人免疫缺陷病毒的疫苗及其治疗方法

专利名称：人免疫缺陷病毒的疫苗及其治疗方法
本申请是1988年2月3日递交的美国专利申请151，976的部分继续申请，而后者又是1986年10月16日递交的美国专利申请920，197的部分继续申请(现在的系列号为585，266)。这些申请以及本文中引用的文献均以参考文献形式列入本说明书中。
1-型人免疫缺陷病毒(HIV-1)是一种引起全身性感染的逆病毒，其主要病理学在于免疫系统，而且是引起获得性免疫缺陷综合症(艾滋病)的病原体〔Barre-Sinoussi，et al，Science，220868-871(1983);Popovic et al。Science，224497-500(1984)〕。HIV-1的临床分离物也被称作淋巴结病相关病毒〔Feorino，et al.Science，22569-72(1984)〕和艾滋病相关病毒〔Levy et al.，Science 225840-842(1984)〕。
艾滋病已变得越来越普遍，其疫苗的开发已成为世界公共健康领域的一个主要课题。大部分感染了HIV-1的患者因T4淋巴细胞的减少而导致免疫功能的逐渐丧失。在这些T4细胞及某些神经细胞的表面上具有称为CD4的分子。HIV-1通过位于病毒颗粒区膜上的受体识别CD4分子，进入这些细胞并最终复制和杀死细胞。有效的艾滋病疫苗可望引发产生与HIV-1包膜结合的抗体，从而防止其感染T4淋巴细胞或其它易感细胞。
疫苗通常是在接触患病生物体之前以预防剂的形式给予健康个体的。但是，也可以考虑将有效的艾滋病疫苗在接触后免疫中作为对该疾病的免疫疗法剂来使用(Salk，J.，Nature，327473-476(1987))。
在艾滋病疫苗的开发中，普遍认为HIV-1包膜(“env”)是最有希望的候选者〔Francis and Petricciani.New Eng.J.Med.，1586-1559(1985);Vogt and Hirsh，Reviews of Infeetious Disease，8991-1000(1986);Fauci，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，839278-9283〕。最初合成的HIV-1包膜蛋白是分子量为160，000的糖蛋白(gp 160)，然后该gp 160前体被切割成分子量为120，000的外部糖蛋白(gp 120)和分子量为41，000的跨膜糖蛋白(gp 41)。这些包膜蛋白是艾滋病患者体内抗体的主要靶抗原(Barin，et al.，Science，2281094-1096(1985))。已证明天然HIV-1 gp 120是免疾原性的并且能够在啮齿动物、山羊、恒河猴和黑猩猩中诱导产生中和抗体(Robey，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA837023-7027(1986))。
由于被感染细胞中天然HIV-1包膜蛋白的水平极低，并且存在与由HIV-1感染的细胞制备艾滋病疫苗有关的危险，所以已采用重组DNA方法来生产用作艾滋病疫苗的HIV-1包膜抗原。由于重组DNA技术能够产生大量安全且经济的免疫原，因此它是生产艾滋病亚单位疫苗的最佳选择。已在遗传上改变的牛痘病毒重组体中表达了HIV-1包膜蛋白〔Chakrabarti，et al.，Nature，320535-537(1986);Huet al.，Nature，320537-540(1986)Kieny，et al.，Biotechnology，4790-795(1986)〕。另外，也已在细菌细胞(Patney，et al.，Science，2341392-1395(1986)，哺乳动物细胞(Lasky，et al，Science，23209-12(1986))及昆虫细胞中表达了包膜蛋白。由HIV-1 gp41氨基酸序列衍生的合成肽也被认为是艾滋病疫苗的候选者(Kenneely，et al.，(1986))。但是，利用这些材料和方法并未成功地生产出艾滋病疫苗。
利用杆状病毒-昆虫细胞载体系统生产重组HIV-1包膜蛋白是1986年10月16日递交的共同未决和共同转让的美国专利申请系列号920，197中所公开的发明的一个方面(本申请的系列号为585，266)(又见系列号151，976)。
已证明杆状病毒系统在生产HIV-1蛋白及其它蛋白中具有通用性。例如，已将杆状病毒苜蓿银纹夜蛾(Autographa Californica)核多角体病毒(AcNPV)用作载体，在被感染的秋粘虫(Spodoptera frugiperela，fall armyworm)细胞(sfg细胞)中表达HIV-1包膜基因的全长gp160及其各个部分。在上述共同未决专利申请中也公开了截断的gp160基因(重组体号Ac3046)、由重组体Ac3046产生的蛋白质以及包括兵豆植物凝血素亲和层析和凝胶过滤层析在内的Ac3046基因产物纯化技术。已发现以该方式纯化并聚集成颗粒的gp160蛋白在啮齿动物及灵长类动物中具有很高的免疫原性。
理想的艾滋病疫苗除了满足基本上为生物纯和非热原性的要求外，还应在一次或几次注射后能提供抗HIV-1感染的终身保护。活的病毒疫苗通常如此。当利用杀死的细菌或病毒或其分离物(如类毒素或蛋白质)制备疫苗时，常常产生很弱的抗体应答及短期的免疫性。为了克服或尽量减少疫苗的这些缺陷，可以使用称作佐剂的附加成分。佐剂是帮助刺激免疫应答的物质，人疫苗中常用的佐剂是铝盐(磷酸铝或氢氧化铝)的凝胶，通常称为明矾佐剂〔Bomford，et al.，“Adjuvants”，Animal Cell Biotech.Vol.2235-250，Academic Press Inc.(London1985)〕。
本发明提供了人体免疫缺陷病毒(HIV)的疫苗及其治疗方法，它包括给被感染个体或易感个体服用重组HIV包膜蛋白。在一优选实施方案中，可将包膜蛋白纯化、聚集并与佐剂(如明矾)结合以用作疫苗。
下面结合


本发明的具体内容。
图1举例说明自大肠杆菌质粒pNA2中分离HIV-1包膜基因(env)的克隆方案。影线区为HIV-1 DNA序列。开放区来自克隆载体。质粒p1774中的黑区是由合成的寡核苷酸构建的，并作为SmaI-KpnI片段被引入到质粒p1614的SmaI-KpnI位点中。该合成寡核苷酸的序列已被列出。
图2说明了构建重组质粒载体(p3046)的方案，该载体又被用于构建杆状病毒表达载体Ac3046。质粒PMGS3在位置4.00处克隆位点的两侧含有得自杆状病毒AcNPV的序列(交叉影线区)。该位点是SmaI、KpnI和BglⅡ的特定限制性核酸内切酶切点。AcNPV多角体启动子位于4.00位置的5′方向，序列5′-TAATTAATTAA-3′位于3′方向，且在所有三个读码中均有一个转译终止密码子。质粒p1774及合成寡核苷酸区域的序列如图1所示。除SmaI和Bgl Ⅱ位点之间的序列(p1774的HIV-1包膜基因在此插入)外，质粒p3046含有所有的PMGS3。
图3显示侧翼Ac3046 gp160编码序列的DNA核苷酸序列。+1和+2264之间的3046env DNA序列示于图4中。
