鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试剂盒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试剂盒，该试剂盒包含：针对鸭坦布苏病毒强毒株SEQIDNO:1序列设计的上游引物P1，该P1的3’末端倒数第一个碱基与SEQIDNO:1第1454位碱基相同，其3’末端倒数第二个碱基与SEQIDN0:1第1453位碱基相同；针对鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株SEQIDNO：2序列设计的上游引物P2，该P2的3’末端倒数第二个碱基与SEQIDNO：2第1891位碱基相同；针对SEQIDNO:1或SEQIDNO：2序列第1971?10991位核苷酸序列设计的通用下游引物P3。本发明的试剂盒，可快速、简便、准确地区分鸭坦布苏病毒自然感染强毒和弱毒疫苗免疫毒株，其特异性强、灵敏度高、重复性好，对于鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株的临床广泛应用具有重要意义。
【专利说明】鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及鸭坦布苏病毒检测【技术领域】，具体涉及一种鉴别鸭坦布苏病毒强毒株 和弱毒疫苗株的试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 2010年4月以来，我国上海、浙江、江苏等地发生了以肉鸭生长迟缓和蛋鸭产蛋 急剧下降为特征的一种传染病，短短几个月时间里，南方各省几乎所有的蛋鸭场都受到了 该病的侵袭，给养鸭业造成了巨大的经济损失。国内的研究者通过病毒分离鉴定，病毒基 因组序列分析，动物回归试验等实验证明该传染病是由一种新的黄病毒--鸭坦布苏病毒 (Duck Tembusu virus，DTMUV)所引起，该病毒属于黄病毒属Ntaya病毒群。鸭感染该病毒 后，主要的临床症状表现为高热、沉郁、厌食等；蛋鸭出现产蛋量急剧下降甚至停止，肉鸭出 现生长迟缓，其主要病变为，脾脏肿大明显，产蛋鸭卵泡出血、变性、破裂。鸭坦布苏病毒病 自2010年在华东部分地区首次发生后，迅速传播到浙江、安徽、福建、江苏等省份的主要水 禽养殖场，之后传播到广东、山东、河南、河北等省市，到目前为止全国大部分主要水禽养殖 地区均已受到该病的威胁。
[0003] 鸭坦布苏病毒病在中国大陆首次发生，该病具有高度传染性，并且一年四季都可 流行，给鸭坦布苏病毒病的防控带来了极大的困难。鸭坦布苏病毒是新发病毒，对于该病 毒的流行性病学、致病机理、传播媒介等方面的相关研究较少，对该病的防控难度较大，目 前预防该病最有效的方法是疫苗免疫。在之前的研究中，本实验室将一株鸭坦布苏病毒分 离株在鸡胚成纤维细胞上连续传代培养并克隆纯化，获得了致病力减弱的毒株，雏鸭感染 试验表明，随着传代次数的增加，病毒的致病力逐渐降低，其中，传代培养的第180代病毒 (FX2010-180P株）对鸭不致病，并且具有很好的免疫原性，可以作为鸭坦布苏病毒病活疫 苗的候选毒株，与强毒株（FX2010)相比，鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株（FX2010-180P株）有34 个核苷酸发生突变，上述内容已在中国专利申请CN2012102792326中公开。鸭坦布苏病毒 弱毒疫苗株（FX2010-180P株）作为鸭坦布苏病毒活疫苗，已经申请临床试验。在该鸭坦布 苏病毒弱毒疫苗株（FX2010-180P株）生产和临床应用时，建立一种能够区分鸭坦布苏病毒 弱毒疫苗株（FX2010-180P株）与临床上流行强毒株的方法是急需的。目前，区分鸭坦布苏 病毒强、弱毒株的方法只能通过序列分析来实现。序列分析首先要分别扩增出强、弱毒株特 征性的基因片段，然后通过克隆技术把目的片段连接到载体上，获得含有目的片段的质粒， 然后进行测序分析；或者回收纯化扩增产物，然后再进行测序分析。但是，序列分析方法繁 琐、费时，不利于实现对鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的及时、快速鉴别诊断。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决目前还不能快速、高效地鉴别诊断鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗 株的技术问题，提供一种鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试剂盒，该试剂盒可快 速、简便、准确地区分鸭坦布苏病毒自然感染强毒和弱毒疫苗免疫毒株，其特异性强、灵敏 度高、重复性好。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
[0006] 在本发明的一个方面，提供了一种鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试剂 盒，所述试剂盒包含：
