一种与植物抗逆性相关蛋白及其编码基因GsSKP21与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种与植物耐碱性相关蛋白及其编码基因GsSKP21与应用。该蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的蛋白质。本发明通过实验证明，本发明的蛋白具有提高植物抗逆性的功能，该蛋白在植物育种方面具有重要应用价值。
【专利说明】一种与植物抗逆性相关蛋白及其编码基因GsSKP21与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体为一种与植物抗逆性相关蛋白及其编码基因 GsSKP21与应用。
【背景技术】
[0002] 盐碱胁迫是影响农作物生产的主要因素之一，严重影响作物的产量与质量，是制 约我国农业生产和亟待解决的重要问题。与盐胁迫相比，碱胁迫除了土壤水势降低产生的 渗透胁迫和细胞内高浓度盐分累积产生的离子毒害外，还使土壤保持较高pH值（>8. 0)。 由于碱性盐离子C0广和HCCV的存在，可以直接破坏根细胞的结构和功能，使Ca2+，Mg2+， H2P(V离子发生沉淀，从而破坏植物细胞的动态离子平衡。植物应对不利的环境变化有复杂 的调控机制和传导系统，近年来，对植物胁迫应答机制的研究已经取得了巨大的成绩，如调 控渗透胁迫的MAPK信号传导途径和介导离子胁迫的S0S信号转导通路。然而大部分机制 研究主要是集中在盐胁迫中，对碱胁迫的信号传导通路研究仍非常有限。
【发明内容】
[0003] 本发明的一个目的是提供一种蛋白质。
[0004] 本发明提供的蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：
[0005] a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0006] b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的蛋白质。
[0007] 本发明还提供了与上述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B3)中的任一种：
[0008] B1)编码上述蛋白质的核酸分子；
[0009] B2)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
[0010]B3)含有B1)所述核酸分子的重组菌、或含有B2)所述重组载体的重组菌。
[0011] 上述生物材料中，B1)所述核酸分子的核苷酸序列如序列表中序列1所示。
[0012] 本发明另一个目的是提供上述所述蛋白质或所述相关生物材料在提高植物抗逆 性中的应用。
[0013] 上述应用中，所述抗逆性为抗碱胁迫。
[0014] 本发明最后一个目的是提供一种构建转基因植物的方法。
[0015] 本发明所提供的构建转基因植物的方法，包括如下步骤：使上述蛋白质在出发植 物中过表达，进而使植物的抗逆性提高和/或使植物对ABA的敏感性降低。
[0016] 上述方法中，所述蛋白质在受体植物中过表达的方法为：向出发植物中导入上述 蛋白质的编码基因，得到转基因植物；转基因植物与出发植物相比，抗逆性提高和/或对 ABA的敏感性降低。
[0017] 上述方法中，所述蛋白质的编码基因是序列表序列1中第1-1041位核苷酸的DNA 分子。
[0018] 上述方法中，所述抗逆性为抗碱胁迫。
[0019] 上述方法中，所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体为 拟南芥。
[0020] 本发明提供了一种与植物耐碱性相关蛋白及其编码基因GsSKP21与应用。本发明 通过实验证明，本发明的蛋白具有提高植物抗逆性的功能，该蛋白在植物育种方面具有重 要应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1为基因枪轰击洋葱表皮后观察GSSKP21蛋白亚细胞定位结果。
[0022] 图2为野生大豆中在盐和碱处理下GsSKP21基因转录水平表达量的变化。