图4a-4k显示Ac3046(+1至+2264之间)中HIV-1 enV基因片段的真正DNA序列以及enV基因5′末端的合成寡核苷酸序列。DNA序列上面列出限制性核酸内切酶位点的定位，DNA序列下面列出了推测的氨基酸序列。在左和右侧标有碱基的编号。
图5a-5d比较了来自Ac3046的env基因的DNA序列和已公开的来自LAV-1的env基因序列。上面为LAV-1序列，下面为Ac3046的序列。LAV-1序列下面的线(1)表示Ac3046中的序列在该位置相同。所使用的DNA序列编号是Wain-Hobson等(Cell，409-17(1985))所述的编号。
图6显示人HIV-1抗体阳性血清(上图)以及得自用gp160(IJ55，KL55)或gp120(AB55，CD55，GF55)免疫的动物恒河猴血清(下图)的ELISA终点稀释滴度。ELISA滴度是通过高度纯化的gp120和gp160蛋白测得的。专一性结合抗体是用羊抗人IgG HRp连接物测定的。试验中产生阳性反应的最高血清稀释度即为滴度。
图7以表的形式总结了已接种过疫苗的血清阳性患者体内由gp160疫苗诱导的免疫反应。
图8(A和B)显示疫苗诱导的抗特异性HIV包膜表面抗原决定簇的抗体反应。
图9显示在接种过的血清阳性个体中由疫苗诱导的抗gp160的T-细胞繁殖反应。
图10(A-C)显示与接种相关的淋巴细胞增殖性反应。
图11是在应答者和非应答者中CD4细胞变化的百分数与时间的关系图。
已发现重组HIV-1 gp160包膜蛋白(“rgp 160”)，特别是当它吸附于如明矾(如磷酸铝)等佐剂上时尤其适于用作艾滋病疫苗。本发明的一个方面是具有部分HIV-1包膜基因编码序列的Ac NPV表达载体，所说的部分包括见于重组克隆3046中的氨基酸1-757。本发明的另一个方面是在昆虫细胞中生产HIV-1包膜蛋白(及蛋白质本身)-尤其是由氨基酸序列1-757(即03046)编码的rgp160蛋白。
本发明还包括由产生3046蛋白的重组杆状病毒的基因产物中纯化和形成重组包膜蛋白颗粒并将3046质粒吸附于磷酸铝聚集体上。
本发明也涉及预防和/或治疗艾滋病或HIV感染的疫苗以及预防或治疗艾滋病或HIV感染的方法。
以下实施例举例说明本发明，但并不限制其范围。
在共同未决且共同转让的美国专利申请系列号920，197(现在的系列号为585，260)中叙述了重组的杆状病毒即苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)，它含有编码HIV包膜蛋白1-757位氨基酸的截短的HIV-1 gp160基因(重组体Ac3046)。其中还公开了用于构建含有HIV-1基因或其部分之重组杆状病毒的克隆步骤，它也列为本文参考文献。
以下是对用于构建Ac3046表达载体的遗传工程步骤的详细说明。所使用的材料，包括酶和免疫试剂均通过商业途径获得。并且提供了如何完成和利用本发明的实施例。
本发明也考虑到统称为rgp160的其它重组包膜蛋白，包括重组gp120和gp41蛋白。Ac3046仅仅是本发明表达载体和重组包膜蛋白的一个实例。
实施例1携带HIV-1氨基酸1-757编码序列的杆状病毒重组体Ac3046的构建在杆状病毒载体中克隆和表达外源蛋白质编码序列需要将该编码序列与多角体启动子及上游序列排列在一端，并将杆状病毒编码序列排列于另一端。这样排列将使得与杆状病毒基因组的同源重组会导致与多角体启动子无活性多角体基因一起排列之外源编码序列的转移。
因此，已设计出大量的用于构建HIV包膜基因的插入载体。设计下面所述的插入载体MGS3以用于提供ATG转译起始密码子。将外源序列插入该载体必须使得由起始密码子建立的转译码在整个外源序列中正确维持。
插入载体MGS3是由噬斑纯化的AcMNPV分离物(WT-1)分离的DNA的EcoRI-Ⅰ限制性片段克隆构建的。MGS3被设计成由以下结构组成(a)多角体基因的ATG起始密码子上游的4000bp序列;(b)通过定点诱变引入的多聚连接子，它由相应的多角体密码子位置处的ATG起始密码子及限制性酶切位点Sma I、KPn I、Bgl Ⅱ和通用的终止密码子片段组成;(c)自Kpn Ⅰ限制位点(位于多角体基因内)延伸至ECORI-Ⅰ克隆的末端ECORI限制位点的1700bp序列(见图2)。
实施例2构建携带LAV env编码序列的杆状病毒重组体定名为NA2的重组质粒(图1)由插入至pUC18中的完整HIV-1前病毒的21.8Kb片段组成。由于该克隆在转染某些人细胞后能够产生病毒，所以有报道认为它是具有感染性的(Adachi，et al.，J.Virol.59284-291(1986))。NA2中含有的完整包膜基因序列得自HIV的LAV病毒株(Barre-Sinoussi(1983))。
按以下所述及图1中所示的方法分离并操作HIV-1包膜基因。包膜基因最初是以3846bp EcoRI/SacI限制片段的形式自NA2中分离出来并被克隆到PUC19的EcoRI/SacI限制性位点。所产生的质粒称作p708。
然后作为2800bp Kpn I限制性片段再次分离包膜基因并克隆到PUC18的Kpn I限制性位点中。所产生的质粒命名为p1614。
p1614中的Kpn I限制性片段含有稍微截短的小部分HIV包膜基因，使得其N-末端相应序列缺失121bp。基因中的该缺失部分(包含了信号肽序列)通过插入双链合成寡聚物而被取代。被插入的寡聚物是利用优选的多角体基因密码子根据LAV氨基酸序列设计的。为便于进一步操作，将一新的SmaI限制序列同时引入，以代替ATG起始密码子。ATG起始密码子将由杆状病毒插入载体提供。所产生的质粒定名为p1774。
参照图2，得自p1774且含有HIV-1包膜之各个区域的编码序列的限制性片段克隆到MGS插入载体(如MGS3)中，从而使插入载体的ATG起始密码子与包膜基因的密码子位于同一读码中。构建物p3046由自插入到质粒载体pMGS3之SmaI/Bgl Ⅱ位点中的p1774分离的SmaI/BamHI限制性片段组成。该克隆含有gp160的氨基酸1-757的编码序列并利用了由MGS3载体提供的终止密码子。
实施例3制备并筛选重组杆状病毒将HIV env基因重组质粒p3046与AcMNPVDNA(WT-1)一起用磷酸钙沉淀，并加到未感染的秋粘虫细胞中。然后通过同源重组将嵌合基因插入AcMNPV基因组中。根据闭合阴性噬斑形态鉴定重组病毒。这类噬斑显示有可鉴别的细胞病变效应，但无核闭合。进行两次另外的连续噬斑纯化以获得重组病毒。通过比较重组病毒DNA与野生型病毒DNA的限制性切割和杂交特征来分析HIV env序列的位点特异性插入。
实施例4在感染的昆虫细胞中表达得自重组杆状病毒的HIV env在昆虫细胞中表达得自重组病毒的HIV env序列将导致初级转译产物的合成。该初级产物将由重组载体所提供的密码子转译的氨基酸组成。其结果得到一种蛋白质，它含有自多角体启动子下游表达载体的ATG起始密码子到表达载体(如rgp160)上转译终止信号之间的密码子所编码的所有氨基酸。Ac3046之初级转译产物的末端应为Met-Pro-Gly-Arg-Val，其中4位上的Arg为原始LAV克隆2位上的Arg。Met-Pro-Gly密码子是作为该克隆方案的结果提供的。
