bbeAMP基因、其编码的蛋白质、以bbeAMP为目的基因生产的融合蛋白及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了bbeAMP基因、其编码的氨基酸、以bbeAMP为目的基因生产的融合蛋白及其应用，此融合蛋白可与细菌结合。本发明的bbeAMP基因的DNA序列如SEQ?ID?NO：1或SEQ?ID?NO：2所示；该bbeAMP基因是以白氏文昌鱼的cDNA为模板合成的；由bbeAMP基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：3或SEQ?ID?NO：4所示。本发明提供的以bbeAMP为目的基因生产的重组融合蛋白能与革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌结合，且结合效果较明显，可为开发辅助治疗细菌感染性疾病的药物的研究奠定基础。
【专利说明】bbeAMP基因、其编码的蛋白质、以bbeAMP为目的基因生产的融合蛋白及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及中国白氏文昌鱼的bbeAMP基因、由bbeAMP基因编码的蛋白质、以bbeAMP为目的基因生产的重组融合蛋白及该重组融合蛋白的应用。
【背景技术】
[0002]文昌鱼在分类上属于脊索动物门(Chordata)头索动物亚门(Cephalochordata)头索纲鳃口科文昌鱼属，自五亿年前出现至今一直保持着古老的特性及原始的性状，因此被认为是无脊椎动物进化到脊椎动物的过渡类型，其形体结构、发育模式和基因组都是脊椎动物最简单模型的代表。近几年的研究表明文昌鱼，除了作为传统的发育生物学研究的模式生物外，正在成为研究免疫系统的理想实验动物模型。文昌鱼生活喜在海滩泥沙中，这种生活环境势必需要一套抵御病原微生物侵袭的系统，而在先天免疫中NF- K B信号通路发挥着重要的作用，它在参与免疫应答和炎症反应过程中通过调节多种效应分子的表达来控制免疫系统的运作。人们在对果蝇和高等生物的免疫应答研究中发现NF-K B启动了多种杀伤的效应分子。
[0003]中国2013年2月13日公开的专利CN102925449A报道了一种细胞内信号传导蛋白BbSma6/7及其编码基因，该基因来自青岛文昌鱼，其可从理论上提高对免疫系统构成和免疫应答机制的认识，为在基因水平开发细菌防治药物奠定基础。
[0004]现有技术中，中国2013年5月22日公开的专利CN103114094A报道了文昌鱼细胞核内蛋白AmphiAkirin及其编码基因，AmphiAkirin蛋白在细菌冲击成体文昌鱼后表达出现上调，在防治细菌内的浸染方面提供理论依据4!11?1^41^1^11蛋白可以激活即-1^8信号通路，为病害的免疫防治技术提供理论依据和基因来源。
[0005]本发明将进一步以文昌鱼为模型，研究新的基因及其编码的蛋白质，并研究此基因在先天免疫中的功能。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题在于提供中国白氏文昌鱼体内的bbeAMP基因、bbeAMP基因的制备方法以及由bbeAMP基因编码的蛋白质。
[0007]本发明所要解决的另一技术问题在于提供以bbeAMP为目的基因生产重组融合蛋白的方法以及由此方法生产的重组融合蛋白。
[0008]本发明进一步要解决的技术问题在于提供上述重组融合蛋白在制备辅助治疗感染性疾病药物中的应用。
[0009]本发明所提供的bbeAMP基因，其DNA序列如SEQ ID NO:1 (bbeAMPl)或SEQ IDNO:2(bbeAMP2)所示。 [0010]本发明所提供的制备bbeAMP基因的方法包括以下步骤:
[0011](1)从已有的中国白氏文昌鱼中提取总RNA ;[0012](2)以步骤⑴中提取的总RNA为模板，逆转录合成cDNA ；
[0013](3)以cDNA为模板，以SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6为上、下游引物通过PCR扩增得至Ij bbeAMPl基因或以SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8为上、下游引物通过PCR扩增得到bbeAMP2基因。
[0014] 上述制备bbeAMP基因的方法中，所述总RNA采用Trizol试剂提取，所述cDNA是按照 Τ0Υ0Β0 公司的 First Strand cDNA Synthesis Kit ReverTra Ace- α -TM(codeN0.FSK-100)说明书操作进行逆转录合成的。
[0015]本发明所提供的由bbeAMP基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4 所示。
