上述试剂盒对所述待测样品进行交叉引物恒温扩增，得到扩增产物；
[0028]用荧光标记核酸试纸条检测试剂盒检测扩增产物，观察试纸条，
[0029]若检测条带和质控条带均显色,则待测样品感染或候选感染番爺溃瘍病菌；
[0030]若质控条带显色而检测条带不显色，则待测样品未感染或候选未感染番茄溃疡病菌。
[0031]上述荧光标记核酸试纸条检测试剂盒(利用荧光标记生物素和FITC检测)为一次性核酸检测装置，购自杭州优思达生物技术有限公司，D001-03。
[0032]上述方法中，所述交叉引物恒温扩增反应条件为58°C，60min。
[0033]上述方法中，所述交叉引物恒温扩增的模板为待测样品的基因组DNA或者待测样品的菌体本身。
[0034]本发明的实验证明，本发明提供了检测番茄溃疡病菌的交叉引物恒温扩增引物，以样品基因组DNA或菌液为模板，利用上述引物进行恒温扩增，反应结束后利用封闭式的胶体金标记DNA检测装置即可直接进行结果判定。本发明特异性好，准确性高，灵敏度高，操作简便快速，为进出口安全提供了保证。
【专利附图】

【附图说明】[0035]图1为运用交叉引物恒温扩增检测番茄溃疡病菌灵敏度的测试实验结果
[0036]图2为运用交叉引物恒温扩增检测番茄溃疡病菌特异性的测试实验结果
[0037]图3为运用交叉引物恒温扩增技术对发病番茄植株中番茄溃疡病菌检测的代表性实验结果
【具体实施方式】
[0038]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0039]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0040]下述实施例中:
[0041]番爺溃瘍病菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis, Cmm)记载在如下文献中(Dreier J, Bermpohl A, Eichenlaub R.1995.Southern hybridization andPCR for specific detection of phytopathogenic Clavibacter michiganense subsp.michiganense[J].Phytopathology, 85:462-268.公众可从中国检验检疫科学研究院获得。
[0042]Burkholderia gladioli (N0.5)记载在如下文献中 Specific OligonucleotidePrimers Based on Sequences of thel6S_23S rDNA Spacer Region for the Detectionof Burkholderia gladioli by PCR，Journal of General Plant Pathology, August2002，Volume68，Issue3，pp220_224，公众可从中国检验检疫科学研究院获得；
[0043]Erwinia chrysanthemi (N0.6)记载在如下文献中 Chemotaxes of ErwiniaCarotovora Subsp.Carotovora and Erwinia Chrysanthemi, Plant PathogenicBacteria， Current Plant Science and Biotechnology in AgricultureVolume4, 1987，p256，公众可从中国检验检疫科学研究院获得；
[0044]Pantoea agglomerans formerly erwinia herbicola(N0.7)记载在如下文献中 Genotypic comparison ofPantoea agglomeransplant and clinical strains， BMCMicrobiology，September2009，9:204，公众可从中国检验检疫科学研究院获得；
[0045]Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum (N0.8)记载在如下文献中An easy, simple inexpensive test for the specific detection of Pectobacteriumcarotovorum subsp.carotovorum basedon sequence analysis of the pmrA gene，BMCMicrobiology，July2013，13:176，公众可从中国检验检疫科学研究院获得；
[0046]Pseudomonas syringae pv.tomato(N0.9)记载在如下文献中 Biocontrolactivity of Bacillus against a GFP—marked Pseudomonas syringae pv.tomato ontomato phylloplane，Australasian Plant Pathology, November2013, Volume42, Issue6,pp643-65，公众可从中国检验检疫科学研究院获得。