实施例5gp160插入及其侧翼DNA的核苷酸序列在分离自病毒表达载体Ac3046 DNA的限制性酶切片段中测定出gp160插入子及侧翼DNA的核苷酸序列。序列分析方法包括以下步骤。通过Ac3046病毒DNA的限制性消化纯化3.9Kb EcoRI-BamHI片段。已从存在于用来大量生产疫苗之细胞培养基内的细胞外病毒中制得Ac3046病毒DNA。
如图2所示，3.9Kb EcoRV-BamHI片段由完整的gp160基因及100bp上游和约1000bp下游侧翼DNA组成。其中，完整gp160基因的核苷酸序列已被测定，它包括100bp上游和100bp下游侧翼DNA。
简单地说，序列分析的结果揭示嵌合构建物正如克隆方案所预期的一样。gp160的序列基本上与Wain-Hobson等(1985)所报道的相同。在左右侧的转译起始和终止密码子之间的2253碱基的序列推测为751个氨基酸的密码子和28个潜在的N-连接的糖基化位点。所估计的包括糖残基在内的该rgp160的分子量约为145，000。
对200个碱基的侧翼DNA所进行的序列分析表明了如图3、4和5所示的正确插入。
实施例6gp160的氨基酸序列利用标准的自动Edman降解法和HPLC方法测得gp160的前15个残基的N-末端序列与由DNA序列推断的序列完全相同。gp160蛋白上未出现N-末端甲硫氨酸。这与在无N-末端甲硫氨酸时也产生AcNPV多角体蛋白的观察结果相符。正如已通过分析AcNPU3046 DNA和纯化的gp160所确定的那样，现将真实gp160 DNA和N-末端蛋白质序列总结如下(表1)。
表1Ac NPV 3046表达载体中的LAV env基因残基
将这些结果与如下(表2)所示的原始LAV-1克隆进行比较。
表2原始LAV-1克隆中的LAV env基因残基1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Met Arg Val Lys Glu Lys Tyr Gln His Leu Trp Arg Trp GlyATG AGA GTG AAG GAG AAG TAT CAG CAC TTG TGG AGA TGG GGG实施例7重组体gp160的纯化本发明所涉及的一个方面是提取和纯化Ac3046表达载体中所编码的重组HIV-1包膜蛋白的方法。重组HIV-1包膜蛋白gp160是用Ac3046感染4-5天时在秋粘虫细胞中产生的。该rgp160蛋白的纯化包括如下步骤1.洗涤细胞2.细胞裂解3.凝胶过滤层析4.兵豆植物凝血素亲和层析5.透析该实施例叙述了自大约2×109个Ac3046感染的细胞中纯化重组gp160。
1.洗涤细胞在含有50mM Tris缓冲液(PH7.5)、1mM EDTA和1% Triton X-100的缓冲液中洗涤被感染的细胞。将细胞重新悬浮于该缓冲液中，用常规方法均浆，并以5000rpm离心20分钟。将该方法重复三次。
2.细胞裂解在50mM Tris缓冲液(PH8.0-8.5)、4%脱氧胆酸盐及1%β-巯基乙醇中通过超声处理裂解洗涤过的细胞。超声波处理按常规方法进行。处理之后只有核膜残余物是完整的，以5000rpm离心30分钟将其除去。通过光学显微镜观察确定含有提取的gp160的上清液中没有完整细胞。
3.凝胶过滤在填充了Sephacryl树脂(Pharmacia)的Pharmacia 5.0×50cm玻璃柱上进行凝胶过滤。总的柱床体积为约1750ml。为除去热原并清洗柱及连接管，至少用6升0.1N NaOH洗柱，总时间为24小时。将自柱中流出的液体连接至UV流动池、监视器及曲线记录仪(Pharmacia)上，然后用4升凝胶过滤缓冲液平衡。将粗gp160在柱顶上样并用凝胶过滤缓冲液展层。
该柱将粗混合物分离成三个主要的紫外吸收部分。第1峰在约500-700ml缓冲液之间流出，第二峰在700-1400ml缓冲液之间流出，第三峰在1400-1900ml缓冲液之间流出。在小型分析柱上观察到同样的洗涤曲线，它已测得第一峰是分子量为≥2，000，000的材料。
由于高分子量脂质及脂质复合物的浓缩而使得该峰为半透明的。该峰也含有自被感染细胞提取的10%-20%的gp160很显然，这部分gp160已与其本身或其它细胞成分复合，形成了高分子量聚集体。
第二宽峰含有大部分gp160及分子量在大约18，000至200，000之间的蛋白质。
第三峰含有很少的蛋白质，大部分紫外吸收是由于样品中存在的β-巯基乙醇所致。
当首先通过紫外吸收示踪检测第二峰时，是将柱流出物直接加到兵豆植物凝血素柱上。一旦第二峰从柱中洗出，立即从兵豆植物凝血素柱上移开流出物，并导入溶液中。
4.兵豆植物凝血素兵豆植物凝血素亲和凝胶基质(Lentil Lectin-Sepharose 4B)是以散装形式自Pharmacia购得的。在Sephadex上通过亲和层析分离兵豆植物凝血素达到98%以上的纯度，然后利用溴化氰将其偶联到Sepharose 4B上而固相化。该基质中每毫升凝胶含有约2mg配体。兵豆植物凝血素柱为含有125ml兵豆植物凝血素-Sepharose 4B凝胶的510×30cm玻璃柱(Pharmacia)。亲和基质在经过彻底洗涤并按厂商推荐的方法再生后，可以反复使用。不使用时将该凝胶加在由0.9%NaCl、1mM MnCl2、1mM CaCl2和0.01%乙基录硫代水杨酸钠组成的溶液中在柱内保存。每次使用前用250ml上述兵豆植物凝血素缓冲液洗涤和平衡该柱。
当自上述凝胶过滤柱上洗脱后，将粗gp160直接上柱。粗gp160一旦与柱结合，即用含有0.1%脱氧胆酸盐的800ml兵豆植物凝血素缓冲液洗柱。在这些条件下，所有gp160均与柱结合。用兵豆植物凝血素及0.3M α-甲基甘露糖苷洗脱已结合的糖蛋白，并通过紫外光监测器于波长280nm处监测之。
5.透析用常规透析方法除去糖和脱氧胆酸盐。
自1升感染的细胞纯化gp160的方法可总结于下面的表3中。
在另一实施方案中，可用常规的离子交换层析(阴离子型或阳离子型)代替凝胶过滤。同样，各步骤的顺序并不严格例如，可在兵豆植物凝血素纯化步骤之后进行凝胶过滤或离子交换层析。根据本发明，也可使用其它试剂。例如，可用其它去污剂代替脱氧胆酸纯化重组蛋白。这类去污剂包括非离子去污剂，如Tween 20(多山梨醇酯20)、Tween 80、Lubrol和Triton x-100。
1总蛋白是根据280nm处的吸光率估计的。
实施例8A。gp160颗粒的装配作为本发明的一个方面，已发现被纯化过程中gp160抗原能够被装配成分子量等于或大于2，000，000的颗粒。从细胞中提取的gp160蛋白是由80-90%单体(分子量160，000)和10-20%聚合物(颗粒形式)组成的混合物。对该部分(凝胶过滤柱中流出的第一峰)中纯化gp160的尝试提示它与其它细胞蛋白质甚至与膜碎片复合。但是，在自凝胶过滤柱中流出的第二峰中的gp160分子量约为160，000-300，000，因此它主要是单体或二聚体形式的。
