专利名称：葡激酶基因及其高表达工程菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及DNA基因工程，具体地讲是一种葡激酶(Sak)基因及其高表达工程菌株，该表达产物具有纤溶酶原激活剂作用，对人体纤维蛋白具有很高的的水解活性。
有关资料报道了金葡菌产生一种非酶蛋白，能激活纤溶酶原转化为纤溶酶。这种非酶蛋白即为葡激酶(Sak)。该酶的基因已被多家实验室克隆。有公开专利文献CN1109508A号说明书中，披露从S.aureus噬菌体DNA获得了葡激酶基因并克隆化。有文献Collen，Det al.(1992)Fibrinolysis，6226-231文中披露从S.aureus菌染色体DNA克隆了葡激酶基因。这两种基因片段都是采用酶切大片段DNA进行克隆的。其基因片段较大，组装到载体质粒的拷贝数较低，难以得到较高的表达效果。这种S.aureus菌染色体DNA的表达水平一般在10-15％，如《生物工程》1994.2第12卷“治疗血栓用药重组葡激酶的高产率生产和纯化”一文中披露“用发酵罐培养转染大肠杆菌TG1细胞，细胞内产生葡激酶，占细胞总蛋白的10-15％。”这是目前公开资料报导中，葡激酶表达的公认水平。
本发明的目的是要提高葡激酶(Sak)基因的表达水平，得到高表达葡激酶(Sak)产物作为纤溶酶原激活剂，用于血栓治疗中。筛选出新的Sak基因，构建出高表达质粒的工程菌株。
本发明的目的是有以下技术方案实现的，具体筛选，克隆，鉴定，构建过程如下首先筛选出一种葡激酶基因，该基因是由金葡菌SL1.063菌株的染色体DNA，经PCR扩增获得的，该基因的全序列的密码子及其编码氨基酸如下序列TCA AGTTCA TTC GACAAAGGAAAATATAAASer SerSer Phe AspLysGlyLysTyrLys10AAA GGCGAT GAC GCGAGTTATTTTGAACCALys GlyAsp Asp AlaSerTyrPheGluPro20ACA GGCCCG TAT TTGATGGTAAATGTGACTThr GlyPro Tyr LeuMetValAsnValThr30GGA GTTGAT GGT AAGGGAAATGAATTGCTAGly ValAspGly34LysGlyAsnGluLeuLeu40TCC CCTCGT TAT GTCGAGTTTCCTATTAAASer ProArg43Tyr ValGluPheProIleLys50CCT GGGACT ACA CTTACAAAAGAAAAAATTPro GlyThr Thr LeuThrLysGluLysIle60GAA TACTAT GTC GAATGGGCATTAGATGCGGlu TyrTyr Val GluTrpAlaLeuAspAla70ACA GCATAT AAA GAGTTTAGAGTAGTTGAAThr AlaTyr Lys GluPheArgValValGlu80TTA GATCCA AGC GCAAAGATCGAAGTCACTLeu AspPro Ser AlaLysIleGluValThr90TAT TATGAT AAG AATAAGAAAAAAGAAGAATyr TyrAsp Lys AsnLysLysLysGluGlu100ACG AAGTCT TTC CCTATAACAGAAAAAGGTThr LysSer Phe ProIleThrGluLysGly110TTT GTTGTC CCA GATTTATCAGAGCATATTPhe ValVal Pro AspLeuSerGluHisIe120AAA AACCCT GGA TTCAACTTAATTACAAAGLys AsnPro Gly PheAsnLeuIleThrLys130GTT GTTATT GAA AAGAAAVal ValIle Glu LysLys136
本葡激酶基因的高表达工程菌株，由产葡激酶活性高的菌株(SL1.063)的染色体模板DNA，采用引物P-Nml和引物P-C经PCR扩增，得到完整的葡激酶基因DNA小片段；该基因DNA片段与pUC 19载体质粒，分别以EcoRI和BamH1酶切；再将酶切的上述质粒和葡激酶基因DNA小片段，用T4DNA连接酶连接获得pUK408质粒DNA，再转化入DH5α或JM109大肠杆菌细胞内，构建成葡激酶高表达的工程菌株DH5α(pUK408)或JM109(pUK408)。
本葡激酶基因的高表达工程菌株，所述的引物P-Nm1，其核苷酸序列5′-CGCGAATTCATGTCAAGTTCATTCGACAAAGG-3′，键长32；所述的引物P-C，其核苷酸序列5′-CGCGGATCCTATTTCTTTTCTATAACAACCTTTG-3′，键长34。