[0016]上述由bbeAMP基因编码的蛋白质，所述SEQ ID NO:3序列表示的蛋白由bbeAMPl基因编码，其含87个氨基酸，分子量为8，978道尔顿，等电点为6.67 ;SEQ ID NO:4序列表示的蛋白由bbeAMP2基因编码，其含93个氨基酸，分子量为10，308道尔顿，等电点为4.85。
[0017]经SMART在线预测，发现bbeAMP基因编码的蛋白除了一段小的信号肽外并没有其他已知的保守结构域。
[0018]本发明提供的以bbeAMP为目的基因生产重组融合蛋白的方法，该方法包括以下步骤:
[0019](I)重组表达质粒的构建:以含有SEQ ID NO:1所示基因的pGEX Teasy质粒为模板、以SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10为上、下游引物或者以含有SEQ ID NO:2所示基因的pGEX Teasy质粒为模板、以SEQ ID N0:11和SEQ ID NO:12为上、下游引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物克隆到表达载体pET-32a (+)上，得到重组表达质粒；
[0020](2)重组融合蛋白的表达:将步骤(1)所得的重组表达质粒转化至大肠杆菌中，培养基因工程菌、诱导重组融合蛋白表达；
[0021](3)纯化步骤(2)所得的重组融合蛋白；
[0022](4)将步骤(3)所得纯化融合蛋白的洗脱液透析除盐，浓缩冻干，得到纯的重组融合蛋白。
[0023]上述生产重组融合蛋白的方法，所述重组融合蛋白表达过程中基因工程菌的培养基为氨苄抗性2XYT培养基，采用的诱导剂为IPTG ;纯化重组融合蛋白采用方法为亲和层析法。
[0024]上述生产重组融合蛋白的方法，通过对培养时间、诱导时间、诱导剂浓度、温度等条件的摸索和优化，发现重组融合蛋白表达的最佳条件为:接单菌落于氨苄抗性2XYT液体培养基中，于37°C温度、250rpm振荡条件下培养过夜；然后取培养物按1:1000比例接种于氨苄抗性2 X YT培养基中，在温度37°C、250rpm振荡条件下扩大培养至0D600 = 0.8 (扩大培养的时间约为4h)。最后加入IPTG至其最终浓度分别为ImM，进行诱导培养，诱导培养温度为18°C，于250rpm振荡条件下培养20h。在此条件下，融合蛋白的表达量高，并以可溶蛋白形式存在。
[0025]本发明提供的以bbeAMP为目的基因生产的重组融合蛋白，以bbeAMPl为目的基因、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10为上、下游引物生产的重组融合蛋白(即PET32a_bbeAMPl表达的蛋白)含有240个氨基酸，分子质量为28100道尔顿；以bbeAMP2为目的基因、SEQID NO:11和SEQ ID NO:12为上、下游引物生产的重组融合蛋白(即PET32a_bbeAMP2表达的蛋白)含有247个氨基酸，分子质量为28870道尔顿。此融合蛋白在大肠杆菌中均以可溶形式表达。
[0026]本发明所提供的以bbeAMP为目的基因生产的重组融合蛋白，其可应用于制备辅助治疗感染性疾病的药物。
[0027]上述重组融合蛋白，其可与革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌结合。
[0028]本发明的有益效果为:本发明所提供的由bbeAMP基因生产的重组融合蛋白能与革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌结合，且结合效果较明显，可为开发辅助治疗细菌感染性疾病的药物的研究奠定基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1为重组表达质粒pET32a-bbeAMPl、pET32a-bbeAMP2的构建示意图； [0030]图2a、2b分别为bbeAMPl、bbeAMP2基因的PCR扩增图；
[0031]图3a、3b分别为pET32a_bbeAMPl、pET32a_bbeAMP2重组融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达、定位图；
[0032]图4a、4b分别为pET32a_bbeAMPl、pET32a_bbeAMP2重组融合蛋白的纯化图；
[0033]图5 为重组融合蛋白 pET32a_bbeAMPl、pET32a_bbeAMP2 与细菌结合的 Westernblot分析图。
【具体实施方式】
[0034]下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。本发明表达质粒的复制方法--参照Sambrook(Sambrook,et al.1989,Molecular cloning.Cold Spring Harbor LaboratoryPress.USA)方法，用CaCl2的方法将质粒转化E.col1.DH5或BL21 (DE3)菌株，用含氨苄青霉素(100g/mL)的2YT培养基培养转化菌株，用Omega公司试剂盒提取质粒。
[0035]实施例1:bbeAMP基因及其制备方法