[0007] 针对鸭坦布苏病毒强毒株SEQ ID NO :1所示基因序列设计的特异性上游引物P1， 该上游引物Pl的3'末端倒数第一个碱基与SEQ ID NO :1第1454位碱基相同，该Pl的3' 末端倒数第二个碱基与SEQ ID NO :1第1453位碱基相同；
[0008] 针对鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株SEQ ID NO :2所示基因序列设计的特异性上游引物 P2,该上游引物P2的3'末端倒数第二个碱基与SEQ ID NO :2第1891位碱基相同；
[0009] 针对所述SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2序列第1971?10991位核苷酸序列设计 的通用下游引物P3。
[0010] 在本发明的另一方面，还提供了一种鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试 剂盒，所述试剂盒包含：
[0011] 针对鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株SEQ ID NO :2所示基因序列设计的特异性上游引物 P1，该上游引物Pl的3'末端倒数第一个碱基与SEQ ID NO :2第1454位碱基相同，该Pl的 3'末端倒数第二个碱基与SEQ ID NO :2第1453位碱基相同；
[0012] 针对鸭坦布苏病毒强毒株SEQ ID NO :1所示基因序列设计的特异性上游引物P2， 该上游引物P2的3'末端倒数第二个碱基与SEQ IDNO :1第1891位碱基相同；
[0013] 针对所述SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2序列第1971?10991位核苷酸序列设计 的通用下游引物P3。
[0014] 优选的，所述上游引物P2的3'末端倒数第一个碱基为人工引入的错配碱基，该 错配碱基与鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的基因序列均不互补。在引物P2的3'末端 人工引入错配碱基，可提高鉴别检验方法的特异性。
[0015] 更优选的，所述上游引物Pl的序列如SEQ ID NO :3所示，上游引物P2的序列如 SEQ ID NO :4所示，下游引物P3的序列如SEQ ID NO :5所示。
[0016] 更优选的，所述上游引物Pl的序列如SEQ ID NO :6所示，上游引物P2的序列如 SEQ ID NO :7所示，下游引物P3的序列如SEQ ID NO :5所示。
[0017] 所述试剂盒还包含：RT-PCR反应缓冲液、反转录酶、聚合酶。
[0018] 优选的，所述试剂盒用于检测样品时的PCR退火温度为54?59°C。
[0019] 在本发明的另一方面，还提供了一种检测鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的引 物，该引物包括：
[0020] 针对鸭坦布苏病毒强毒株SEQ ID NO :1所示基因序列设计的特异性上游引物P1， 该上游引物Pl的3'末端倒数第一个碱基与SEQ ID NO :1第1454位碱基相同，该Pl的3' 末端倒数第二个碱基与SEQ ID NO :1第1453位碱基相同；
[0021] 针对鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株SEQ ID NO :2所示基因序列设计的特异性上游引物 P2,该上游引物P2的3'末端倒数第二个碱基与SEQ ID NO :2第1891位碱基相同；
[0022] 针对所述SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2序列第1971?10991位核苷酸序列设计 的通用下游引物P3。
[0023] 在本发明的另一方面，还提供了一种检测鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的引 物，该引物包括：
[0024] 针对鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株SEQ ID NO :2所示基因序列设计的特异性上游引物 P1，该上游引物Pl的3'末端倒数第一个碱基与SEQ ID NO :2第1454位碱基相同，该Pl的 3'末端倒数第二个碱基与SEQ ID NO :2第1453位碱基相同；
[0025] 针对鸭坦布苏病毒强毒株SEQ ID NO :1所示基因序列设计的特异性上游引物P2， 该上游引物P2的3'末端倒数第二个碱基与SEQ IDNO :1第1891位碱基相同；
[0026] 针对所述SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2序列第1971?10991位核苷酸序列设计 的通用下游引物P3。
