一种大豆GmHKT蛋白及其编码基因与应用的制作方法

一种大豆GmHKT蛋白及其编码基因与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种大豆GmHKT蛋白及其编码基因与应用,属于植物基因工程领域。该大豆GmHKT蛋白，是具有序列表中的SEQID№：2所述氨基酸残基序列的蛋白质。该大豆GmHKT蛋白及其编码基因可用于培育耐盐植物种质特别是耐盐大豆新种质。
【专利说明】-种大豆GmHKT蛋白及其编码基因与应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及与耐盐性密切相关的HKT蛋白及其编码基因与应用，属于植物基因工 程领域。特别涉及来源于大豆的与耐盐性相关的HKT蛋白GmHKT2及其编码基因与其在培 育耐盐植物种质中的应用。

【背景技术】
[0002] 由于当前土壤的过度使用，造成土壤有效成分不断减少、盐渍化程度严重。随着干 旱与半干旱气候的变化，土壤盐渍化与次生盐渍化现象越来越严重，导致包括大豆在内的 多种重要农作物的减产与品质下降。大豆[Glycine max(L.)merr]作为重要经济作物，在 栽培过程中受到土壤盐渍化和次生盐渍化的制约。因此，运用分子生物学技术研究大豆离 子调控等耐盐基因及其作用机理，将为培育耐盐大豆新种质提供扎实的基础。
[0003] 盐渍化土壤抑制大豆生长的关键因素是盐胁迫导致K+吸收的匮乏和过量Na+的 离子特异性损害。因此，克隆与大豆K+吸收、Na+外排有关的基因，明确这类基因的分子作 用机理，将有助于利用基因工程技术提高大豆的耐盐性。植物根部细胞与环境之间的物 质交换通过位于细胞质膜上的转运系统进行，转运系统主要包括各类离子泵、共转运体及 离子通道，由于共转运体可以在极端逆境条件下维持植物对关键营养物质的吸收和转运， 从而决定着处于逆境中的植物细胞的许多关键功能，高亲和性钾转运蛋白（High affinity K+transporter，HKT)便是一种重要的由载体蛋白组成的高亲和转运系统。因此，发掘大豆 GmHKT新基因并研究其功能在理论和实践上都具有重要的科学意义。


【发明内容】

[0004] 技术问题
[0005] 本发明的一个目的是提供一种新型大豆GmHKT蛋白及其编码基因与应用。
[0006] 技术方案
[0007] 本发明所提供的大豆GmHKT蛋白，名称为GmHKT2,来源于大豆属大豆[Glycine max(L.)]，是具有序列表中的SEQ ID Ns:2所述氣基酸残基序列的蛋白质。
[0008] 上述大豆GmHKT蛋白的编码基因（GmHKT2)也属于本发明的保护范围。
[0009] 上述大豆GmHKT蛋白GmHKT2的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一：
[0010] 1)序列表中SEQ ID Ns :1的DNA序列；
[0011] 2)编码序列表中SEQ ID Ns :2蛋白质序列的多核苷酸；
[0012] 其中，序列表中的SEQ ID Ns :1由1440个脱氧核苷酸组成，本序列为GmHKT2基因 的读码框，编码具有序列表中SEQ ID Ns :2的氣基酸残基序列的蛋白质。
[0013] 含有本发明基因的表达载体和宿主菌均属于本发明的保护范围。
[0014] 扩增GmHKT2 -片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
[0015] 利用植物表达载体，将本发明的GmHKT2的编码基因导入植物细胞，可获得对高盐 胁迫耐受力增强的转基因植株。
[0016] 使用GmHKT2构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强 型启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载 体进彳丁加工，如加入可在植物中表达的选择性标记基因（GUS基因、GFP基因等）或抗生素 标记物（抗除草剂标记物、潮霉素标记物、卡那霉素标记物等）。
[0017] 携带有本发明GmHKT2的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载 体、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化 的植物宿主既可以是水稻、小麦、玉米等单子叶植物，也可以是绿豆、番茄、花生、杨树、草坪 草、苜宿等双子叶植物。
[0018] 有益效果
[0019] GmHKT2的表达受高浓度NaCl的诱导，在150mM NaCl的胁迫下，GmHKT2在大豆的 根中受到强烈诱导并高效表达，在茎中的表达量呈现先上升后下降的变化趋势，而在叶中 的相对表达量较低。导入过量表达GmHKT2的烟草与未转基因烟草相比，其在盐胁迫下的耐 受能力明显得到增强，说明GmHKT2基因与植物的耐盐性密切相关。盐胁迫下，转基因植株 与非转基因对照相比，发现转基因植株的根部积累较多钾离子和较少钠离子，进而导致转 基因植株的根部具有较低的Na +/K+比，而较低的Na+/K+比是植物在盐胁迫下实现高耐盐性 的关键所在。
[0020] 本发明的GmHKT2对培育耐盐植物新种质特别是耐盐大豆新种质具有重要意义。
[0021] 下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。

