一组特异性识别北京基因型结核菌株抗原的核酸适配子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一组能特异结合结核分枝杆菌北京基因型菌株表面脂糖——甘露糖修饰的脂阿拉伯甘露聚糖（Mannosylated lipoarabinomannan，ManLAM）的核酸适配子及其用途。该组适配子是针对ManLAM的小分子单链DNA（ssDNA），其核苷酸序列如SEQ ID No.1-5所示。该小分子单链DNA具有与单克隆抗体类似功能，能直接并特异结合ManLAM。采用酶联寡核苷酸分析(Enzyme-linked oligonucleotide assay,ELONA)法，能在2小时内快速有效地检测肺结核、肺外结核等病人血清中的ManLAM抗原，并且直接识别活动性肺结核病人痰液中的ManLAM抗原，对ManLAM抗原的检测灵敏度可达到0.035μg/mL。该适配子制备简单，成本低，可作为一种有效的新型结核早期及潜伏感染的结核分枝杆菌抗原诊断试剂。
【专利说明】一组特异性识别北京基因型结核菌株抗原的核酸适配子及 其应用
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，特别涉及到利用分子生物学技术中的SELEX技术（指 数富集的配体系统进化技术）制备能够与北京基因型结核菌株表面脂糖一一甘露糖修饰的 脂阿拉伯甘露聚糖（Mannosylated lipoarabinomannan，ManLAM)高特异性和高亲和力的核 酸适配子，可用于制备诊断北京基因型结核分枝杆菌感染的检测试剂。
【背景技术】
[0002] 结核病是由结核分枝杆菌（M. tuberculosis)感染机体所引起的疾病，涉 及到全身多个脏器。目前，全球约1/3的人感染过结核分枝杆菌，每年约有200万 人死于结核感染（Dye C SS，Dolin P PV，Raviglione MC. Consensus statement. Global burden of tuberculosis:estimated incidence, prevalence, and mortality by country. W. H.0.Global Surveillance and Monitoring Project.J Am Med Assoc. 1999. 282:677-686.)，结核病正严重威胁人类的健康。目前我国结核感染的现状为： 每年新增结核病患达130万之多，每年因结核死亡的人数有15万，结核疫情呈现出患病率 高、死亡率高、耐药率高、年递减率低的现状，疫情严重度仅次于印度（全国结核病流行病 学抽样调查技术指导组.第四次全国结核病流行病学抽样调查报告.中华结核和呼吸杂 志? 2002. 25(1) : 3-7.)。
[0003] 能够引起结核病的结核分枝杆菌种类很多。结核分枝杆菌中有一类具有相似遗 传背景的北京基因型菌株。这类菌株的分布广泛，在世界各地都发现有北京基因型菌株的 流行，并造成多次爆发流行，人们提出北京基因型菌株可能是传播更迅速、致病性更强、以 及耐药形成更容易的一类菌株。而中国是一个结核病高发病率的国家，也是北京基因型 菌株高比例的地区。对北京基因型菌株分布的调查报道认为，在我国北方，北京基因型菌 株占绝对优势，可以达到70%至80%，国外甚至报道北京地区达到90% (van Soolingen D，Qian L，de Haas PE,et al. Predominance of a single genotype of Mycobacterium tuberculosis in countries of east Asia. J Clin Microbiol，1995,33,3234-3238.)， 在我国其他城市北京基因型菌株也有不同程度的流行。例如，宁夏（67%)、上海（89%) (Li WM, Wang SM,Pei XY，et al. [DNA fingerprinting of Mycobacterium tuberculosis strains from Beijing, Guangdong and Ningxia]. Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi，2003, 24, 381-384. ;Shen GM，Zha J，Xu L，et al. [Evaluation of the mycobacterial interspersed repetitive units typing as a practical approach in molecular epidemiology of Mycobacterium tuberculosis]. Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi，2005, 28, 292-296.)。因而，在我国北京基因型菌株的防治研究意义显得尤为重要。而 对结核分枝杆菌感染的诊断是一个亟待解决的难题。