[0027] 在本发明的另一方面，还提供了上述鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试 剂盒在制备区分鸭坦布苏病毒自然感染强毒株和弱毒疫苗株的产品中的应用。
[0028] 在本发明的另一方面，还提供了上述鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试 剂盒在制备快速鉴定鸭坦布苏病毒的广品中的应用。
[0029] 本发明鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试剂盒，具有特异性强、灵敏度 高的特点，不仅能快速鉴定出鸭坦布苏病毒，而且还能快速、准确地区分鸭坦布苏病毒自然 感染野毒株和弱毒疫苗免疫毒株，对于鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株（FX2010-180P株）的临床 广泛应用具有重要意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0030] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0031] 图1是本发明实施例1引物及限制酶酶切位点在鸭坦布苏病毒基因组中的位置及 各毒株在此区域的比较图；
[0032] 图2是本发明实施例1用引物对SEQ ID NO :3 / SEQ ID NO :4 / SEQ ID NO :5在 不同退火温度下对鸭坦布苏病毒强毒、弱毒株基因组进行扩增的结果图；
[0033] 图3是本发明实施例1用引物对SEQ ID NO :6 / SEQ ID NO :7 / SEQ ID NO :5在 不同退火温度下对鸭坦布苏病毒强毒、弱毒株基因组进行扩增的结果图；
[0034] 图4是本发明实施例2鸭坦布苏病毒强、弱毒株在不同含量病毒液条件下进行扩 增的结果图；
[0035] 图5是本发明实施例3的RT-PCR检测不同鸭源病毒基因组的结果图；
[0036] 图6是本发明实施例4的鸭坦布苏病毒强、弱毒株RT-PCR产物的酶切分析结果 图；
[0037] 图7是本发明实施例5的RT-PCR检测弱毒疫苗株病毒液和强毒感染鸭卵巢组织 的结果图。
【具体实施方式】
[0038] 下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验 指南》（萨姆布鲁克J，拉塞尔D W，著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.分子克隆实验指南， 第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。
[0039] 下面通过具体实施例阐述本发明。
[0040] 材料：
[0041] 1 ?试剂
[0042] RNAiso Plus、M-MLV反转录酶、DL2000DNA分子量标准购自宝生物工程（大连）有 限公司；PCRMix购自广州东盛生物科技有限公司；氯仿、异丙醇、75%乙醇（用DEPC处理过 的水配制）、无RNase的水。
[0043] 2?病毒和细胞
[0044] 鸭坦布苏病毒强毒株（FX2010株）和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株（FX2010-180P 株），病毒滴度为IO 5 5TCID5tl / 0.1ml。DF-I细胞由中国农科院上海兽医研究所保存，用含 有10%犊牛血清和适量抗生素的DMEM培养基（Gibco BRL公司）在37°C、5% CO2的培养 箱中培养。
[0045] 实施例1鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的引物设计和PCR条件的确定
[0046] (1)引物设计及合成
[0047] 把GenBank中公布的鸭坦布苏病毒BYD-I株、FS株、ALD株、JM株、JS804株、ZJ-6 株和SD株等8株鸭坦布苏病毒强毒株和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株（FX2010-180P株）的基 因组序列进行比较分析，设计3条引物。其中，P1 (5' -CTGAAACATGCCGCYAGA-3'，Y=C / T. SEQ ID NO :3)为鸭坦布苏病毒强毒株（FX2010)特异性上游引物，P2(5' -GTGTAGTAATAC ATTTTCCCTAGCA-3'，SEQ ID NO :4)为鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株（FX2010-180P株）特异性 上游引物，P2引物3'末端的碱基"A"既不是强毒序列也不是弱毒序列，加"A"是为了提高 鉴别检验方法的特异性，P3(5' -CCGAAAACCTGATGAATGC-3'，SEQ IDN0:5)是强、弱毒株通 用的下游引物（图1)。Pl / P3和P2 / P3预期能分别特异性地扩增鸭坦布苏病毒强毒株 (FX2010)和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株（FX2010-180P株），扩增产物分别为860bp和429bp。 在扩增片段的序列中，Sail限制酶酶切位点是强、弱毒株都有的，而BglII限制酶酶切位点 是强毒株特异的（图1)。引物由上海英俊生物有限公司合成。