【专利附图】

【附图说明】
[0022] 图1为GmHKT2在150mM NaCl胁迫下的表达特性图
[0023] 图2为含有GmHKT2的植物表达载体的部分结构示意图
[0024] 图3为转GmHKT2烟草株系Line3与非转基因植株在盐胁迫下的表型比较图
[0025] 图4为转基因植株Line3、Linel2和非转基因植株在盐胁迫下的根中的Na+和K+ 分析

【具体实施方式】
[0026] 下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。
[0027] 实施例1、大豆GmHKT2及其编码基因的cDNA克隆与鉴定
[0028] 以大豆耐盐品种 Lee68 (Chen et al.，Aus J Agric Res, 2008, 59:1086 - 1091)为 材料，通过生物信息学的方法，以已报道的GmHKTl蛋白序列为种子序列，BLAST大豆基因组 数据库，在大豆第7号染色体上鉴定出一条高度同源的序列，命名为GmHKT2。GmHKT2基因 0RF全长为1440bp，编码479个氨基酸。
[0029] 根据GmHKT2基因序列设计引物：GmHKT2 0RF正向引 物：5 '-ATGGGTTTAGTTTTTCTCC-3，，GmHKT2 0RF 反向引物：5 '-TTAGGAGAGGTTCCAGGCTT-3，， 应用RT-PCR方法从大豆总RNA中扩增GmHKT2基因。取大豆耐盐品种Lee68叶片，用QiaGen 试剂盒提取总RNA。取2 μ 1总RNA用反转录试剂盒（Τ0Υ0Β0公司）按试剂盒的方法进行 反转录，以得到的cDNA为模板进行PCR扩增反应。20 μ 1 PCR反应体系为：1 μ 1 cDNA、各 Ιμ? 引物（1〇μΜ)、2μ1 10XPCR 缓冲液、0·5μ1 dNTP(lOmM)和 0.5UTaqDNA 聚合酶，用 灭菌水补足20 μ 1。PCR反应在东胜龙EDC-810型PCR仪上进行，其程序为94°C变性4min ; 再 94°C lmin，55°C lmin，72°C 2min，共 30 个循环；然后 72°C延伸 lOmin ;4°C保存。PCR 产 物经回收后序列分析，结果表明该PCR产物具有序列表中序列1的核苷酸序列。
[0030] 实施例2、GmHKT2基因在高盐胁迫下的表达特征
[0031] 对大豆耐盐品种Lee68进行NaCl胁迫处理用于分析大豆GmHKT2在盐胁迫 下的表达情况。为了进行Real-timePCR分析GmHKT2在盐胁迫下的表达规律，先将大 豆品种Lee68的种子萌发4天，然后转移到标准的Hoagland营养液中水培，待大豆 植株的第一簇复叶长出后，使用含有150mM NaCl的标准Hoagland营养液进行胁迫 处理，分别取盐处理后0、6、12、24、36及48h等时期的根、茎及叶等样品，经液氮速冻 后-80°C保存备用。总RNA的提取同实施例一。以大豆组成型表达的β-tublin基 因 （Genbank Ν〇·ΝΜ_001252709·1)为内参基因（5'-ATCACTTGATCTCCGCAACC-3，和 5' -CATCCCACATTTGCTGTGTC-3'）。以来自大豆不同组织及盐诱导不同时间段的不同组织 的cDNA为模板进行Real-time PCR分析。目的基因 Real-time PCR分析的引物序列是 5, -CTTGTCCTCCCACACATCCT-3' 和 5, -CCAAAGAGCAAAGCATCACA-3，， Real-time PCR 的仪 器是 Applied biosystems(USA)7500Fast，20y 1 反应体系为：1 μ 1 模板、各 0· 5μ 1 引物 (10μΜ)、2μ1 10XPCR缓冲液、Ιμ? SYBR(20X)、2yl Mg2+(25mM)、0.5yl dNTP(25mM)和 0· 2 μ 1的Hatinu·* Taq DNA聚合酶（Invitrogen公司），用蒸馈7jC补足20 μ 1。反应程序 是 95°C变性 2min，95°C 10s，60°C 30s, 70°C 30s，共 40 个循环，然后 70-95°C之间进行 melt 反应。结果表明（图1)，在150mM NaCl胁迫下，GmHKT2在根中的表达受到强烈诱导，根中 的表达量在盐处理后有一个明显的上调并处于高水平表达，在茎中的表达量呈现先上升 后下降的变化趋势，而其在叶中的表达量处于一个相对较低的水平。