[0023] 图3为转基因拟南芥在种子萌发期及幼苗期对碱胁迫的响应。图3A为转基因拟 南芥与野生型拟南芥种子在碱胁迫下种子的萌发情况；图3B为转基因拟南芥与野生型拟 南芥种子在碱胁迫下的萌发率；图3C为转基因拟南芥与野生型拟南芥种子在碱胁迫下的 展叶率；图3D为转基因拟南芥与野生型拟南芥幼苗在碱胁迫下的生长情况；图3E为转基 因拟南芥与野生型拟南芥幼苗在碱胁迫下的根长。
[0024] 图4为转基因拟南芥成苗与野生型拟南芥成苗在碱胁迫下的生长情况。
[0025] 图5为转基因拟南芥在种子萌发期及幼苗期对ABA的响应。图5A为转基因与野 生型拟南芥种子在ABA处理下的种子萌发情况；图5B为转基因与野生型拟南芥种子在ABA 处理下的萌发率；图5C为转基因与野生型拟南芥种子在ABA处理下的展叶率；图?为转 基因与野生型拟南芥幼苗在ABA处理下的生长情况；图5E为转基因与野生型拟南芥幼苗在 ABA处理下的根长。
[0026] 图6为非生物胁迫相关Marker基因在野生型拟南芥和GsSKP21超表达拟南芥中 的碱胁迫表达模式。
[0027] 图7为ABA信号通路相关基因在野生型拟南芥和GsSKP21超表达拟南芥中的ABA 胁迫表达模式。
【具体实施方式】
[0028] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。
[0029] 实验材料为野生大豆G07256种子，在文献"MingzheSun,XiaoliSun,Yang Zhao,HuaCai,ChaoyueZhao,WeiJi,HuiziDuanMu,YangYu,YanmingZhu.Ectopic expressionofGsPPCK3andSCMRPinMedicagoSativaenhancesplantalkaline stresstoleranceandmethioninecontent.PL0SONE2014,9(2) :e89578" 中公开过，公 众可以从吉林省农业科学院获得。
[0030] 实施例1、野生大豆中耐碱相关蛋白编码基因GSSKP21的获得
[0031] 1、植物材料处理
[0032] 挑选饱满的野生大豆G07256种子于浓H2S04中处理10min，去除泥膜。倒净浓 H2S04，用无菌水冲洗3?4遍后放置于湿润的滤纸上，25°C暗培养3d催芽。待芽长到约1? 2cm时，将其转移到盛有30 %草炭土、70 %普通土的育苗盆中，并将其放置于人工气候箱中 培养。待幼苗长至3周龄，迅速取新鲜叶片及根部3cm，置于-80°C保存。
[0033] 2、植物总RNA的提取
[0034] RNA提取具体步骤参见TIANGEN公司RNApreppure试剂盒说明书。
[0035] 3、cDNA第一链的合成
[0036] 以OligodT为引物进行cDNA第一条链的合成，方法参见Invitrogen公司 SuperScriptTMIIIReverseTranscriptase说明书。
[0037] 4、目的基因GsSKP21全长序列的扩增
[0038] 以野生大豆总cDNA为模板，采用GsSKP21sense和GsSKP21antisence引物PCR扩 增目的基因GsSKP21。引物序列如下：
[0039] GsSKP21sense:5, -ATGTCAGAAATTGACATGGCAGTTAT-3,；
[0040] GsSKP21antisence:5, -TCAAGCGTTTCGCCTCAGAAAACTAT-3，。
[0041] PCR反应的体系：20iiL5XPrimeSTAR?HSPCR缓冲液、8iiLdNTP混合物（A、G、 1\(：各2.51111)、21^上下游引物（1〇11]\〇、11^稀释5倍的通用模板、1111^1^11^了41严批 DNAPolymerase、ddH20 补足体积（总体积 100uL)。
[0042] PCR反应的条件（采用降落的方法）：94°C5min- [94°C30s-65°C30s(-0. 5°C/ circle) - 72°C80s]X20 - [94°C30s- 55°C30s- 72°C80s]X10 - 72°ClOmin- 4°C。