[0048] 上述PI、P2引物的设计原理是利用鸭坦布苏病毒强毒株（FX2010)SEQ ID NO :1 基因序列和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株（FX2010-180P株）SEQ ID N0:2基因序列在第1453、 1454、1891位碱基存在差别，设计包含SEQ ID NO :1序列第1453、1454位碱基的上游引物 Pl和包含SEQ ID NO :2序列第1891位碱基的上游引物P2,然后在SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2序列第1971?10991位核苷酸序列中设计通用的下游引物P3,这样Pl / P3和P2 / P3能分别扩增出鸭坦布苏病毒强毒株（FX2010)和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株（FX2010-180P 株）的特异性片段；同样，也可以设计包含SEQ ID NO :2序列第1453、1454位碱基的上游 引物Pl (例如SEQ ID NO :6)和包含SEQ ID NO :1序列第1891位碱基的上游引物P2 (例 如SEQ ID NO :7)，再在SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2序列第1971?10991位核苷酸序列 中设计通用的下游引物P3,该Pl / P3和P2 / P3能分别扩增出鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株 (FX2010-180P株）和鸭坦布苏病毒强毒株（FX2010)的特异性片段，同样能将鸭坦布苏病毒 强毒株和弱毒疫苗株区分开。
[0049] (2)样品的处理
[0050] 对于组织样品，每克组织加ImllOX双抗无菌PBS，进行研磨，然后12000rpm，4°C离 心10min，取上清备用。对于细胞培养的病毒液样品可直接用于RNA的提取。
[0051] (3)病毒RNA的提取
[0052] 按照RNAiso Plus说明书提取病毒RNA。
[0053] 1)取样品0? 1ml，移入一个盛有0? 3ml RNAiso Plus的eppendorf离心管中，用移 液枪反复吹打至组织完全裂解，液体基本澄清。室温静置5min，每管加入0. 08ml氯仿，剧烈 摇动 15sec，静置 3min。12000g4°C离心 lOmin。
[0054] 2)小心吸取上清夜置于另一无菌的新eppendorf离心管中，加入0? 4ml异丙醇，室 温静止 lOmin，12000g4°C离心 lOmin。
[0055] 3)弃上清，用Iml现配的75%乙醇清洗沉淀，7500g4°C离心5min。弃上清，让沉淀 在室温自然干燥（5-10min)。
[0056] 4)每管用20 ii L无Rnase的DEPC水重悬溶解。
[0057] (4)反转录合成cDNA
[0058] 用M-MLV反转录酶反转录合成cDNA :取总RNA5 ii L，加入引物P34ii L(40pmol)， 置65 °C IOmin后，迅速冰浴2min，然后依次加入MLV缓冲液4 ii L、DEPC水3 ii L、 dNTPMix(10mmol)2ii L、RRIl ii L(40U)、MLVl ii L(200U)。置 30 °C 10min、42 °C lh，然后 70 °C 15min〇
[0059] (5) PCR
[0060] 使用PCRMix试剂，在25 ii L反应体系中，分别加入PCRMixl2. 5 ii L、上游引 物 Pl (SEQ ID NO :3)和 P2 (SEQ ID NO :4)各 I ii L(IOpmol)，下游引物 P3 (SEQ ID NO : 5) I ii L(IOpmol)、反转录产物2 ii L，超纯水7. 5 ii L。PCR程序为：95°C预变性3min ;95°C变 性30s、54?59°C退火30s、72°C延伸lmin，35个循环；72°C延伸10min。PCR产物用1%的 琼脂糖凝胶电泳检测。
[0061] (6) RT-PCR退火温度的确定
[0062] 取鸭坦布苏病毒强毒株（FX2010株）和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株（FX2010-180P 株），分别稀释为IO 5ciTCID5tl / 0.1ml，然后按照上述（2)?（4)的方法进行试验，确定 RT-PCR方法的退火温度。
[0063] 结果：