gp160聚集物或聚合物的形成发生在兵豆植物凝血素柱展层过程中。已明确无论是在0.5%脱氧胆酸盐(它约为脱氧胆酸盐的0.2%临界胶囊浓度(CMC))中从植物凝血素柱洗脱的，还是在0.1%脱氧胆酸盐中从柱上洗脱的，该抗原均形成聚集物。
在高分辨率FPLC Superose 12柱(Pharmacia)上测定聚集物的大小。不同批号有代表性的纯化的gp160样品大多具有等于或大于蓝葡聚糖标准品的分子量(2，000，000)。
由Schwaller等(1989)所进行的交联研究证实，昆虫细胞中产生的gp160是由相等亚单位组成的四聚体。该研究还显示HIV感染的细胞及病毒颗粒中的gp160为四聚体。因此，重组gp160颗粒可能具有与天然HIV gp160相似的三级和四级结构。
为了形成为gp160正确折叠所需的抗原决定簇，合适的三维结构可能很重要。很可能是由于非糖基化蛋白在与兵豆植物凝血素柱结合和洗涤过程中失去了与gp160抗原的联系，gp160的疏水部分开始形成分子内联系。由于其浓度可保持在CMC以上，脱氧胆酸盐很可能不与gp160结合，抗原仍可形成复合物。当按照本发明的方法纯化该抗原时它便装配成聚合物，似乎是该蛋白质的固有性质。这可能是存在于gp160蛋白上的非常疏水的N-末端序列导致该蛋白质具有形成颗粒的天然能力。纯化之后，可在不明显丧失蛋白质的情况下通过0.2μm的乙酸纤维素滤膜对gp160复合物进行无菌过滤。
B.分析颗粒的形成用电子显微镜观察纯化的gp160颗粒，证明它们是类似蛋白质的30-100μm的球形颗粒。
鉴定颗粒存在的另一项试验是用凝胶过滤法分析纯化的gp160。将约100μg gp160加到Superose 12，FPLC凝胶过滤HR 10/30柱(Pharmacia，Inc.)上。该柱首先用蛋白质分子量标准品校正。自该柱获得的蛋白质分布图具有很高的可重复性;洗脱体积与蛋白质标准品的分子量成反比。该柱将单体gp 160与多聚体分离开并排除分子量等于或大于2×106的球状蛋白质。在该柱上展层时基本上所有纯化的gp160均在外水容积中洗脱，因此其分子量大小等于或大于2×106(2，000，000)。
实施例9A。gp160吸附到明矾上不溶性铝化合物作为免疫佐剂的效力取决于抗原在固相表面上吸附的完全度。作为本发明的一部分，已发现可制得这样的明矾组合物，它们可在不减少gp160-明矾复合物作为免疫原之效力的PH条件下有效地吸附gp160。在明矾(磷酸铝凝胶)组合物形成过程中所要控制的因素有1.抗原吸附于明矾上的最佳PH约为5.0。但是，已发现与PH7.5相比，在PH6.5时gp160丧失免疫原性，因此要在PH7.1±0.1条件下制备明矾。已发现在该PH值时基本上100%的gp160仍将被吸附在明矾上。
2.来自NaCl的离子强度相对较低，且小于0.15M。
3.相对于磷酸钠具有摩尔过量的氯化铝，以保证上清液中没有游离的磷酸根离子。
4.将gp160抗原加至刚配制的明矾中，以终止结晶生长并尽量减小颗粒大小。
如下所述，制备200ml明矾并将纯化gp160吸附到明矾上的方法应保证抗原的最终浓度为40μg/ml。
3.试剂的制备(共配制200ml)
在100ml无菌无热原瓶中制备下述溶液。混合溶液1和溶液2的盐及氢氧化钠，并通过0.2μm的乙酸纤维素滤膜过滤至100ml无菌无热原瓶中。
溶液1 AlCl3·6H2O 0.895gNaHAc·3H2O 0.136g溶于40ml注射用水(WFI)中,0.2μm滤膜过滤溶液2 Na3PO4·12H2O 1.234g溶于40ml WFI, 0.2μm滤膜过滤溶液3 NaOH 2.0g溶于100ml WFI,0.2μm滤膜过滤溶液4 Tris 1.25g溶于100ml WFI,加1ml至90ml WFI,用0.5N HLL调节pH至7.5,并用WFI加至100ml将溶液高压灭菌30分钟;缓慢抽空。冷却至室温。
C.明矾的生成1.用25ml无菌的一次性吸管将溶液1(氯化铝-乙酸钠)加到配制容器中，记录溶液1的体积并开始搅拌溶液。
2.用25ml无菌一次性吸管将溶液2(磷酸钠)加至溶液中，继续搅拌至形成沉淀，记录溶液2的体积。
3.加入3ml溶液3(氢氧化钠)并继续搅拌5分钟、取0.5ml样品测定PH值。如果PH低于7.0，再加0.5ml氢氧化钠，继续搅拌5分钟后再次测定PH。继续该过程至PH为7.0-7.2。
4.测定加至配制容器中的总体积(溶液1+溶液2+溶液3)，然后加无菌WFI将体积补足到100ml。
5.迅速将溶于100ml 1mM Tris(PH7.5)内的8，000μg纯化的gp160直接加到配制容器中。
6.至少继续搅拌20分钟，然后将配好的疫苗分装至无菌小瓶中。
实施例10明矾吸附的gp160的免疫原性(特异性Ab反应)所采用的测定抗原制剂(疫苗)免疫原性的方法是测定一组已给予单剂量抗原的小鼠的特异性抗体反应。于4周末给小鼠放血，并通过常规抗体试验(如ELISA，酶联免疫吸附试验)测定血清中抗特定抗原(通常是用于免疫动物的抗原)的抗体水平。
表4总结了没有在PH6.0和PH7.5条件下吸附了明矾佐剂(实施例9)的或与弗氏完全佐剂混合的纯化的gp160在小鼠体内的免疫原性。
2小鼠在免疫后28天放血，并用ELISA检测法检测血清(1∶10稀释)中的抗凝胶纯化之gp160的抗体滴度。利用商品ELISA药盒(Genetic Systems Inc.;EIAtmELISA)检测血清(1∶400稀释)中抗天然HIV-1蛋白的抗体也得到相似结果。
3血清转化小鼠数(P)比被检小鼠总数(N)。
用1.0μg不加任何佐剂的gp160抗原一次免疫的小鼠将诱发出针对gp160的抗体反应(见上表)。但是，在用1.0μg吸附于明矾佐剂上的gp160免疫的小鼠组中观察到更强的抗体反应。与完全弗氏佐剂混合或与明矾佐剂配制的小于0.1μg的单剂量gp160将使被免疫小鼠产生50%以上的血清转化。尽管低于这一极值时gp160作为PH7.5和PH6.0时未配制的抗原在小鼠中仍有免疫原性，但在更低的PH值时免疫原性将有所丢失。
实施例11明矾吸附的gp160的免疫原性(ELISA血清研究)候选疫苗诱发免疫反应的能力是一个非常重要的生物学特性。为了证实用明矾佐剂配制的gp160疫苗在动物中的免疫原性并证实明矾佐剂能增强该免疫原性，进行如下实验。
于0天，分别用单剂量(0.5μg，1.0μg或5.0μg)gp160、吸附于明矾佐剂上或完全弗氏佐剂(CFA)上的gp160免疫小鼠(10组)。第28天给小鼠放血，并用ELISA法检测血清(1∶10稀释)中抗gp160抗体的存在。
从第28天抽取血清所获得的结果总结于下表(表5)中。在所有各组中，均有50%以上的小鼠显示血清转化。在所有剂量下，在用吸附于明矾佐剂的gp160免疫的小鼠所获得血清转化数和平均血清吸收值(在ELISA中以1∶10稀释的OD450nm值)均高于在仅用gp160免疫的小鼠中所获得的数值。
该结果证明明矾佐剂明显地增强了gp160抗原的免疫原性。
4在用0.5μg、1μg或5μg VaxsyntmHIV-1免疫后第28天发生血清转化的小鼠数(P)与试验小鼠总数(N)之比。