[0043] 将大小符合要求的目的基因电泳条带回收、克隆至pGEM-T载体（购于Promega公 司），转化大肠杆菌DH5a(全式金，⑶201-01)后送交测序，对测序结果进行DNAMAN分析， 确定目的基因的全长序列为l〇41bp。
[0044] 实施例2、GsSKP21在植物细胞内的亚细胞定位分析
[0045] 1、洋葱表皮细胞的准备
[0046] 在超净工作台上将洋葱剥掉1-2外层葱片，将靠近心部的葱片切成1. 5cmx1. 5cm 左右的小块，小心撕取内表皮，平铺于1/2MS固体培养基上25°C暗培养6小时。
[0047] 2、亚细胞定位载体的基因枪轰击
[0048] 金粉的洗涤和质粒DNA包埋参见美国Bio-Rad伯乐Helios基因枪系统说明书。 采用Sail、BamHI限制性酶切位点，将GsSKP21全长⑶S区克隆到亚细胞定位载体pBSK II-eGFP，得到GsSKP21亚细胞定位载体pBSKII-GsSKP21-eGFP。引物序列如下：
[0049] S-GsSKP21sense:5,-GCGTCGACATGTCAGAAATTGACATGGCAG-3'
[0050] S-GsSKP21antisense:5'-CGGGATCCAGCGTTTCGCCTCAGAAAACTA-3'
[0051] 采用基因枪轰击介导的瞬时表达方法将构建的pBSKII-GsSKP21-eGFP和pBSK II-eGFP(阴性对照）亚细胞定位载体分别轰击于洋葱表皮上。
[0052] 3、转染后的洋葱表皮细胞的培养
[0053] 将轰击了含目的基因的亚细胞定位载体的洋葱表皮置于新MS培养基上，暗培养 12小时以便后续观察。
[0054] 4.激光扫描共聚焦显微镜观察
[0055] 剪取洋葱表皮细胞装片，利用激光共聚焦显微镜下观察，GFP的激发波长为 488nm。结果表明：GsSKP21-eGFP融合蛋白定位于细胞核，而阴性对照eGFP则无定位倾向， 如图1所示。
[0056] 实施例3、GsSKP21在盐碱胁迫条件下的表达特性分析
[0057] 一、植物材料的处理
[0058] 取3周龄的野生大豆幼苗，分别置于200mMNaCl(高盐胁迫）、50mMNaHC03 (模拟 碱胁迫）条件下处理0^1、111、311、611、1211、2411、4811后迅速剪取幼嫩的叶片和根置于-801：保 存；同时取未处理〇h、lh、3h、6h、12h、24h、48h幼嫩的叶片和根作为对照。
[0059] 二、野生大豆材料的RNA提取及基因组DNA的去除
[0060] 1、取经上述不同方法处理后的野生大豆材料各约100mg，液氮研磨，用plant RNApr印PlantKit(TIANGEN，catno:DP402)试剂盒并参照试剂盒说明书提取RNA。
[0061] 2、采用TaKaRa公司的DNase I于37°C反应20-30min，去除RNA中的基因 组DNA。反应体系如下：RNA 40iiL、10XDNase I Buffer 5iiL、DNase I 2iiL、RNAase InhibitorO. 5uL、RNAase-freeddH202.5uL〇
[0062] 3、加入50 ii L的酚氯仿抽提一次，取上清，用等体积的异丙醇沉淀RNA，用70%乙 醇洗沉淀2次，将RNA溶于40ii L无菌RNAase-freeddH20。
[0063] 4、通过电泳和紫外分光光度计检测RNA的浓度和完整度。
[0064]三、通过Real-time PCR对GsSKP21基因进行表达量检测
[0065] 以上述总RNA反转录获得的cDNA为模板，采用R-GsSKP21sense和 R-GsSKP21antisense引物序列，通过Real-time PCR对GsSKP21基因进行表达量检测。引 物序列如下所示：
[0066] R-GsSKP21 sense: 5，-GGCTTTGTGAGTTGACATCTGC-3，；
[0067] R-GsSKP21antisense:5' -GTATCTCCTCTGGTGTTTTCCCT-3'。