[0064] 1)以引物对 Pl / P2 / P3(SEQ ID NO :3 / SEQ ID NO :4 / SEQ ID NO :5) 在不同退火温度分别扩增鸭坦布苏病毒强毒株（FX2010)和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株 (FX2010-180P)。结果显示，对于弱毒疫苗株（FX2010-180P)，退火温度在54?59°C扩增 时，都只出现1条特异的目的条带。对于强毒株（FX2010)，退火温度在54?59°C扩增时， 也只出现1条特异的目的条带。考虑到PCR的特异性以及扩增效率，选用56°C作为鉴别诊 断RT-PCR的退火条件（图2)。图2中，1?6 :鸭坦布苏病毒弱毒株（FX2010-180P，退火 温度54?59°C ) ;7 :DL2000DNA Marker ;8?13 :鸭坦布苏病毒强毒株（FX2010,退火温度 59 ?54°C )。
[0065] 2)以引物对 Pl / P2 / P3(SEQ ID NO :6 / SEQ ID NO :7 / SEQ ID NO :5)在 不同退火温度分别扩增鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株（FX2010-180P)和鸭坦布苏病毒强毒株 (FX2010)。结果显示，对于弱毒疫苗株（FX2010-180P)，退火温度在54?57°C扩增时，都只 出现1条特异的目的条带；对于强毒株（FX2010)，退火温度在55?56°C扩增时，也只出现 1条特异的目的条带（图3)。图3中，I :DL2000DNA Marker ;2?3 :鸭坦布苏病毒强毒株 (FX2010,退火温度分别为55?56°C ) ;4?7 :鸭坦布苏病毒弱毒株（FX2010-180P，退火温 度分别为54?57°C ) ;8 :阴性对照。
[0066] 实施例2RT-PCR敏感性试验
[0067] 根据实施例1引物对SEQ ID NO :3 / SEQ ID NO :4 / SEQ ID NO :5所确定的退 火温度，将鸭坦布苏病毒强毒株（FX2010)和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株（FX2010-180P)分别 作系列稀释，取〇. Iml含10TCID5Q、102TCID5Q、IO3TCID 5tl和IO4TCID5tl的病毒液，用该引物对进 行RT-PCR方法检验。
[0068] 以不同病毒含量的病毒液作为检测材料，用RT-PCR方法检测。结果显示，对于 鸭坦布苏病毒强毒株（FX2010)，IOTCID 5tl的病毒液可以检测到特异性条带（图4)，对于 鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株（FX2010-180P)，IO 3 tlTCID5ci病毒液可以检测到特异性条带（图 4)。图4中，1?4 :鸭坦布苏病毒弱毒株（FX2010-180P，毒价分别为10?IO4 qTCID5q) ;5 : DL2000DNAMarker ;6?9 :鸭坦布苏病毒强毒株（FX2010,毒价分别为104 °?IOTCID5ci)。
[0069] 实施例3RT-PCR特异性试验
[0070] 根据实施例 1 引物对 SEQ ID NO :3 / SEQ ID NO :4 / SEQ ID NO :5 所确定 的退火温度，用该引物对扩增鸭坦布苏病毒强毒株（FX2010)、鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株 (FX2010-180P)、鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、H9亚型流感病毒、I型鸭肝炎病毒、鸭呼肠孤病 毒和正常细胞阴性对照的基因组，检验RT-PCR方法的特异性。
[0071] 结果：应用RT-PCR扩增鸭坦布苏病毒强毒株（FX2010)和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗 株（FX2010-180P)基因组，分别能够扩增出大小为860bp和429bp的一条片段，而鸭瘟病 毒、番鸭细小病毒、亚型流感病毒、I型鸭肝炎病毒、鸭呼肠孤病毒和正常细胞阴性对照 的基因组没有扩增出任何片断，表明该方法对鸭坦布苏病毒的检测特异性强（图5)。图5 中，I :DL2000DNA Marker ;2 :鸭坦布苏病毒强毒株（FX2010) ;3 :鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株 (FX2010-180P) ;4 :鸭瘟病毒；5 :番鸭细小病毒；6 :H9亚型流感病毒；7 :1型鸭肝炎病毒； 8:鸭呼肠孤病毒；9:阴性对照。
[0072] 实施例4限制性片段长度多态性（RFLP)分析