5用针对gp160的Sponsor′s ELISA检测法检测1∶10稀释度血清以确定发生血清转化之小鼠血清的平均吸收值(OD450)。
实施例12中和数据HIV-1中和试验是用于测定抗体制剂是否将抑制HIV-1病毒感染培养的易感人淋巴细胞的方法。在HIV-1中和试验中，对用gp160免疫的动物的抗血清进行了检测，其结果总结于下面的表6中。
6在第一/第二/第三次免疫时所投予的gp120或gp160的微克数。
7相对于接触未免疫动物血清的HIV-1感染细胞产生50%抑制的最高抗血清稀释度。
实施例13在黑猩猩之中的免疫原性从遗传角度来看、黑猩猩与人最接近，且目前它是HIV-1感染的唯一动物模型。在三只黑猩猩之中进行的安全性/免疫原性试验中，用明矾佐配制的疫苗中的40μg或80μg gp160免疫两只黑猩猩、于第4周分别用40μg或80μg gp160对两只黑猩猩进行加强免疫。同时用1ml盐水溶液接种对照动物。每周采集血清样品，用MccroGeneSys公司开发的针对纯gp160的ELISA检测法、Western印迹分析法及使用商品ELISA检测药盒的三种免疫检测法对三只黑猩猩的抗gp160抗体和抗HIV-1病毒抗原抗体进行分析。分析结果如下所述。
A.ELISA(MGSearch HIV 160)ELISA检测法(MGSearch HIV 160，MGSearch是MceroGenesys 公司(Meriden，Conneeticut U.S.A)产品的商标)是针对于gp160的免疫吸附检测法，并已在在共同未决共同转让的美国专利申请系列号920，197(现在的系统号为585，266)中作了描述。
将免疫前及初次免疫后第11周所采集的血清样品在1∶10-1∶100，000的范围内稀释，然后与每点上含有100μg纯化之gp160的硝酸纤维素条一起保温。终点稀释滴度为最高稀释度，其中当用单抗人IgG一碱性磷酸酶连接物进行检测时该试验对抗gp160抗体为阳性。
得自对照动物及免疫动物的免疫前血清的血清样品为阴性。接受80μg剂量的黑猩猩到第2周时在1∶100稀释度为阳性，接受40μg剂量的黑猩猩到第4周时才在1∶10稀释度处呈现阳性。抗gp160的抗体滴度一套增加至第5周，至此终点稀释滴度分别约为1∶100，000和1∶2，000，000。在6-11周两只动物的抗体滴度均稍微下降。
这一类型的免疫反应无论是在定性上还是定量上均已在已用人乙型肝类病毒疫苗接种的黑猩猩之中所观察到的抗体反应相似。
B.商业性ELISA试验从对VaxSyn(MicrogeneSys公司的艾滋病疫苗的商标)免疫的黑猩猩进行的MGSearch HIV 160 ELISA和Western印迹分析中可清楚看出，它们已产生血清转化并具有天抗亚组gp160的抗体。为了测定它们是否也产生识别天然病毒包膜蛋白的抗-HIV抗体，在被许可的市售ELISA试验药盒即Genetic System Corporation(Seattle，Washington)公司的LAV EIAtm试验药盒中对免疫前血清及1-11周后的血清进行试验。用80μg gp160免疫的动物至第2周在1∶100稀释度处开始出现阳性，且其抗体水平直到第6周一直表现为增加。用40μg gp160免疫的动物直到第6周才在1∶100稀释度处呈现阳性。
实施例14抗体在gp120和gp41之间的分配测定接种动物中产生的抗gp160抗体反应是否也抗gp41gp120或这两者是很重要的。采用包括放射性免疫沉淀法(RIP)、荧光免疫法(IF)、Western印迹分析法(WB及定量ELISA法在内的各种免疫学方法对三种不同的重组包膜抗原进行分析以检测和测定抗体在HIV-1包膜蛋白的各个部分间的分配。
图6总结了以下三种不同重组抗原的免疫反应性〔ART〕〔TAB〕〔1〕gp120-δ〔其为分子的C-末端缺失了约40个氨基酸的截短的重组HIV-1 gp120〕;〔ART〔TAB〕(2)gp120(全长重组HIV-1gp120)及〔ART〕〔TAB〕(3)gp160。
自50个HIV-1抗体阳性个体获得的人血清及3份混合的人血清与gp160有免疫反应性，与gp120有中等反应性，与截短的gp120没有反应或仅有很弱的反应性。这很可能是因为代表了90%以上HIV-1外部糖蛋白之截短gp120含有保护性决定簇。艾滋病阳性人血清中仅有很少的抗该部分包膜的抗体，这一观察结果与免疫反应对病毒感染不具有完全保护及阳性人血清在体外通常显示出低水平中和活性这一确实相一致。
与此相反，用gp160免疫原或截短的gp120免疫的恒河猴具有与HIV-1包膜截短的gp120部分强烈反应的抗体这种病毒包膜中抗体识别位点分布上的差异可能是由于猴血清具有较高的中和滴度。
用人和免疫恒河猴血清对这三种重组包膜抗原的免疫反应性所作的定量评值示于图7中。包括来自用gp160免疫的动物的血清在内的所有被试猴血清均具很高的抗截短之gp120抗原(gp120-δ)的抗体滴度。
这些结果证明重组gp160在恒河猴中诱发了不同于在天然感染过程中常常发生的免疫反应。在gp-160的gp120-δ区域中具有能在已免疫猴中被有效识别的抗原决定簇，它在感染过程中未被人体免疫系统发现。这类新的抗原决定基对抗HIV-1保护作用可能很重要，且可能是用于预防和治疗HIV感染的重组gp160的重要性质。
实施例15治疗疫苗的使用用30个HIV血清阳性患者进行临床试验以确定用克隆的HIVgp160(在如上所述的杆状病毒系统中产生)接种后对HIV感染个体的影响。
用重组gp160接种后导致30个HIV血清阳性志愿者中有19人(63%)的gp160HIV一特异性体液和细胞免疫反应增强。15个接受6剂量疫苗的志愿者中有14人(93%)显示出其总gp160抗体的增加。因此，可按有利方式使用重组HIV蛋白(即rgp41，rgp120，rgp160及其混合物)治疗被HIV感染的患者。
可按照在领域熟知的技术确定出用于本发明该实施方案中的HIV蛋白的有效量。一般来说，该有效量的范围为每千克患者体重约1-100μg。也可按已知的方法确定服用次数。在一优选实施方案中，是通过本领域普通技术人员所熟知的静脉内、腹膜内肌肉内、真皮内等胃肠道外途径给药。
A。志愿人员的筛选吸收30个被HIV被HIV感染的志愿人员，只有患有早期HIV感染一称作Waltar Keed一期或二期(CD4细胞计数在3个月以上期间内不少于400个，有或无淋巴结病)一的血清阳性志愿人员才有资格入选(Kedfield，etal，New Engl J.Med.314;131-132(1986))。其它入选条件包括志愿人员限定为18-50岁的成年人，其有正常的全血细胞计数，无终末器官疾病症状，在前12个月的时间内未滥用酒精或毒品，并且未接受过抗逆病毒药或免疫调节药物。在被随机分成若干治疗组之前，对所有患者均进行了2个月的基线评估。在试验过程中所有志愿人员均未接受任何的抗逆病毒药物或免疫调节药物。
30个志愿人员中有26个为男性，4个为女性。14个白种人，13个黑人，3个西班牙人。其平均年龄为29(18-49)。在入选时8个志愿人员为Walter Keed一期，22个为Walter Keed二期。基线平均CD4计数为668个(范围为388-1639)。最初确诊到进入研究之间的平均时间为24个月(从3个月至49个月)。