[0004] 目前国际上针对结核分枝杆菌的检测技术分为三类：细菌学检测、免疫学诊 断、分子生物学诊断。细菌学检测是一种传统的检测手段，包括痰涂片抗酸染色以及痰 培养，已经在临床上广泛应用多年，是公认的检测结核分枝杆菌的标准性诊断，痰涂片 抗酸染色可能漏诊痰涂片阴性的患者，而痰培养又耗时长，需2-8周时间，因而其使用 也受到极大的限制（Martinez A，Balandrano S，Parissi A，et al. Evaluation of new external quality assessment guidelines involving random blinded rechecking of acid-fast bacilli smears in a pilot project setting in Mexico. Int J Tuberc Lung Dis. 2005. 9(3) : 301-305.)。免疫学诊断结核分枝杆菌的方法有结核菌素试验以及特异性 T淋巴细胞IFN-y释放试验。这两者检测结核抗原特异性T细胞反应，结核菌素试验是利 用纯蛋白衍化物（purified protein derivative，PPD)诱导的迟发型反应来对T细胞的功 能进行检测，但PH)中大多数蛋白成分是各种分枝杆菌所共有成分，尤其是接种BCG后与感 染结核分枝杆菌后，这两者很难区别，该方法存在特异性差的弊端。所以建立一种新型检测 方法，实现对结核分支杆菌早期诊断，对于控制结核病疫情意义重大。分子生物学诊断主要 包括DNA探针法、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR)、定量PCR、以及近年 发展的基于PCR的XpertMTB/RIF的方法，具有灵敏和特异性高的优点，其中，PCR的方法主 要针对结核分枝杆菌基因组中一段保守序列，通过PCR的方法能快速检测结核分枝杆菌， 但存在一定假阴性和假阳性，如可能因所检测的变异而导致假阴性，且成本高，需要较贵仪 器设备，难以在流行区或贫困地区普及，而且无法区分是活菌还是死菌，因此不能用于化疗 后监测。
[0005] 核酸适配子（aptamer)是一种生物祀分子的人工单链寡核苷酸配体，通过 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)技术从随机单 链寡核苷酸文库中筛选获得。核酸适配子筛选的基本步骤如下：设计并合成随机单链寡核 苷酸文库；将文库与靶标共孵育，使文库中能与靶标特异性结合的寡核苷酸与靶标形成复 合物，分离复合物并洗脱寡核苷酸，以洗脱的寡核苷酸为模板进行PCR扩增，制备成新的单 链随机寡核苷酸文库，开始下一轮筛选；重复数轮孵育_分离-扩增，与靶标高特异性和高 亲和力结合的核酸序列将留在文库中并被指数富集；对最后一轮筛选后制备的文库进行克 隆、测序，长度及两端序列与文库相符的单链寡核苷酸序列即为核酸适配子；测定各核酸适 配子与靶标结合的特异性和亲和力，选出能高特异性和高亲和力结合靶标者，即可应用于 靶标的检测分析。
[0006] 核酸适配子的功能与抗体类似，但与抗体相比具有许多优点：①高特异性和高亲 和力：核酸适配子能够分辨出靶分子结构上的细微差别，亲和力可强于天然配体；②靶标 广泛：从有机小分子、生物大分子到病毒颗粒、完整细胞等均可作为筛选核酸适配子的靶 标；③稳定性好：核酸适配子可长期保存，人工合成而无批间差异，可在常温下运输；④改 建和修饰容易：可在核酸适配子的特定部位进行精确的标记、修饰或核苷酸替换；⑤应用 优势：核酸适配子无免疫原性，可在体内反复使用；分子小，方便于体内影像诊断和治疗。 核酸适配子在人类疾病的诊断方面显示出良好的应用前景。在微生物检测方面，特别是对 一些致病性细菌或病毒的研宄，虽然未知其内部结构、功能及这些物质的表位，但也可将其 作为靶物质，通过SELEX过程筛选到与其对应的适配子，用以检测靶物质，目前已成为该领 域的研宄探索热点。
【发明内容】
[0007] 本发明主要致力于结核分枝杆菌早期和潜伏感染的ManLAM抗原的检测，筛选针 对结核分枝杆菌北京基因型菌株表面特异性ManLAM的单链DNA(ssDNA)适配子，并用酶联 寡核苷酸分析法（Enzyme-linked oligonucleotide assay, ELONA)检测血清中的 ManLAM 抗原以及痰液中的结核杆菌，达到诊断结核感染的目的。