[0073] 在实施例1用引物SEQ ID NO :3 / SEQ ID NO :4 / SEQ ID NO :5对鸭坦布苏病 毒强毒株（FX2010株）和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株（FX2010-180P株）扩增片断中，Sal I限制酶酶切位点（GTCGAC)是鸭坦布苏病毒强、弱毒株共有的，而BglII限制酶酶切位点 (AGATCT)是强毒株特有的。因此，将鸭坦布苏病毒强毒株（FX2010株）和鸭坦布苏病毒弱 毒疫苗株（FX2010-180P株）RT-PCR扩增产物分别用Bgl II和Sal I进行酶切分析，根据 酶切产物大小可以进一步验证鸭坦布苏病毒强毒株（FX2010株）和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗 株（FX2010-180P 株）。
[0074] 结果：鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株RT-PCR扩增产物用Sal I限制酶酶切后的电泳图 可以看到约250bp和180bp的片断；鸭坦布苏病毒强毒RT-PCR扩增产物用Bgl II限制酶 酶切后的电泳图可以看到约550bp和300bp的片断，用Sal I限制酶酶切后的电泳图可以 看到约600bp和250bp的片断（图6)。图6中，I. DL2000DNAMarker ;2.鸭坦布苏病毒弱 毒疫苗株（Sal I酶切）；3.鸭坦布苏病毒强毒株（Bgl II酶切）；4.鸭坦布苏病毒强毒株 (Sal I 酶切）。
[0075] 实施例5鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的RT-PCR检测试剂盒的组成及 应用该试剂盒对临床样品进行RT-PCR检测和重复性试验
[0076] 1、试剂盒的组成
[0077] 将5￡〇10勵：3、5￡〇10勵：4和5￡〇10勵：5所示的？1/?3、卩2/?3引物对、 RT-PCR反应缓冲液、反转录酶、聚合酶，装配成试剂盒，组装后置于合适条件保存。
[0078] 或将 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7 和 SEQ ID NO :5 所示的 Pl / P3、P2 / P3 引物 对、RT-PCR反应缓冲液、反转录酶、聚合酶，装配成试剂盒，组装后置于合适条件保存。
[0079] 2、本发明试剂盒的应用
[0080] 取不同批次的鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株（FX2010-180P株）病毒液和鸭坦布苏病 毒强毒株（FX2010)感染鸭后第4天的卵巢组织按照上述方法进行检验。
[0081] 用鸭坦布苏病毒强毒株（FX2010)和鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株（FX2010-180P) 病毒液重复多次，结果都一致，重复性良好。用上述含有SEQ ID NO :3 / SEQ ID NO: 4 / SEQ ID NO :5引物对的试剂盒检验实验室生产的4批次的鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株 (FX2010-180P)的病毒液，均扩增出特异性条带（图7)。用该试剂盒再检验鸭坦布苏病毒 强毒感染鸭的卵巢组织，均扩增出特异性条带（图7)。图7中，I. DL2000DNAMarker ;2? 5. 1?4批次鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株病毒液；6.阴性对照；7?10.鸭坦布苏病毒强毒株 感染鸭（1?4号鸭）卵巢组织；11.正常鸭卵巢组织对照。
[0082] 以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能 因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范 围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
【权利要求】
1. 一种鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包 含： 针对鸭坦布苏病毒强毒株SEQ ID NO :1所示基因序列设计的特异性上游引物P1，该上 游引物Pl的3'末端倒数第一个碱基与SEQ ID NO :1第1454位碱基相同，该Pl的3'末端 倒数第二个碱基与SEQ ID NO :1第1453位碱基相同； 针对鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株SEQ ID NO :2所示基因序列设计的特异性上游引物P2， 该上游引物P2的3'末端倒数第二个碱基与SEQ ID NO :2第1891位碱基相同； 针对所述SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2序列第1971?10991位核苷酸序列设计的通 用下游引物P3。