B.疫苗产物及免疫方案如本文所述，试验疫苗包括得自杆状病毒表达之重组蛋白质的gp160的非感染性亚单位糖蛋白。该免疫原蛋白是在鳞翅目昆虫细胞中产生的，经过生物化学纯化并被吸附至磷酸铝上以作为最终疫苗制剂。
使用了以下三种剂量的gp160制剂;40μg/ml，160μg/ml和320μg/ml。40μg及160μg剂量的注射体积为1ml;使用2ml注射液(320μg/ml)输送640μg剂量的疫苗。
30个志愿人员被分成6组，每组5人。对两种免疫方案进行了研究方案A，在第0、30和120天接种;方案B，在第030、60、120、150和180天接种。在每种免疫方案(A或B)中均有三组志愿人员接受了不同剂量的疫苗(表7)。所有接种物均通过肌内途径注射到三角肌内。试验期为10个月2个月的基线评估及开始接种后8个月的随访评估。
表7-免疫方案gp160的给药量(μg)天 0 30 60 120 150 180方案A第1组 40 40 40第3组 160 160 160第5组 640 640 640方案B第2组 40 40 40 160 160 160第4组 160 160 160 640 640 640第6组 640 640 640 640 640 640
C.安全性和毒性的评定在每次注射后的第0、1、2、3、15和30天对每一位志愿人员进行问诊和检查，了解其有无发热、寒冷、恶心、呕吐、关节痛、肌痛、不适、荨麻疹、气喘、头晕或头痛等症状为评定在注射部位发生的局部反应所进行的检查包括观察红斑、肿胀、痒、疼痛和触痛、皮肤变色、皮肤损伤、局部淋巴结病的变化、注射肢体的功能变化以及注射部位皮下小结的形成。对每月的全血计数、血清化学、凝血曲线及尿液分析的结果也进行了评定。
按照Richman等人Clinical Lmmuno S285-95，1989Birx等人J.Acguir.lmmue Defic、Syndr、4188-196，1991所述的方法，通过T-细胞表型检测还评价了总淋巴细胞，CD4和CD8细胞表型未评定体外细胞免疫功能。还评价了T-细胞对有丝分裂素美洲商陆及ConA和对照抗原Candidealbicans和tetanus的增殖性反应Birx等，同上通过对照抗原即流行性腮腺炎、破伤风类类毒素、Candida albicans和毛癣菌的迟发性超敏性皮肤试验评估体内细胞免疫功能。
按照Burke等人J.Acguir.lmmnuke Defic·Syndr·31159-1167，1991所述的方法对外周血单核细胞PBMC及血浆的定量病毒培养物进行评估。评估DNA聚合酶链反应Wages，etal，J.Med.Virol.3358-63，1991)和血清p24抗原水平以监测体内HIV病毒容量。
未观察到全身性毒性，但在87%的对象(每组中13个)中发现有局部反应原性。局部反应包括注射部位硬化、触痛及形成短暂的皮下小结。很少发现局部腺病的增加。没有人拒绝接受加强注射。在初次免疫、加强注射或定量给药时所观察到的局部反应次数没有差异。通过体外有丝分裂素和抗原特异性增殖应答、或体内迟发性皮肤超敏试验或通过定量CD4细胞清除的加速证实其对免疫系统没有副作用。对于疫苗反应者和非反应者，基线平均CD4细胞计数分别为716和605。对于疫苗反应者和非反应者，在研究开始的第180-240天的平均CD4细胞计数分别为714和561。在历时240天的试验过程中，疫苗反应者中平均CD4细胞计数的净改变为-0.2%，而在疫苗非反应者中平均CD4细胞计数下降了7.3%(图11)。在整个试验过程中的任何个体中，疫苗诱导的HIV免疫原性与CD4的加速下降没有关联。
为了评估作为接种结果的HIV繁殖及病毒在个体中的负荷增加的可能性，通过定量血浆和PBMC病毒培养物、PBMC DNA聚合酶链反应和P24抗原的血清水平来测定体内病毒活性。定量培养物和DNA聚合酶链反应检测法证明在该试验过程中没有改变。在个体中未检测到血清P24抗原。
D.免疫原性评估利用重组产生的病毒基因产物gp160、p66、p24和原型HIV病毒株MN的全病毒溶解产物来测定抗整个HIV蛋白的抗体。使用Toubin等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 764350-4354(1979))所述的点印迹和Western印迹技术。同时检测对特定包膜抗原决定簇的抗体反应(见图7)。
图7中所选择的是抗原决定簇88(gp120中的第88-98位氨基酸)和448c(gp120中的第448-514位氨基酸)，因为据报道抗gp120的这些区域的抗体与早期HIV感染相关。
之所以选择抗原决定簇106(gp120中的第106-121位氨基酸)、241(氨基酸241-272)、254(氨基酸254-272)、300(氨基酸300-340)、308(氨基酸308-322)、422(氨基酸422-454)和735(氨基酸735-752)是因为它们具有推测的功能重要性。抗原决定簇106和422影响CD4结合;抗原决定簇241、254和735影响到组群特异性中和作用;抗原决定簇300和308影响到类型特异性中和作用。
之所以选择抗原决定簇582(氨基酸582-602)作为对照是因为它代表了天然HIV感染中的免疫优势包膜区域。其它被研究的抗原决定簇包括49(氨基酸49-128)和342(氨基酸342-405)。
图7中，阴影框代表了有文献记载的HIV包膜针对性免疫反应的变化。带有(＝)的阴影框表示初级体液反应;带有(+)的阴影框表示次级体液反应;(-)表示对特定的抗原决定簇免疫前和免疫后的抗体阴性;(+)表示对特定的抗原决定簇免疫前和免疫后抗体阳性，但无定量变化。带有(·)的阴影框表示对gp160后续免疫的新的T-细胞增殖反应。单独的(·)表示对gp160无细胞反应;hb表示“高本底”(不可解释);nd代表“未做”。
用Nara(Nature，333469-470(1988))所述的合胞体抑制检测法检测了对三个原型分离物(HIV-ⅢBRF和MN)的中和活性。按照已知的淋巴细胞增殖检测技术，用gp160，p24和杆状病毒表达系统对照蛋白(Birx，同上)检测HIV特异性细胞免疫反应。
E.疫苗反应者和非反应者对于被试人员只要针对HIV包膜特异性抗原决定簇的细胞和体液免疫反应出现与接种系列有关的可重复的选择性增加(图7)就将其归类为疫苗反应者中。疫苗诱导的体液免疫性被定义为针对HIV包膜特异性抗原决定簇的血清转化和/或针对包膜特异性抗原决定簇的二次加强免疫反应。疫苗诱导的细胞免疫性被定义为针对gp160形成新的、可重复的、疫苗相关性的细胞增殖反应(这一疫苗反应者的定义相对这一试验的科学目的，如评估感染后免疫的适用性而言是非常严格的)。对gp160抗原决定簇或HIV包膜既不产生体液反应也不产生细胞增殖反应的个体或仅产生体液反应或细胞增殖反应的个体定为非反应者。