[0068] PCR反应的体系为：2XSYBRPremixExTaq12.L、MgCl2(25mM) 10iiL、5,PCR and3'PCRPrimer(10iiM) 0? 5iiL、cDNA模板 1iiL、PCR-GradeH20 补足总体积至 25iiL。 PCR反应条件为：5(TC2min-95°C2min- [95°C15s-6(TC30s]X40 -95°Clmin-55°C30s -9530s。
[0069] Real-timePCR采用比较CT法（AACT)计算基因表达量，以野生大豆GAPDH基因 为内参基因，以未经处理的样品作为对照。目标基因表达差异通过经过处理的样本相对于 每个时间点未经处理的样本的倍数来表示。每个样品包括3次生物学重复和技术重复，数 据取3次重复的平均值，如果有一个数值的偏差比较大则取两个数据的平均值。原始数据 经标准化处理。标准化处理后的数据经T-test进行差异显著性分析。相对表达量计算方 g.2_AACT= 2_(ACT处理-ACT对照）=2_[(CT处理目的基因-CT处理内参基因）-(CT对照目的基因-CT对照内参基因）]
[0070] 结果表明：GsSKP21基因在野生大豆根和叶组织中，均可以被盐胁迫和碱胁迫诱 导表达，如图2所示。
[0071] 实施例4、转基因拟南芥的获得及鉴定
[0072] -、GsSKP21基因植物表达载体的构建及农杆菌的转化
[0073] 1、以野生大豆RNA反转录的cDNA为模板，采用T-GsSKP21_sense和 T-GsSKP21-antisensePCR扩增GsSKP21基因的全长CDS区。引物分别引入Sail和BamHI 酶切位点。引物序列（下划线代表酶切位点）如下：
[0074] T-GsSKP21-sense :5, -GCGTCGACATGTCAGAAATTGACATGGCAGTTAT-3'；
[0075] T-GsSKP21-antisense :5' -CGGGATCCTCAAGCGTTTCGCCTCAGAAAACTAT-3'。
[0076] 2、用限制性内切酶Sail和BamHI分别对获得的目的片段和pCAMBIA-2300载体 (购于广州吉赛生物科技有限公司，geneSeed798)进行双酶切，将酶切产物进行连接，转化 大肠杆菌DH5a，经PCR检测与酶切鉴定，得到植物表达载体，命名为pCAM2300-SKP21，并送 交测序。
[0077] 测序结果表明：插入pCAMBIA-2300载体上Sail和BamHI酶切位点间的外源基因 序列如SEQIDNo. 1所不，该基因编码的蛋白的氣基酸序列如序列2所不。将测序正确的 阳性克隆转化至农杆菌LBA4404 (购于Invitrogen?，18313-015)，即获得了重组农杆菌，并 经PCR鉴定得到阳性转化子，用于侵染拟南芥植株。
[0078] 二、GsSKP21转基因的拟南芥的获得及鉴定
[0079] 1、将拟南芥种子（哥伦比亚生态型）4°C春化3-7d后，播种于营养钵中（营养土、 君子兰土和蛭石按1:1:1混合），置于温室中培养（22°C，光照16h/天），待拟南芥抽出初生 苔后，剪去初生苔，待其抽出更多的次生苔且花开较盛时，可用于下述转化。
[0080] 2、挑取转化有pCAM2300-SKP21的重组农杆菌单菌落接种于5mLYEB(利福平 100mg/L、卡那霉素50mg/L)液体培养基中，28°C230rpm培养30h，按1 :100转接入500mL 新鲜的YEB(利福平100mg/L、卡那霉素50mg/L)液体培养基中，28°C230rpm培养16-24h， 测得00600约为1.5;41：5000印111离心101^11收集菌体，然后重悬于5001^的5%蔗糖溶液 (含 0? 02%silwet-77)中。
[0081] 3、将已经结夹的花蕾剪掉，把花序倒置浸入所得的含有重组农杆菌的蔗糖溶液 30s，转化完毕后，将植株套上塑料袋保湿，水平放置于低光强度下生长24h，即可正常培养。 一周后，重复侵染一次，可提高转化效率。
[0082] 4、将侵染后所收集的I；代种子进行消毒春化后，播种于含有50mg/L卡那霉素的 1/2MS固体培养基上。待种子萌发后，将绿色的阳性植株（^代）移栽至营养钵（营养土， 君子兰土，蛭石按1 :1 :1混合）中培养，并收集种子进行代筛选。