[0032] 实施例3、GmHKT2编码蛋白的功能鉴定
[0033] 利用 Invitrogen 公司的 Gateway? Technology with Clonase?II 试剂盒，将 GmHKT2正向插入到表达载体pMDC83中（Invitrogen公司）（图2)，得到2X35S-GmHKT2-Nos 植物过量表达载体，用冻融法将2X35S-GmHKT2-N〇s转入根癌农杆菌EHA105菌株（本实 验室保存）中。利用农杆菌EHA105的介导将2X35S-GmHKT2-Nos导入烟草，检测结果表 明获得38株阳性植株，结合Real-time PCR分析结果选择了 2个阳性转基因株系（Line3、 Linel2)进行功能验证，将Line3和Linel2的种子种入MS培养基，待非转基因型烟草（CK) 以及T2代转基因株系（Line3、Linel2)萌发生长成小苗后（2周左右），将它们转入含200mM NaCl的1/2MS基本培养基中进行盐处理（2周左右），结果如图3所示，表明在200mM的NaCL 胁迫下，非转基因型烟草（CK)植株矮小，叶片萎黄，长势较差，而在同样条件下的过量表达 该基因的转基因株系生长正常。在200mM的NaCl胁迫下，分析了非转基因型烟草（CK)与 转基因株系根中的钾离子和钠离子含量，结果如图4所示，盐胁迫下，转基因植株与非转基 因对照相比，发现转基因植株的根部积累相对较多的钾离子和较少的钠离子，进而导致与 对照相比，转基因植株的根部具有较低的Na+/K+比。
[0034] SEQ ID Ns : 1 的 DNA 序列：
[0035] a I gen I it la: nccii Ui：i i Ι? ttCHnei l ggl latt leg lg<iUu:U tc let ggl 60 tael! gggl c Icaaggtctc naagccaagg acccccgti<\ cttg<uicct c 120 11 Uncacci t：igU icIrc l i l：c<icIrI l 1 ctiigualgg i tgcccl i ga H<t t gg<igc 11 180 t ictccaail cccaactcHt let cct race ctlet caigi tlet eggegg ggaagiU tc 210 hc i teealge tegae clt ct alt I get tee tacaaat t cc naai-K-agm (' 300 ac-caH icana lagnacl igg l.l tag 11 let a lee cl gad caaaalcagci aaa \ lacccic 360 <uiHccgHgt-g alga! Hgl fiH laUnacgac gacagtgH la gacttiuigtn tanct gtet 1 420 ngi Uitclga ci l Ugtagi 11 taggttac ctagtgglgg ttcaalt tgl iggclt tagt 480 1Lcgiglci i iglaciilaac 111gglaccg aglgcaagac aagtacigaa aaMcaaaggc 540 h1 Utrigal Ig lancgi t Uc 11 tgt t lace a tagt itcca cgtU.gct.ag itglggt l tt 600 giccc caeca acgagfiaca t gai ggt i l tc aagaagaa 1.1. egggae i tel tct.cc t tgt c 660 clcccacaca t.ccUclagg