一种用基因工程大肠杆菌生产长链脂肪酸的方法
【专利摘要】本发明公开了一种用基因工程大肠杆菌生产长链脂肪酸的方法。在含有葡萄糖的发酵培养基中对能够表达硫酯酶基因AtFatA的重组工程大肠杆菌进行发酵，重组工程大肠杆菌转化葡萄糖合成长链脂肪酸。本发明中的重组菌株能够高效的转化廉价的葡萄糖生成长链脂肪酸酸，该转化过程在温和的条件下即可以进行，且产物专一性好，避免了传统的化学合成途径中苛刻的反应条件和副产物生成，能大幅提高长链脂肪酸的产出比例，是一种合成长链脂肪酸的绿色新工艺，该方法为长链脂肪酸生物合成的工业化应用打下了坚实的基础。
【专利说明】一种用基因工程大肠杆菌生产长链脂肪酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程领域，涉及一种用基因工程大肠杆菌生产长链脂肪酸的方法。
【背景技术】
[0002]长链脂肪酸是一种重要的化工中间体，可用作生物柴油，也可用作食品添加剂。
[0003]传统的脂肪酸主要通过水解法催化甘油三酯水解获得，常见的甘油三酯的来源包括各种动物和植物来源的脂肪。但是植物和动物油脂作为重要的营养物质，成本一直居高不下。同时扩大油脂产量会消耗大量的农牧业资源，给环境造成巨大的压力。上述瓶颈问题阻碍了木糖酸合成的发展，因此寻找绿色合成长链脂肪酸的途径势在必行。
[0004]生物转化是以酶为催化剂来完成的化学反应，反应条件温和，对环境友好；以可再生资源为底物的生物催化合成，是解决全球能源危机的有效途径。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种生物法转化葡萄糖生成长链脂肪酸酸的方法。
[0006]本发明目的可通过以下技术方案实现:
[0007]—种生物催化葡萄糖合成长链脂肪酸的方法，在含有葡萄糖的发酵培养基中对能够表达硫酯酶基因AtFatA的重组工程大肠杆菌进行发酵，重组工程大肠杆菌转化葡萄糖合成长链脂肪酸。本发明中所称的长链脂肪酸是指碳原子数为16 - 18的脂肪酸。
[0008]其中，所述的重组工程大肠杆菌优选是将含有硫酯酶基因AtFatA的重组表达载体转染大肠杆菌所得；所述的大肠杆菌优选大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0009]所述的重组表达载体以pACY⑶uet -1载体为出发载体，Ncol/Sall酶切位点间插入硫酯酶基因AtFatA所得。
[0010]所述的基因AtFatA选自Genbank登录号为:AK176105的序列，或和AtFatA基因同源性超过70%的核酸序列，或来源于其它生物体，和AtFatA基因没有明显的同源性，但和AtFatA具有相同或相似功能的核酸序列。
[0011]所述的含有葡萄糖的发酵培养基配方为6g/L Na2HP04，3g/L KH2P04, lg/LNH4Cl,0.5g/L NaCl, ImM MgS04，2%葡萄糖。
[0012]所述的发酵培养条件为:培养温度30 - 37 °C、搅拌速度400 - 800rpm、pH6.5 - 7.5和溶氧20%以上的条件下培养至OD6tltl约为12 - 20，加入诱导剂IPTG至终浓度0.1 - 1.0mmol.L_\两小时后收集产物。
[0013]所述的方法还包含从发酵产物中分离纯化长链脂肪酸。
[0014]按照上述方法合成的长链脂肪酸。
[0015]一种用于生物发酵制备不饱和脂肪酸的重组大肠杆菌，所述的重组工程大肠杆菌是将含有硫酯酶基因AtFatA的重组表达载体转染大肠杆菌所得；所述的大肠杆菌优选大肠杆菌 BL21(DE3)。
[0016]所述的重组表达载体优选以pACY⑶uet -1载体为出发载体，Ncol/Sall酶切位点间插入硫酯酶基因AtFatA所得。
[0017]本发明所述的重组大肠杆菌在制备长链脂肪酸中的应用。
[0018]有益效果:
[0019]本发明中的重组菌株能够高效的转化廉价的葡萄糖生成长链脂肪酸酸，该转化过程在温和的条件下(30 -37°C )即可以进行，且产物专一性好(附图3)，避免了传统的化学合成途径中苛刻的反应条件和副产物生成，能大幅提高长链脂肪酸的产出比例，是一种合成长链脂肪酸的绿色新工艺，该方法为长链脂肪酸生物合成的工业化应用打下了坚实的基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1长链脂肪酸生物合成代谢途径
[0021 ] 图2硫酷酶基因(AtFatA)表达载体不意图
[0022]图3工程菌合成长链脂肪酸的液相色谱法检测
[0023]长链脂肪酸比例约占86.3%。
【具体实施方式】
[0024]实施例1