[0036]bbeAMP 基因的 DNA 序列如 SEQ ID NO:I (bbeAMPl)或 SEQ ID NO:2(bbeAMP2)所
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[0037]bbeAMP基因的合成方法为:
[0038](I)取来自广东湛江水域的白氏文昌鱼(Branchiostoma belcheri)全鱼，米用Trizol试剂，按照中国2013年5月22日公开的专利CN103114094A所述方法提取总RNA ；
[0039](2)以步骤(1)中提取的总RNA为模板，逆转录合成cDNA，具体方法为:取Iug总RNA,按照 Τ0Υ0Β0 公司的 First Strand cDNA Synthesis Kit ReverTra Ace- α -TM(codeN0.FSK-100)说明书操作进行逆转录合成第一链(此cDNA为第一链)；
[0040](3)以cDNA为模板设计引物，通过PCR扩增得到beeAMP基因。
[0041]bbeAMPl基因的上、下游引物如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示，分别为:5' -ATGAAGACCGCCATCCTGCTCGTTG-3'和 5' -CTAGCTGCAGGTACACTGAGTCCCG-3'
[0042]bbeAMP2基因的上、下游引物如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示，分别为:5' -ATGAAGACTGCTCTGTTGTTCCTGG-3'和 5' -TTTAAGCCATTTCCATCTCCTTCTG-3'
[0043]以上述cDNA 为模板、分别以 SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6 或 SEQ ID NO:7、SEQID NO:8为上、下游引物，采用Takara的LA Taq聚合酶，调整退火温度为56°C，72°C延伸Imin，扩增bbeAMPl、bbeAMP2的全基因，扩增结果分别如图2a、图2b所示。在图2a、图2b中，I表示扩增样品；M表示DNA分子量标准(DL2000)。结果表明，bbeAMPl、bbeAMP2基因在250bp附近分别有一明显的扩增带，与基因预测大小相符。
[0044]将扩增得到的目的片段在连接酶缓冲液中按1:3的比例与pGEX Teasy vector混匀，用T4连接酶16°C连接6h，然后转化至大肠杆菌DH5 α中，挑选重组克隆测序，测序结果表明获得了 bbeAMPl和bbeAMP2基因全长序列。
[0045]实施例2:bbeAMP基因编码的蛋白质
[0046]由实施例1所述bbeAMP基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQID NO:4 所示。
[0047]实施例3:以bbeAMP为目的基因生产重组融合蛋白的方法
[0048]以bbeAMP为目的基因生产重组融合蛋白的，其制备方法包括如下步骤:
[0049](l)pET32a-bbeAMP重组表达质粒的构建
[0050]重组表达载体pET32a_bbeAMPl、pET32a_bbeAMP2的构建过程如图1所示，具体方法为:
[0051]首先根据bbeAMP基因的序列合成一对引物，上游引物含EcoR I切割位点，下游引物含Hind III切割位点。根据bbeAMPl基因合成的上游引物和下游引物分别为: [0052]上游引物(bbeAMPl-upperlO-U)如SEQ ID NO:9 所示:
[0053]5’ -CCGGAATTCAACGTGATCCATGTGAGACG-3> (下划线为 EcoR I 切割位点)
[0054]下游引物(bbeAMPl-lowerlO-L)如SEQ ID NO:10 所示:
[0055]5’ -CCCAAGCTTG GCTGCAGGTACACTGAGTCC-3’ (下划线为 Hind III 切割位点)
[0056]根据bbeAMP2基因合成的上游引物和下游引物分别为:
[0057]上游引物(bbeAMP2-upperl6-U)如SEQ ID NO:11 所示:
[0058]5’ -CCGGAATTC CAGTTCTGGCAC CCGCTGGC-3’(下划线为 EcoR I 切割位点)
[0059]下游引物(bbeAMP2-lowerl6-L)如SEQ ID NO:12 所示:
[0060]5’ -CCCAAGCTTG AGCCATTTCCATCTCCTTCT-3’ (下划线为 Hind III 切割位点)