[0047]实施例1、交叉引物恒温扩增引物的设计和合成
[0048]根据番茄溃疡病菌ITS序列设计了 7条引物，引物序列为:
[0049]F3:5，-CAAGTCACGCGTCAGGCG-3’(序列 I)
[0050]B3:5，-TGCAACATGCCCTCGACAC-3，(序列 2)
[0051]DF5B:5，-B10TIN-GCTCATGGGTGGAACATTGA-3’(序列 3)
[0052]DF5F:5，-FITC-CATTGATGCCGGCTGATGT-3，(序列 4) [0053]CPRl: 5，-GCTCATGGGTGGAACATTGATTCAAGGAGGCGTACTAGCAGC-3 ’(序列 5 )[0054]CPR2:5 ’ -GCTCATGGGTGGAACATTGATTAAGGAGGCGTACTAGCAGC-3，(序列 6 )
[0055]CPR3:5，-GCTCATGGGTGGAACATTGATTAGGAGGCGTACTAGCAGC-3 ’(序列 7 )
[0056]其中F3和B3为置换引物，CPRl、CPR2、CPR3分别为交叉引物，DF5B为正向检测引物，5’端生物素标记，DF5F为反向检测引物，5’端FITC标记。
[0057]实施例2、交叉引物恒温扩增引物在检测待测病菌中的应用
[0058]1、交叉引物恒温扩增方法的建立
[0059]提取番茄溃疡病菌的总DNA作为模板，在如下20 μ I反应体系中进行扩增。
[0060]20 μ I的交叉引物恒温扩增反应(CPA)体系:终浓度均为0.8 μ mol/L交叉引物CPRU CPR2、CPR3 ;终浓度为0.1 μ mol/L正向检测引物DF5B (5端生物素标记)，终浓度为
0.3 μ mol/L反向检测引物DF5F (5端FITC标记)，终浓度均为0.1 μ mol/L的置换引物F3和B3，终浓度为0.4mmol/L的dNTP (宝生物工程(大连)有限公司)，2μ IlOX反应缓冲液(NEB (北京)有限公司)，终浓度均为8U的Bst DNA聚合酶(NEB (北京)有限公司)，终浓度均为2mmol/L的MgSO4,以及2 μ I的总DNA，其余用水补足体系。
[0061]上述交叉引物恒温扩增反应条件为58°C，60min。
[0062]得到的扩增产物通过荧光标记核酸试纸条检测试剂盒(一次性核酸检测装置，杭州优思达生物技术有限公司，D001-03)进行结果判读。
[0063]通过观察试纸条的检测条带(T)和质控条带(C)是否显色进行结果判读。
[0064]若检测条带和质控条带均显色`，结果为阳性；
[0065]若质控条带显色，而检测条带不显色，结果为阴性；
[0066]若质控条带没有显色时，判断检测过程有误。
[0067]因此，得到番茄溃疡病菌的扩增产物的检测条带和质控条带均显色。
[0068]2、交叉引物扩增方法灵敏度确定
[0069]经平板培养计数定量的番茄溃疡病菌菌悬液(1.32 X 108cfu/mL)进行十倍梯度稀释。分别取2μ I各梯度的番茄溃疡病菌菌悬液作为模板，按照上述I中的方法进行扩增、检测。
[0070]结果如图1 所 ^,1:1.32X 108cfu/mL;2:l.32X 107cfu/mL; 3:1.32XlO6Cfu/mL;4:l.32X 105cfu/mL;5:l.32X 104cfu/mL;6:1.32X 103cfu/mL;CK:阴性对照；可以看出，
1.32X 104cfu/ml浓度以上菌液可以观察到检测条带及质控条带,而1.32X 103cfu/ml浓度只有质控条而无检测条带，故判定该方法的灵敏度为1.32X 104cfU/ml，因每个反应中加入2 μ I,经换算最低灵敏度为26.4个细菌。
[0071]采用常规方法进行对照，具体如下:
[0072]分别取Iul梯度稀释的浓度为1.32X IO8-L 32X101cfu/mL的番茄溃疡病菌菌液作为模板，利用番茄溃疡病引物对:cmm-S/cmmKS' -GCGAATAAGCCCATATCAA-3' /5' -CGTCAGGAGGTCGCTMTA-3')进行PCR扩增，取5ulPCR产物进行凝胶电泳，灵敏度达到1.32X IO6 ；利用番茄溃疡病引物对 TSA-VPSA-1KS' -TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3' /5 ’-TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3’ )进行PCR扩增，取5ulPCR产物进行凝胶电泳，灵敏度达到1.32 X IO60
[0073]因此，本发明的方法检测番茄溃疡病菌不仅快速方便，且灵敏度明显优于普通PCR法检测结果。