[0083] 5、将1\代抗性苗移栽至营养钵中培养，提取基因组DNA，进行PCR鉴定。采 用Trizol法提取转基因拟南芥植株的RNA并反转录成。DNA，以。DNA为模板采用 GsSKP21_sense和GsSKP21_antisense引物序列，通过Real-timePCR对转基因拟南芥的 GsSKP21基因进行表达量检测。引物序列如下：
[0084] GsSKP21-sense :5, -GCGGCTATGTGAGTTGACATCT-3,；
[0085] GsSKP21-antisense :5' -CTCGCGTATCTCCTCTGGAG-3'。
[0086] 以拟南芥Actin2基因为内参基因，以野生型拟南芥样品作为对照。目的基因表达 通过转基因植株与非转基因植物样本的差异倍数来表示。每个样品包括3次生物学重复和 技术重复，数据取3次重复的平均值，如果有一个数值的偏差比较大则取两个数据的平均 值。原始数据经标准化处理。标准化处理后的数据经T检验进行差异显著性分析。
[0087] 6、将RT-PCR阳性的代转基因拟南芥单株收种子，并分别播种于含50mg/L卡那 霉素的1/2MS培养基上进行筛选，观察T2代分离情况。如此重复，直至得到T3代转基因拟 南芥纯合体株系。
[0088] 实施例5、转基因拟南芥的抗逆功能分析
[0089] -、转基因拟南介的抗喊实验
[0090]1、种子萌发期分析
[0091] 选取饱满的野生型拟南芥（哥伦比亚生态型）和GsSKP21超量表达的拟南芥纯合 体种子，用5%次氯酸钠消毒液消毒lOmin后，于4°C春化3-7d。一部分播种于正常1/2MS 固体培养基上，观察表型并统计萌发率；一部分播种于含有7mM、8mM和9mMNaHC03的1/2MS 固体培养基上，每天观察表型并统计萌发率。所有实验技术重复和生物学重复各3次。
[0092] 结果表明：GsSKP21超量表达拟南芥种子的萌发率比野生型的萌发率高，同时幼 苗展叶率也高于野生型，说明GsSKP21超量表达拟南芥植株具有更强的抗碱能力，如图3A、 图3B、图3C所示。
[0093] 2、幼苗期分析
[0094] 选取饱满的野生型拟南芥（哥伦比亚生态型）和GsSKP21超量表达拟南芥纯合体 种子，用5%次氯酸钠消毒液消毒lOmin后，于4°C春化3d，播种于1/2MS固体培养基上。1 周后，挑选长势一致的转基因拟南芥和野生型拟南芥幼苗水平摆放于含有8mMNaHC03胁迫 培养基的平皿中，坚直生长，12d后观察各处理组和非处理组的拟南芥长势，3次生物学重 复。统计根长数据。所有实验技术重复和生物学重复各3次。T检验进行差异显著性分析。
[0095] 结果表明：GsSKP21超量表达拟南芥幼苗的根长比野生型植株长，叶子也比野生 型植株大，说明GsSKP21超量表达拟南芥植株具有更强的抗碱能力，如图3D和图3E所示。
[0096] 3、成苗期分析
[0097] 选取饱满的野生型拟南芥（哥伦比亚生态型）和GsSKP21超量表达拟南芥纯合体 种子，4°C春化3d后，播种于营养钵中（营养土，君子兰土，蛭石按1 :1 :1混合），置于温室中 培养（22°C，光照16h/d)。对于碱处理的苗每3d浇灌一次150mMNaHC03溶液。14d后观察 各处理组和非处理组的拟南芥长势统计存活率。所有实验技术重复和生物学重复各3次。
[0098] 结果表明：GsSKP21超量表达拟南芥幼苗的生长状态要比野生型植株好，并具有 绿色的叶子，说明GsSKP21超量表达能够提高植株的抗碱胁迫能力，如图4所示。
[0099] 二、转基因拟南芥对ABA敏感性的检测
[0100] 1、种子萌发期分析
[0101] 选取饱满的野生型拟南芥（哥伦比亚生态型）和GsSKP21超量表达拟南芥纯合体 种子，用5%次氯酸钠消毒液消毒lOmin后，于4°C春化3-7d，一部分播种于正常1/2MS固体 培养基上，观察表型并统计萌发率；一部分播种于含有0. 8yM或0. 9yMABA的1/2MS固体 培养基上，每天观察表型并统计萌发率。所有实验技术重复和生物学重复各3次。
[0102] 结果表明：GsSKP21超量表达拟南芥种子的萌发率比野生型的萌发率高，同时幼 苗展叶率也高于野生型，说明GsSKP21超量表达降低了拟南芥植株对ABA的敏感性，如图 5A、图5B、图5C所示。