F.疫苗诱导的体液反应参见图7，30个被检者中有19个(63%)显示出疫苗诱导的gp160 HIV特异性体液和细胞免疫反应的增强。这19个病人被定为“疫苗反应者”。11个“非反应者”中有4个人仅出现体液或细胞免疫反应。所有7个未显示任何可检测之疫苗诱导的反应的病人仅接受了3个剂量的疫苗(方案A)。未测得抗体与HIV聚合酶(p66)、结构性(p24)基因产物或非HIV对照抗原(破伤风)之结合能力的变化。在任何个体中均未形成抗杆状病毒鳞翘目昆虫细胞对照蛋白的抗体。
利用全病毒裂解产物HIV-MN，通过Western印迹法测得13个个体中出现包膜抗体(gp160)增加。方案A的15个病人中的3个(20%)和方案B的15个病人中的10个(67%)的抗包膜蛋白抗体增加(通过Fisher氏准确度试验测得p＝0.025，两端拖尾)。所有13个个体也产生了针对特定包膜抗原决定簇的血清转化。
与此相反，在未对任何包膜特异性抗原决定簇发生血清转化的10个个体中，通过Western印迹分析未发现任何个体的包膜抗体增加。通过Western印迹未发现在剩余的7个个体中出现整个病毒包膜抗体的变化。未在任何个体中观察到抗非包膜HIV蛋白抗体的变化。
方案B(6剂量)的15个个体中有14个(93%)显示了总gp160抗体的增加，而在方案A(3剂量)的15个个体中只有7个显示出抗体增加(P＝0.01)(图7)。
如图8所示，每一gp160特异性抗原决定簇从免疫前至接种后的优势分别为抗原决定簇49(27-70%)，抗原决定簇88(28-52%)、抗原决定簇106(50-87%)，抗原决定簇214(0-14%)，抗原决定簇254(0-13%)，抗原决定簇300(47-77%)，抗原决定簇308(42-69%)，抗原决定簇342(0-27%)，抗原决定簇422(3-10%)，抗原决定簇448C(73-87%)和抗原决定簇735(17-33%)。观察到抗除582以外的所有特异性抗原决定簇的疫苗诱导的血清转化(图7)。抗抗原决定基241、254或342的抗体(血清转化)仅在后续免疫时检测得。
检测对以下抗原决定簇的次级免疫反应88，106，300448C和582。对抗原决定簇582的抗体优势100%是在免疫前出现的，且仅在一个病人(3%)中证明有次级免疫反应。
疫苗诱导的抗包膜抗原决定簇HIV抗体的反应曲线是可变的(图7)。在20个个体中产生了针对至少一个抗原决定簇的初级抗体反应;分别为15人的组中有14人接受方案B，6人接受方案A(P＝0.005，Fisher's，两尾)。采用方案A的病人仅对110个潜在的对其无预免疫抗体的抗原决定簇中的15个(14%)产生血清转化。采用方案B的病人对129个抗原决定簇中的60个(47%)产生血清转化。(P＜0.0001，Fisher's，双尾)。在随机化采用方案B的9个病人(60%)对三个或多个包膜抗原决定簇发生血清转化，但方案A组仅2个病人(13%)产生对三个或多个包膜抗原决定簇的血清转化(P＝0.02 Fisher's，双尾)。
于第0、90和195天在检测7个个体对于三个不同病毒株(HIV-ⅢB，MN和RH)的血清中和活性。5个疫苗反应者中有4个显示有对一个或多个分离物之中和活性的增强。与非反应者相比，疫苗反应者抑制合胞体形成的能力也有所提高。
G。疫苗诱导的细胞反应细胞免疫反应的变化是基于利用Wilcoxon行列求和试验(rank sum test)来比较接种前(基线)和接种后平均淋巴细胞刺激指数(LSI)确定的。
免疫后30个个体中有21人(70%)产生了针对gp160的新的T细胞增殖反应(图7)。
图9说明了四个典型疫苗反应者中于不同时间出现的针对gp160、p24和杆状病毒对照蛋白的细胞增殖反应。对于所有个体，gp160诱导的增殖从基线平均LSI为3增加至10(利用末次免疫后4个数值的均数算出)。相反，针对于HIV p24蛋白或对照杆状病毒蛋白的增殖反应则未发生变化。
图10说明了所有个体、根据疫苗反应性分组的个体以及根据免疫方案分组的个体中所出现的疫苗诱导的平均LSI值的变化。
疫苗反应者和非反应者在对gp160的增殖反应的变化方面明显不同(＜0.0001，Wilcoxon'一侧拖尾)。由方案B(6剂量)诱导的gp160增殖反应高于由方案A(3剂量)诱导的gp160增殖反应(P＜0.10，Wilcoxon'一侧拖尾。
对gp160产生增殖反应的21个病人中，有19人也发展了体液反应(疫苗反应者)。对于所有疫苗反应者，所观察到的对gp160的最大平均淋巴细胞刺激指数(LSI)均为50.1但是，每一疫苗反应者的反应都是可变的(峰值范围从LSI为3至171)(图7)，正如对gp160的细胞反应与接种量和反应期间的暂时相互关系那样(图9)。
H.结果讨论尽管该试验的样本数有限，但已证实有几个因素与疫苗免疫原性有关，对于方案A，15个病人中有6个(40%)为疫苗反应者，而在方案B的15个病人中有13个(87%)为疫苗反应者)(P＝0.02，Fisher's，双拖尾)(图7)。在平均基线CD4计数大于每毫升600的16个病人中有13个(81%)为疫苗反应者，而在平均进入CD4计数小于每毫升600个细胞的14个病人仅有6个(43%)为疫苗反应者。如表8中所总结的那样，多次免疫能改进免疫原性，甚至对于其基线CD4计数小于每毫升600个细胞的病人也是如此。例如，与接受3次注射(方案A)的8个病人中仅有1个为疫苗反应者相比，方案B(6次注射)的6个病人中有5个为疫苗反应者(P＝0.03，Fisher's，双拖尾)(表8)表8根据基线CD4数和免疫方案确定的GP160疫苗免疫反应性CD4计数 N 反应者数(%) 非反应者数(%)方案A>600 7 5(71%) 2(29%)500-600 5 1(20%) 4(80%)<500 3 0(%) 3(100%)小计 15 6(40%) 9(60%)方案B>600 9 8(89%) 1(11%)500-600 2 2(100%) 0(0%)<500 4 3(75%) 1(25%)小计 15 13(87%) 2(13%)总计 30 19(63%) 11(37%)·在十九世纪巴斯德就已将疫苗应用于治疗急性狂犬病感染。但没有深入探讨过这种治疗手段在对付其他感染中的实用性。尽管有一些改进感染后病毒特异性免疫的实例(如接触甲型或乙型肝炎病毒后)，但没有充分证据证明该方法在人体内对已形成或慢性病毒感染的可行性。
因此，本发明提供了通过感染后的主动免疫改善病毒特异性免疫的方法。具体地说，对于早期HIV感染的30个病人中的19个来说，衍生于HIV包膜基因的gp160疫苗增强了人体宿主针对性病毒特异性体液和细胞免疫反应。
该研究定性并定量地测定了在与感染后免疫相对的天然感染免疫中针对于特定HIV抗原决定簇的不同抗体反应。在这方面，已在70%个体中精确测定了疫苗在已感染的个体中诱导了体液免疫原性。例如，20个个体(19个疫苗反应者和1个疫苗无反应者)已对特定的包膜抗原决定簇发生血清转化。血清转化仅与对10个病人进行的疫苗接种(抗原决定簇241，254和342有关。
因此，对通过抗原决定簇作图所鉴定的针对该疫苗的体液反应的改变，将使得对特定抗体反应的预期起因和效果进行分析成为可能，并且提供了鉴定天然感染过程中所未诱发的潜在免疫调节机制独特的机会。