taacacccl l latccaccat gti igagget tx1!gaUiatg 720 gttt tgaaaa aggt tacaaa aaaagaggaa tt ctcgtact t gct gaagaa 11tcaaagac 780 gtgggt tatg atcaratget ctctgctct t cat tgttgee tcctggt tgt tactgtcttg 840 ggtt tcaatc ttatacaatt tgtgatgett tgetet ttgg agtggaacac caaaatcatg 900 gaggglitga atgigtaiga gaaaglgglg gcglcit tat itcaaglaac aaaigegaga 960 cacgclggig aalclgl tit IgaIcIdea tccatclct l cagccatal l egtectct tc 1020 gt.tgt: tatga tgtacclccc accatacaci. acatU at ac cagtaagaga gcacgaaaai 1080 gaiglcaaga gaaacaaaaa aagegiagig gagigtcilg tailaidca actclctiac 1140 tiggicatit icatlattct galltgcalc aetgagggta agagett 遍 a agaggatccc 1200 clcaaci tta aigtgiltaa rateaecUa gaaglcatca gtgcitatgg gaacgtaggg 1260 ttctcaacgg ga tacagclg egetaggcaa at gatu-igeeg atgcciitgtg eaaagat tea 1320 tgggtt ggat tctcgggtag gtggagtagc aaaggcaagt tcatcct ta r. ct tggt ca tg 1380 ttctttggga ggctcaagaa actcaacatg aaaggtggca aagcctggaa cctctcctaa 14-10
[0036] SEQ ID M :2 序列：
[0037] WII-III^-'FIQI. CYFVH.SLVG YI.GI.KVSKf^ ΙΡνΠ .ΚΠ?.ΚΙ. FVTSVSASTV SS\1VAI.KVIHL 60 PSNSQLIiJJ LIA1FIi}GHVl·' T$yU)LU;AS YKI;Q1\RSV]S IKQIKLCLVS IPDSKSKNVH 120
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【权利要求】
1. 一种大? GmHKT蛋白，是具有序列表中的SEQ ID Ns :2所述氣基酸残基序列的蛋白 质。
2. 编码权利要求1所述的大豆GmHKT蛋白的基因。
3. 根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述大豆GmHKT蛋白的cDNA基因，具有 下述核苷酸序列之一： 1) 序列表中SEQ ID Ns : 1的DNA序列； 2) 编码序列表中SEQ ID Ns :2蛋白质序列的多核苷酸。
4. 含有权利要求2或3所述基因的表达载体。
5. 含有权利要求2或3所述基因的宿主菌。
6. 扩增权利要求2或3所述基因的引物。
7. 权利要求1所述的大豆GmHKT蛋白在培育耐盐性植物中的应用。
8. 权利要求2或3所述基因在培育耐盐性植物中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK104098665SQ201410368246
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月29日 优先权日:2014年7月29日
【发明者】陈华涛, 陈新, 张红梅, 袁星星, 崔晓艳, 刘晓庆 申请人:江苏省农业科学院