[0103] 2、幼苗期分析
[0104] 选取饱满的野生型拟南芥（哥伦比亚生态型）和GsSKP21超量表达拟南芥纯合体 种子，用5%次氯酸钠消毒液消毒lOmin后，于4°C春化3d，播种于1/2MS固体培养基上。1 周后，挑选长势一致的转基因和野生型拟南芥幼苗水平摆放于含有20iiM或30iiMABA胁 迫培养基的平皿中，坚直生长，12d后观察各处理组和非处理组的拟南芥长势，3次生物学 重复。统计根长数据。所有实验技术重复和生物学重复各3次。T检验进行差异显著性分 析。
[0105] 结果表明：GsSKP21超量表达拟南芥幼苗的根长比野生型植株长，叶子也比野生 型植株大，说明GsSKP21超量表达降低了转基因拟南芥植株对ABA的敏感性，如图ro和图 5E所示。
[0106] 3、非生物胁迫及ABA相关Marker基因的表达量分析
[0107] 将14日龄野生型和超量表达植株拟南芥分别置于100yMABA条件下处理0h、6h 后迅速剪取植株幼嫩的部分，置于_80°C保存。采用Trizol法提取野生型和转基因拟南芥 植株的RNA并反转录成cDNA，以拟南芥Actin2基因为内参基因，以野生型拟南芥未处理 (Oh)样品作为对照。进行Real-timeRT-PCR分析及数据处理。T检验进行差异显著性分 析。引物序列如表1所示。
[0108] 表1弓丨物序列
[0109]
[0110]
【权利要求】
1. 蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质： a) 由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； b) 将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且与植物抗逆性相关的蛋白质。
2. 与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B3)中的任一种： B1)编码权利要求1所述蛋白的核酸分子； B2)含有B1)所述核酸分子的重组载体； B3)含有B1)所述核酸分子的重组菌、或含有B2)所述重组载体的重组菌。
3. 根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子的核苷酸序列 是序列表中序列1。
4. 权利要求1所述蛋白质、或权利要求2或3所述相关生物材料在提高植物抗逆性中 的应用。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述抗逆性为抗碱胁迫。
6. -种构建转基因植物的方法，包括如下步骤：使权利要求1所述蛋白质在出发植物 中过表达，进而使植物的抗逆性提高和/或使植物对ABA的敏感性降低。
7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述使权利要求1所述蛋白质在受体植 物中过表达的方法为：向出发植物中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因，得到转基因 植物；转基因植物与出发植物相比，抗逆性提高和/或对ABA的敏感性降低。
8. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述蛋白质的编码基因是序列表序 列1中第1-1041位核苷酸的DNA分子。
9. 根据权利要求6-8所述的方法，其特征在于：所述抗逆性为抗碱胁迫。
10. 根据权利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于：所述出发植物为单子叶植物或 双子叶植物；所述双子叶植物具体为拟南芥。
【文档编号】C12N15/29GK104387461SQ201410577857
【公开日】2015年3月4日 申请日期:2014年10月24日 优先权日:2014年10月24日
【发明者】朱延明, 孙晓丽, 刘艾林, 端木慧子, 肖佳雷, 于洋, 孙明哲, 段香波 申请人:东北农业大学, 黑龙江八一农垦大学