[0025]委托南京金斯瑞公司合成Genbank登录号为:AK176105的硫酯酶基因AtFatA,将该序列并克隆到pACY⑶uet -1载体上的Ncol/SalI酶切位点间，得到重组质粒pA - AtFatA(附图2)。载体构建所涉方法均可通过本领域常规技术实现。
[0026]实施例2
[0027]合成长链脂肪酸的工程大肠杆菌菌株的制备，并用该菌株发酵转化葡萄糖生成长链脂肪酸酸，其具体过程如下:
[0028]采用碱裂解法提取实施例1中构建得到的重组质粒PA - AtFatA，采用热击转化法将10 μ I重组质粒PA - AtFatA转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，然后取50 μ I转化后的菌液涂布于含有34μ g ^mI/1氯霉素的LB平板上筛选阳性克隆，长出的菌落即为表达AtFatA的重组大肠杆菌菌株。
[0029]挑取构建好的重组大肠杆菌单菌落，接种至LB液体培养基，37°C、180rpm振荡培养过夜，然后将菌液按体积比1%的接种量接种到添加34μ g.mL.1氯霉素的发酵培养基中进行发酵罐发酵，培养基配方为 6g/L Na2HP04，3g/L KH2P04, lg/LNH4Cl, 0.5g/L NaCl，ImMMgS04，2%葡萄糖，在培养温度30°C、搅拌速度400rpm、pH 6.5和溶氧20%以上的条件下培养至0D600约为12，加入诱导剂IPTG至终浓度0.lmmol/L，两小时后收集产物，总脂肪酸浓度为度为243.5mg/L。
[0030]为了确定脂肪酸的结构，我们收集产物进行的GC - MS分析。经过质谱分析，确定合成16 - 18C脂肪酸。经液相分析表明，长链脂肪酸比例约占总脂肪酸浓度的86.3%。
【权利要求】
1.一种生物催化葡萄糖合成长链脂肪酸的方法，其特征在于在含有葡萄糖的发酵培养基中对能够表达硫酯酶基因AtFatA的重组工程大肠杆菌进行发酵，重组工程大肠杆菌转化葡萄糖合成长链脂肪酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的重组工程大肠杆菌是将含有硫酯酶基因AtFatA的重组表达载体转染大肠杆菌所得；所述的大肠杆菌优选大肠杆菌BL21(DE3)。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的重组表达载体以pACY⑶uet-Ι载体为出发载体，Ncol/Sall切位点间插入硫酯酶基因AtFatA所得。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的基因AtFatA选自Genbank登录号为:AK176105的序列，或和AtFatA基因同源性超过70%的核酸序列，或来源于其它生物体，和AtFatA基因没有明显的同源性，但和AtFatA具有相同或相似功能的核酸序列。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的含有葡萄糖的发酵培养基配方为6g/LNa2HP04,3g/L KH2P04, lg/L NH4C1,0.5g/L NaCl, ImM MgS04，2%葡萄糖；所述的发酵培养条件为:培养温度30-37°C、搅拌速度400-800rpm、pH 6.5-7.5和溶氧20%以上的条件下培养至OD6tltl约为12-20，加入诱导剂IPTG至终浓度0.1-1.0mmol/L，两小时后收集产物。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法还包含从发酵产物中分离纯化长链脂肪酸。
7.根据权利要求1?6中任一项所述方法合成的长链脂肪酸。
8.一种用于生物发酵制备不饱和脂肪酸的重组大肠杆菌，其特征在于所述的重组工程大肠杆菌是将含有硫酯酶基因AtFatA的重组表达载体转染大肠杆菌所得；所述的大肠杆菌优选大肠杆菌BL21 (DE3)。
9.根据权利要求8所述的重组大肠杆菌，其特征在于所述的重组表达载体以pACY⑶uet-Ι载体为出发载体，Ncol/Sall酶切位点间插入硫酯酶基因AtFatA所得。
10.权利要求8或9所述的重组大肠杆菌在制备长链脂肪酸中的应用。
【文档编号】C12P7/64GK104372043SQ201410560363
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年10月20日 优先权日:2014年10月20日
【发明者】陈熹, 周榆, 饶兵, 朱瑞驰, 朱毅, 徐艺林, 荣慧, 秦榛, 章秋浩, 欧阳丽, 徐春晖, 杨展朝, 陈昱达, 朱琪璋, 赵奕玲, 温玉琪 申请人:南京大学