[0061 ] 然后，分别以含有bbeAMPl、bbeAMP2基因的pGEX Teasy质粒为模板，以10-U/10-LU6-U/16-L为引物进行PCR扩增，采用Takara的prime STAR聚合酶及5父1311打61'，每50111扩增体系加入0.2111 prime STAR酶，设置退火温度为55°C，72°C延伸Imin扩增，得到目的片段。用EcoR I和Hind III对目的片段和pGEX Teasy载体质粒(预先提取并纯化)进行酶消化，回收酶切产物后采用紫外分光光度计测定浓度；按照1:5的摩尔比混合目的片段与pET-32a(+)载体(Novagen公司)，加入Iul T4DNA连接酶，于16°C过夜连接。将连接产物转化至E.coli DH5a，筛选阳性克隆进行测序鉴定，结果表明得到重组的原核表达质粒 pET32a-bbeAMPl、pET32a-bbeAMP2。
[0062](2)重组融合蛋白的表达
[0063]将pET32a_bbeAMPl、pET32a_bbeAMP2 质粒转化至大肠杆菌 BL21 (DE3)中，培养基
因工程菌，诱导重组融合蛋白表达。
[0064]基因工程菌的培养条件为:接单菌落于氨苄抗性2XYT液体培养基中，于37°C温度、250rpm振荡条件下培养过夜；然后取培养物按1:1000比例接种于氨苄抗性2XYT培养基，在温度37°C、250rpm振荡条件下扩大培养至0D600 = 0.8(扩大培养的时间约为4h);最后加入IPTG至其最终浓度分别为ImM，进行诱导培养，诱导培养温度为18°C，于250rpm振荡条件下培养20h，离心菌液收集菌体。实验过程中对培养时间，诱导时间，诱导剂浓度、温度等条件进行了摸索和优化，经SDS-PAGE电泳分析表明，在所述条件下pET32a-bbeAMPl、pET32a-bbeAMP2融合蛋白的表达量较高，且蛋白处于可溶状态。
[0065]超声裂解按如上条件培养所得的基因工程菌，SDS-PAGE电泳分析菌上清液和沉淀，分析结果如图3a、图3b所示。图3a中，I表示诱导后的整菌，2表示诱导后的超声上清；图3b中I表示诱导前的整菌，2表示诱导后的整菌，3表示诱导后的超声上清，4表示诱导后的超声沉淀。分析表明，菌株经诱导后在超声裂解沉淀中有明显的特异表达产物带，分子量与预测的理论值相符。
[0066](3)采用 Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow 亲和层析纯化融合蛋白
[0067]本发明摸索和优化了 pET32a_bbeAMPl、pET32a_bbeAMP2重组融合蛋白的纯化条件，发现对菌体进行超声破碎后，离心取上清，将蛋白上清过镍离子螯合琼脂糖快流速亲和层析柱进行纯化，可以得到较纯的蛋白。纯化该融合蛋白的具体方法为:
[0068]镍离子螯合琼脂糖层析柱的处理:用0.2M NiSO4溶液与琼脂糖柱料孵育，使琼脂糖结合Ni2+;用10倍VC(柱体积)的ddH20(重蒸水)清洗柱料，以除去游离的Ni2+;再用5倍VC的TBS缓冲液平衡柱料。
[0069]融合蛋白样品的处理:先用预冷的TBS溶液重悬上述步骤(2)中诱导培养后所收集的菌体，离心弃上 清；称量菌体重量，按照Ig湿菌:10ml超声缓冲液的比例加入预冷的TBS缓冲液；采用超声波细胞粉碎机破碎细菌细胞，离心取上清(可溶蛋白)，制得融合蛋白样品。
[0070]纯化融合蛋白:将上述制得的蛋白上清液与已处理好的镍离子螯合琼脂糖层析柱的柱料孵育，使柱料结合目的蛋白；用TBS加不同浓度梯度的咪唑溶液缓冲液洗涤柱料至紫外吸收峰达到基线水平，收集蛋白穿流峰溶液，并取少量制备电泳样品；分别用不同浓度(50mM、100mM、250mM)咪唑-TBS缓冲液洗脱蛋白，每个浓度咪唑溶液都洗至蛋白紫外吸收峰的平台期为止，收集洗脱峰溶液并制备电泳样品。采用SDS-PAGE方法进行检测，实验结果如图4a、图4b所示。图4a与图4b中,M表示蛋白质marker, I表示镍柱上样样品，2表示穿流峰溶液，3、4为50mM咪唑-TBS洗脱峰溶液；5_8为IOOmM咪唑-TBS洗脱峰溶液，9-11为250mM咪唑-TBS洗脱峰溶液。
[0071](4)pET32a-bbeAMPl、pET32a_bbeAMP2 融合蛋白透析除盐及浓缩
[0072]将步骤(3)所得到的纯化融合蛋白的咪唑-TBS洗脱液样品加入透析袋中，再将透析袋放入有TBS缓冲液(PH7.5)的大烧杯里，隔8h换一次缓冲液，于4°C冷室搅拌过夜；将透析后的蛋白通过IOKD Millipore超滤离心管浓缩，冻干后保存。
[0073]实施例4:中国白氏文昌鱼融合蛋白与细菌结合的活性分析
[0074]本实施例中使用的细菌包括:革兰氏阴性细菌大肠杆菌(Escherichia coli)、醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter caloacetius)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)和副溶血弧菌(Vibro paraheamoIyticus);革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)和幾肠球菌(Enterococcus faecium)。