尽管目前还不知道血清中和活性的体内相关性，但观察到在5个疫苗反应者中有4个提高了抗不同HIV病毒株(MB、RF、MN)的中和活性，提示感染后免疫诱导了功能性抗体的变化。试验疫苗诱导了对特定HIV株血清中和能力的提高。并且可能将有助于限定组群特异性中和抗原决定簇。
对HIV包膜蛋白的增殖反应很少发生在天然HIV感染中。但是在用gp160免疫后，在21个病人(70%)中证实了特异性T-细胞增殖反应。这一差异的原因还不清楚。一种可能是引起了一种针对疫苗特有的包膜抗原决定簇的新的增殖反应(作为疫苗生产方法或体内抗原加工的结果)。或者，用于增殖检测的蛋白质可能未刺激针对天然病毒的同源“野生型”包膜的初级T-细胞增殖反应。但是，已得到了疫苗接种可提高宿主细胞免疫反应的其它证据已在所选择的疫苗反应者中证实HIV-ⅢB型特定性胞毒性T-细胞反应产生于加强免疫之后。
负责HIV感染病人之疫苗免疫反应性的因素还有待澄清。即使在早期HIV感染的情况下，与相应的对照相比，个体对各种疫苗都可产生较理想的免疫反应。这一超反应性与早期B细胞调节障碍和T-细胞机能障碍有关。因此，疫苗免疫应答性与基线CD4细胞计数相关，而这正与宿主的免疫状态是疫苗反应性的重要决定因素这一假设相一致。但在特异性T-细胞计数间隔内的免疫方案也影响到疫苗反应性方案B(6次注射)更为优越。事实上，通过增加接种次数也可以使在低CD4细胞计数之病人中观察到的疫苗反应的降低得到改善，此提示可通过改变剂量、给药方式、佐剂或配方来进一步改善宿主免疫反应性。
尽管用HIV特异性疫苗产物对HIV感染的患者进行主动免疫的安全性已引起关注，但目前没有产生免疫特异性毒性的证据。定量培养物、DNA聚合酶链反应检测以及血清抗原检测显示出体内HIV负荷的增加。病人中，尤其是分类为疫苗反应者的病人中，HIV复制的一个极好的体内标记-CD4细胞下降率-受到有利地影响。反应者的平均CD4计数变化为-0.2%，无反应者则为-7.3%。该数据说明感染后免疫反应性与CD4破坏的增加无关，并提示与下降的HIV体内受制相关。
在该项研究中，也将免疫接种结果与10个感染且未治疗病人的年令、种族和基线CD4细胞计数等基本参数进行了比较。在该参考组中平均CD4计数下降了8.7%，接受方案A病人这一计数下降了7.2%，接受方案B的病人则增加了0.6%。这些结果说明用重组HIV包膜蛋白进行感染后免疫接种是可行的，而且就该疫苗的预防应用来说该结果也是令人鼓舞的。
权利要求
1.对受人免疫缺陷病毒(HIV)感染的个体进行治疗的方法，它包括给被感染个体使用重组HIV包膜蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其中重组蛋白是以约1-100μg/千克体重的剂量使用。
3.根据权利要求1所述的方法，其中重组蛋白是以约10μg-4000μg的剂量使用。
4.根据权利要求1所述的方法，其中重组蛋白是以约40μg-1280μg的剂量使用。
5.根据权利要求3所述的方法，其中至少使用3个剂量。
6.根据权利要求4所述的方法，其中至少使用6个剂量。
7.根据权利要求5所述的方法，其中每一剂量以约30-60天的间隔使用。
8.根据权利要求6所述的方法，其中每一剂量以约30-60天的间隔使用。
9.治疗受人免疫缺陷病毒(HIV)感染的个体的方法，它包括以足以提高HIV特异性细胞或体液免疫反应的量给被感染的个体使用重组HIV包膜蛋白。
10.根据权利要求1所述的方法，其中重组蛋白是由杆状病毒-昆虫细胞表达系统产生的。
11.根据权利要求3所述的方法，其中重组蛋白是由杆状病毒昆虫细胞表达系统产生的。
12.根据权利要求5所述的方法，其中重组蛋白是由杆状病毒昆虫细胞表达系统产生的。
13.根据权利要求1所述的方法，其中重组蛋白的分子量约为145，000。
14.根据权利要求3所述的方法，其中重组蛋白的分子量约为145，000。
15.根据权利要求5所述的方法，其中重组蛋白的分子量约为145，000。
16.根据权利要求1所述的方法，其中HIV包膜为gp160、gp120及gp41中的至少一种。
17.根据权利要求3所述的方法，其中HIV包膜为gp160、gp120及gp41中的至少一种。
18.根据权利要求5所述的方法，其中HIV包膜为gp160、gp120及gp41中的至少一种。
19.根据权利要求1所述的方法，其中重组蛋白是由杆状病毒昆虫细胞载体Ac3046表达的。
20.根据权利要求3所述的方法，其中重组蛋白是由杆状病毒昆虫细胞载体Ac3046表达的。
21.根据权利要求5所述的方法，其中重组蛋白是由杆状病毒昆虫细胞载体Ac3046表达的。
22.根据权利要求1所述的方法，其中重组蛋白聚集成分子量至少约为2，000，000的颗粒。
23.根据权利要求3所述的方法，其中重组蛋白聚集成分子量至少约为2，000，000的颗粒。
24.根据权利要求5所述的方法，其中重组蛋白聚集成分子量至少约为2，000，000的颗粒。
25.根据权利要求1所述的方法，其中重组蛋白与佐剂相结合。
26.根据权利要求3所述的方法，其中重组蛋白与佐剂相结合。
27.根据权利要求5所述的方法，其中重组蛋白与佐剂相结合。
28.治疗受人免疫缺陷病毒(HIV)感染的个体的方法，它包括给被感染个体使用由重组HIV包膜蛋白和明矾佐剂组成的组合物，其中重组蛋白已形成分子量至少约为2，000，000的颗粒。
29.根据权利要求28所述的方法，其中重组蛋白是由杆状病毒昆虫细胞表达系统产生的。
30.根据权利要求28所述的方法，其中重组蛋白选自于重组gp160、重组gp120、重组gp41、分子量约145，000的重组HIV包膜蛋白及由Ac3046载体表达的重组蛋白。
31.根据权利要求28所述的方法，其中重组蛋白包括gp160的757个连续氨基酸且基本上不包括gp160的40个连续末端的氨基酸。
32.根据权利要求28所述的方法，其中重组蛋白以约10μg-4000μg的剂量使用。
33.治疗性HIV疫苗组合物，它包括重组HIV包膜蛋白及明矾佐剂，其中重组蛋白已形成分子量至少约为2，000，000的颗粒。
34.根据权利要求33所述的组合物，其中重组HIV包膜蛋白是以每剂大约10μg-4000μg的量提供的。
35.根据权利要求34所述的方法，其中重组蛋白是由杆状病毒昆虫细胞表达系统产生的。
36.根据权利要求34所述的方法，其中重组蛋白包括gp160的约757连续的氨基酸且基本上不包括gp160 40个末端的氨基酸。
全文摘要
已在杆状病毒昆虫细胞载体系统中由克隆的HIV—1包膜基因产生出含有人缺陷免疫病毒、1型(HIV—1)包膜蛋白的获得性免疫缺陷综合症(艾滋病)疫苗。重组HIV—1蛋白被纯化装配成颗粒并被吸附至磷酸铝佐剂上。该艾滋病疫苗在HIV感染的个体中诱导出新的体液和细胞免疫反应，并可作为疫苗疗法剂用于推迟或预防病毒对免疫系统的破坏。
文档编号C12R1/91GK1068266SQ9210451
公开日1993年1月27日 申请日期1992年6月11日 优先权日1991年6月11日
发明者G·E·史密斯, F·沃尔沃维茨 申请人:微型基因体系公司