2. -种鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包 含： 针对鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株SEQ ID NO :2所示基因序列设计的特异性上游引物P1， 该上游引物Pl的3'末端倒数第一个碱基与SEQ ID NO :2第1454位碱基相同，该Pl的3' 末端倒数第二个碱基与SEQ ID NO :2第1453位碱基相同； 针对鸭坦布苏病毒强毒株SEQ ID NO: 1所示基因序列设计的特异性上游引物P2,该上 游引物P2的3'末端倒数第二个碱基与SEQ IDNO :1第1891位碱基相同； 针对所述SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2序列第1971?10991位核苷酸序列设计的通 用下游引物P3。
3. 根据权利要求1或2所述的鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试剂盒，其特 征在于，所述上游引物P2的3'末端倒数第一个碱基为人工引入的错配碱基，该错配碱基 与鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的基因序列均不互补。
4. 根据权利要求3所述的鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试剂盒，其特征在 于，所述上游引物Pl的序列如SEQ ID NO :3所示，上游引物P2的序列如SEQ ID NO :4所 示，下游引物P3的序列如SEQ ID NO : 5所示。
5. 根据权利要求3所述的鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试剂盒，其特征在 于，所述上游引物Pl的序列如SEQ ID NO :6所示，上游引物P2的序列如SEQ ID NO :7所 示，下游引物P3的序列如SEQ ID NO : 5所示。
6. 根据权利要求4或5所述的鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试剂盒，其特 征在于，所述试剂盒用于检测样品时的PCR退火温度为54?59°C。
7. -种检测鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的引物，其特征在于，包括以下引物： 针对鸭坦布苏病毒强毒株SEQ ID NO :1所示基因序列设计的特异性上游引物P1，该上 游引物Pl的3'末端倒数第一个碱基与SEQ ID NO :1第1454位碱基相同，该Pl的3'末端 倒数第二个碱基与SEQ ID NO :1第1453位碱基相同； 针对鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株SEQ ID NO :2所示基因序列设计的特异性上游引物P2， 该上游引物P2的3'末端倒数第二个碱基与SEQ ID NO :2第1891位碱基相同； 针对所述SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2序列第1971?10991位核苷酸序列设计的通 用下游引物P3。
8. -种检测鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的引物，其特征在于，包括以下引物： 针对鸭坦布苏病毒弱毒疫苗株SEQ ID NO :2所示基因序列设计的特异性上游引物P1， 该上游引物Pl的3'末端倒数第一个碱基与SEQ ID NO :2第1454位碱基相同，该Pl的3' 末端倒数第二个碱基与SEQ ID NO :2第1453位碱基相同； 针对鸭坦布苏病毒强毒株SEQ ID NO: 1所示基因序列设计的特异性上游引物P2,该上 游引物P2的3'末端倒数第二个碱基与SEQ IDNO :1第1891位碱基相同； 针对所述SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :2序列第1971?10991位核苷酸序列设计的通 用下游引物P3。
9. 权利要求1或2所述的鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试剂盒在制备区分 鸭坦布苏病毒自然感染强毒株和弱毒疫苗株的产品中的应用。
10. 权利要求1或2所述的鉴别鸭坦布苏病毒强毒株和弱毒疫苗株的试剂盒在制备快 速鉴定鸭坦布苏病毒的产品中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104212912SQ201410142794
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年4月10日 优先权日:2014年4月10日
【发明者】李泽君, 李国新 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所