[0008] 甘露糖加帽的脂阿拉伯甘露聚糖（mannose-capped lipoarabinom-anan, ManLAM) 是结核分枝杆菌（包括牛结核分枝杆菌）和BCG等慢生长的分枝杆菌细胞壁表面特 有的月旨糖(Nigou J, Gilleron M, Puzo G. Lipoarabinomannans:from structure to biosynthesis. Biochimie. 2003, 85 (1-2) : 153-166.)。然而 ManLAM 在不同的分枝杆 菌中其结构仍然存在着差异（Rojas M, Barrera LF, Puzo G, Garcia LF. Differential induction of apoptosis by virulent Mycobacterium tuberculosis in resistant and susceptible murine macrophages:role of nitric oxide and mycobacterial products. J Immunol. 1997, 159(3) : 1352-1361.)，针对不同菌种间ManLAM结构的差异，本发明设计并 筛选出了与临床上主要流行的结核分枝杆菌北京株表面的ManLAM特异性结合的适配子。
[0009] 因此，本发明的第一个目的在于提供一组能特异性地、高亲和力地结合结核分枝 杆菌北京基因型菌株ManLAM抗原（以下简称ManLAM)的ssDNA适配子的一级序列，如SEQ ID No. 1-5 所示。
[0010] 本发明的第二个目的在于提供在上述DNA适配子5'端或3'端进行生物素、FITC 或地高辛化学修饰的适配子。
[0011] 本发明的目的还在于提供上述DNA适配子在制备检测结核分枝杆菌北京基因型 菌株ManLAM抗原诊断试剂以及结核病感染诊断试剂中的应用。
[0012] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0013] 本发明通过随机单链DNA文库以及引物的构建、SELEX筛选、PCR扩增、亲和力测 定、体外不同细菌结合实验等得到具有与结核分支杆菌ManLAM脂糖抗原的高特异性、高亲 和力的DNA适配子，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1-5所示。通过免疫学实验证实该适配子 可以灵敏地检测血清或体液中ManLAM脂糖抗原，准确诊断结核病。
[0014] 本发明筛选并制备得到以ManLAM脂糖为靶标的ssDNA适配子，该适配子能高亲和 力、高特异性地与该蛋白结合。我们直接将该适配子运用于临床血清样品和痰液标本的检 测，结果表明，无论是肺内结核还是肺外结核（肠结核骨结核、体腔结核、脑膜结核、附睾结 核、淋巴结核），运用该适配子均能快速有效检测。相对于目前诊断结核感染的T-SP0T法， 该方法实施更为简单，无需分离患者的外周血单核细胞（PBMC)。同时，本发明克服了传统上 检测结核病人痰液细菌的抗酸染色灵敏度低的严重问题，也克服了传统上仅能检测结核病 人血清中抗体，而不能检测抗原的局限性，以及不能诊断窗口期早期感染的严重问题，该方 法成本较少。此外，核酸适配子的功能与抗体类似，因此在制备治疗结核的药物中也具潜在 的应用价值。本发明采用的基于适配子的EL0NA法与临床现行结核诊断方法的不同优缺点 比较见表1。
[0015] 表1 EL0NA与临床现行结核诊断方法的比较
[0016]
【权利要求】
1. 一组特异识别结核分枝杆菌北京基因型菌株表面甘露糖修饰的脂阿拉伯甘露聚糖 的核酸适配子，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1-5所示。
2. 权利要求1所述的结核分枝杆菌北京基因型菌株表面甘露糖修饰的脂阿拉伯甘露 聚糖的核酸适配子，其特征在于其5'端或3'端可以进行生物素、FITC或地高辛化学修饰。
3. 权利要求1所述的结核分枝杆菌北京基因型菌株表面甘露糖修饰的脂阿拉伯甘露 聚糖的核酸适配子在制备结核分枝杆菌北京基因型菌株表面甘露糖修饰的脂阿拉伯甘露 聚糖抗原检测试剂以及结核病感染诊断试剂中的应用。
【文档编号】C12N15/115GK104450724SQ201410798757
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月19日 优先权日:2014年12月19日
【发明者】章晓联, 唐晓磊 申请人:武汉大学