[0074]3、特异性检测[0075]用番爺溃瘍病菌Cmm、Burkholderia gladioli (N0.5)、Erwinia chrysanthemi (N0.6)、Pantoea agglomerans formerly erwinia herbicola (N0.7) > Pectobacterium carotovorumsubsp.carotovorum (N0.8) >Pseudomonas syringae pv.tomato (N0.9) 6 种细菌菌株接种至营养琼脂培养基(NA)上进行活化，26°C恒温培养48h，以获取单菌落。利用平板划线法进行纯化培养。用接种环挑取目标菌株的单个典型菌落，接种于营养肉汤培养基(NB)上，于28°C，200rpm恒温摇床上培养10-14h，目测菌液浓度达到108cfu/mL左右时停止培养，收集培养液作为交叉引物恒温扩增反应的模板。
[0076]按照上述I中的方法进行扩增、检测。
[0077]结果如图2所不,1:番爺溃瘍病菌Cmm; 2:Burkholderia gladioli (N0.5) ; 3:Erwiniachrysanthemi (N0.6) ;4:Pantoea agglomerans formerly erwinia herbicola(N0.7) ;5:Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum(N0.8);6:Pseudomonassyringae pv.tomato (N0.9) ; CK:空白对照路；
[0078]可以看出，I号菌可以观察到检测条带及质控条带，为阳性；而其余均有质控条而无检测条带，均呈阴性；故判定该方法能特异检测Cmm，说明本试验设计的CPA检测方法具有较高的特异性。
[0079]实施例3、发病番茄带菌检测
[0080]分别提取6份发病番茄(已知感染了番茄溃疡病菌，表现为叶边缘坏死、叶片萎蔫等局部症状)叶片和5份健 康番茄叶片的DNA作为模板，按照实施例2的I中的方法进行扩增、检测。
[0081]结果如图3所示，I为感染了番茄溃疡病菌的番茄叶片DNA ；2:健康番茄叶片DNA ；CK:空白对照，可以看出，6份发病番茄样本可以观察到检测条带(T)及质控条带(C)，5份健康番爺样本仅观察到质控条带(C)而无检测条带。
[0082]说明本发明的引物和方法可以用来检测待测样本是否发番茄溃疡病或者感染番茄溃疡病菌。
【权利要求】
1.检测或辅助检测番茄溃疡病菌的交叉引物恒温扩增引物组，由置换引物F3、置换引物B3、正向检测引物DF5B、反向检测引物DF5F、交叉引物CPR1、交叉引物CPR2和交叉引物CPR3组成； 所述置换引物F3的核苷酸序列为序列表中的序列I ; 所述置换引物B3的核苷酸序列为序列表中的序列2 ； 所述正向检测引物DF5B的核苷酸序列为序列表中的序列3 ； 所述反向检测引物DF5F的核苷酸序列为序列表中的序列4 ； 所述交叉引物CPRl的核苷酸序列为序列表中的序列5 ； 所述交叉引物CPR2的核苷酸序列为序列表中的序列6 ； 所述交叉引物CPR3的核苷酸序列为序列表中的序列7。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于: 所述正向检测引物DF5B的5’末端标记生物素； 所述反向检测引物DF5F的5’末端标记FITC。
3.根据权利要求1或2所述的引物组，其特征在于: 所述置换引物F3、置换引物B3、正向检测弓丨物DF5B、反向检测弓丨物DF5F、交叉引物CPR1、交叉引物CPR2和交叉引物CPR3的摩尔比为1: 1: 1:3:8:8:8?`
4.检测或辅助检测番茄溃疡病菌的交叉引物恒温扩增试剂，由权利要求1-3中任一所述的引物组、扩增缓冲液和水组成； 所述置换引物F3和所述置换引物B3在所述扩增试剂中的终浓度均为0.1 μ mol/L ； 所述正向检测引物DF5B在所述扩增试剂中的终浓度为0.1 μ mol/L ； 所述反向检测引物DF5F在所述扩增试剂中的终浓度为0.3 μ mol/L ； 所述交叉引物CPR1、所述交叉引物CPR2和所述交叉引物CPR3在所述扩增试剂中的终浓度均为0.8 μ mol/L。
5.检测或辅助检测番茄溃疡病菌的交叉引物恒温扩增试剂盒，包括权利要求1-3中任一所述的引物组或权利要求4所述扩增试剂。
6.权利要求1-3中任一所述的引物组或权利要求4所述扩增试剂或权利要求5所述试剂盒在检测和/或辅助检测待测样品是否感染番茄溃疡病菌中的应用。
7.—种检测和/或辅助检测待测样品是否感染番茄溃疡病菌的方法，包括如下步骤:用权利要求1-3中任一所述的引物组或权利要求4所述扩增试剂或权利要求5所述试剂盒对所述待测样品进行交叉引物恒温扩增，得到扩增产物； 用荧光标记核酸试纸条检测试剂盒检测扩增产物，观察试纸条， 若检测条带和质控条带均显色，则待测样品感染或候选感染番爺溃瘍病菌； 若质控条带显色而检测条带不显色，则待测样品未感染或候选未感染番爺溃瘍病菌。
8.根据权利要求9所述方法，其特征在于: 所述交叉引物恒温扩增反应条件为58°C，60min。
9.根据权利要求8或9所述方法，其特征在于:所述交叉引物恒温扩增的模板为待测样品的基因组DNA或者待测样品的菌体本身。
【文档编号】C12N15/11GK103820554SQ201410068749
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年2月27日 优先权日:2014年2月27日
【发明者】牟海青, 田茜, 赵文军, 张祥林, 熊玉芬, 张永江 申请人:中国检验检疫科学研究院