[0075]上述细菌菌体的前处理:用TBS (pH7.5)缓冲液洗涤上述各菌，重复洗涤两次后稀释0D600约为1.0,离心收集菌体沉淀。
[0076]在两组1.5ml EP管中加入50 μ g目的蛋白，2X IO7个经上述前处理的各菌，再分别加入CaCl2和EDTA (CaCl2和EDTA的最终浓度均为IOmM)，充分混匀后置4°C摇床轻柔振荡孵育过夜；次日，将孵育过夜所得溶液在4°C温度下以6000rpm离心6min，收集菌体沉淀，沉淀用800ul TBS缓冲液(pH7.5)重复洗涤4遍以除去非特异结合蛋白；最后一次离心弃去上清后，用50 μ I TBS重悬菌体，加入10 μ 16 X SDS上样缓冲液，混匀后沸煮lOmin，制备电泳样品，用ant1-His单克隆抗体进行蛋白质印记法(Western blot)分析。
[0077]以pET32a_TRX蛋白为阴性对照开展平行对照实验，实验结果如图5a、5b所示。在图5a、5b中，1-4所表示的分别为革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌；5_8表示的分别为革兰氏阴性细菌大肠杆菌、醋酸钙不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌、副溶血弧菌；9表示的为IOyg重组蛋白作为对照，来证明TRX蛋白与微生物没有结合的结果不是由 于操作不当造成的。结果表明，pET32a-bbeAMPl、pET32a-bbeAMP2重组蛋白可以结合革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌，且在钙离子存在下结合能力增强。
[0078]最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
【权利要求】
1.bbeAMP基因，其特征在于:bbeAMP基因的DNA序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示。
2.制备权利要求1所述bbeAMP基因的方法，其特征在于:所述bbeAMP基因的制备方法包括以下步骤: (1)从已有的中国白氏文昌鱼中提取总RNA; (2)以步骤⑴中提取的总RNA为模板，逆转录合成cDNA;
(3)以cDNA 为模板、以 SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6 或 SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8 为上、下游引物，通过PCR扩增得到beeAMP基因。
3.根据权利要求2所述的制备bbeAMP基因的方法，其特征在于:所述总RNA采用Trizol试剂提取。
4.由权利要求1所述bbeAMP基因编码的蛋白质，其特征在于:所述bbeAMP基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID N0:4所示。
5.以权利要求1所述基因为目的基因生产重组融合蛋白的方法，其特征在于:所述生产重组融合蛋白的方法包括以下步骤: (1)重组表达质粒的构建:以含有SEQID NO:1所示基因的pGEX Teasy质粒为模板、以SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10为上、下游引物或者以含有SEQ ID NO:2所示基因的pGEXTeasy质粒为模板、以SEQ ID N0:11和SEQ ID NO:12为上、下游引物进行PCR扩增，将PCR扩增产物克隆到表达载体pET-32a(+)上，得到重组表达质粒； (2)重组融合蛋白的表达:将步骤(1)所得的重组表达质粒转化至大肠杆菌中，培养基因工程菌、诱导重组融合蛋白表达； (3)纯化步骤(2)所得的重组融合蛋白； (4)将步骤(3)所得纯化融合蛋白的洗脱液透析除盐，浓缩冻干，得到纯的重组融合蛋白。
6.根据权利要求5所述的生产重组融合蛋白的方法，其特征在于:所述重组融合蛋白表达过程中，基因工程菌在氨苄抗性2X YT培养基中培养，采用的诱导剂为IPTG。
7.根据权利要求5所述的生产重组融合蛋白的方法，其特征在于:所述纯化重组融合蛋白的方法为亲和层析法。
8.一种采用权利要求5至7中任一项所述方法制备的重组融合蛋白。
9.权利要求8所述的重组融合蛋白在制备辅助治疗感染性疾病药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的重组融合蛋白在制备辅助治疗感染性疾病药物中的应用，其特征在于:所述重组融合蛋白可与革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌结合。
【文档编号】C12N15/10GK103966229SQ201410195720
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月9日 优先权日:2014年5月9日
【发明者】徐安龙, 元少春, 胡金茹 申请人:中山大学