本葡激酶基因的高表达工程菌株，所述的pUK408重组质粒DNA还可与另一种pUV606载体质粒，分别经EcoRI和BamH1酶切pUK408重组质粒产生的小片段DNA，和酶切pUV606的大片段DNA，通过T4DNA连接酶连接成pUK408质粒DNA，转化入DH5α或TG1或TG2大肠杆菌细胞内，构建成含重组质粒pHK408的葡激酶高表达的工程菌株DH5α(pHK408)。
本发明的Sak基因及其高表达工程菌株，其优点在于本发明Sak基因由408个核苷酸组成，推导出相应的葡激酶136个氨基酸序列。本发明Sak基因第34和43位的氨基酸不仅与国外报道的噬菌体DNA中Sak基因不同，而且与Collen等发表的由金葡菌染色体DNA克隆的Sak基因也不完全相同。显然，本发明提供的是一个新的Sak基因。将得到的DNA片段，分别克隆到合适的载体质粒上，均获得了较高的表达，其相应的表达产物均具有纤溶酶原激活剂作用，与同类由金葡菌染色体DNA克隆的Sak基因的表达水平(10-15％)相比提高了近1.7倍，达到40％的高效表达。该表达产物重组葡激酶，与临床常用的链激酶和t-PA相比，它不仅安全性较好，而且具有溶栓快，效果好，用药量少等优点，其可用于治疗心肌梗塞、深度静脉血栓、肺栓塞、急性或亚急性外周动脉血栓和慢性动脉栓塞以及中央视网膜动脉或静脉栓塞等疾病。
本发明的实施例结合
，进一步详细描述，本发明保护范围不仅局限于实施例中。
图1为金葡菌SL1.063菌株在甘露醇高盐琼脂平皿上的菌落特征。
图2为金葡菌SL 1.063菌株在卵黄高盐琼脂平皿上菌落特征。
图3为金葡菌SL 1.063菌株在血琼脂平皿上溶血现象。
图4为金葡菌SL 1.063菌株耐热核酸酶试验。
图5-1为金葡菌SL 1.063菌株中的Sak，以人纤维蛋白标准平皿检测结果。
图5-2为金葡菌SL 1.063菌株中的Sak，以人纤维蛋白加热平皿检测结果。
图6为重组质粒pUK408高表达质粒的构建流程图。
图7为重组质粒PHK408高表达质粒的构建流程图。
图8为工程菌TG2(pHK408)高效表达产物的SDS-PAGE(12％)电泳分析图。
本发明使用的大肠杆菌菌株及其基因型如下大肠杆菌菌株基因型JM109endA1，recA1，gyrA96，thi，hsdR17(rk-，mk+)，relA1，supE44，D(lac-proAB)，[F′，traD36，proAB，lacφZDM 15]DH5α f80dlacZDM15，recA1，endA1，gyrA96，thi-1，hsdR17(rk-，mk+)，supE44，relA1，deoR，D(lacZYA-argF)U169TG1 F′traD36laclqD(lacZ)M 15proA+B+/supED(hsdM-mcrB)5(rk-mk-McrB-)thiD(lac-proAB)TG2 supEhsdD5thiD(lac-proAB)D(srl-recA)306Tn 10(tetr)F′[traD36 proAB+lacIqlacZDM15]
本发明实施例如下1、金葡菌(Staphylococcus aureus)的分离、鉴定和产葡激酶(Staphylokinase，Sak)菌株筛选为分离金葡菌，从医院外科、眼科和耳鼻喉等科采集了90多个样品，以稀释法或划线法，接种在蛋黄氯化钠琼脂培养基上，36℃培养24-48小时，挑取金黄色或柠檬色、周围培养基呈珍珠光泽白色沉淀的菌落，接入普通营养培养基中，36℃培养过夜，革兰氏染色、镜检，选择G+菌体呈球形并堆积成葡萄状、无芽孢菌株，在蛋黄培养基上作进一步纯化。纯化菌株分别接在高盐甘露醇琼脂培养基上，36℃培养24-48小时，菌落周围出现光亮的黄色圆环。经分离、纯化、鉴定，共得到167株金葡菌，其形态和培养特征如下革兰氏染色为阳性，菌体为球形、堆积成葡萄状、无芽孢，菌体大小通常为0.8-0.9μm。
培养特征在甘露醇高盐琼脂培养基上，36℃培养24-48小时，菌落为金黄色，圆形凸起，外围为微黄色环，如图1。
在卵黄高盐琼脂培养基上，36℃培养24-48小时，菌落为金黄色或柠檬色，其周围呈白色月晕状油膜，如图2，表明该菌株具有产卵磷脂酶的能力，此即金葡菌特征之一。
在血琼脂平皿上划线，36℃培养18-24小时，菌落周围呈现透明的溶血环，即β型溶血环，见图3。
为了测定是否产耐热核酸酶，将供试菌株在普通营养培养液中37℃培养18-24小时，菌液煮沸10分钟，点入甲苯胺兰DNA琼脂平皿的小孔中，37℃保温3-5小时，阳性者均产生粉红圆环，见图4。图4中1，4为生理盐水；2，6为SL1.02菌株发酵上清液；3，5，7，为SL1.063菌株发酵上清液。
血浆凝固酶试验取兔血浆生理盐水(1∶1)与等体积各菌株普通营养培养液混合。对照为等体积的生理盐水。37℃保温过夜，阳性对照与试验菌株血浆均凝固，对照管血浆流动自如。
本发明使用的培养基卵黄高盐琼脂培养基蛋白胨10g牛心浸液 10g甘露醇10g卵黄悬液 100gNaCl 70g琼脂 15gLiCl 5g 蒸馏水 890g甘露醇高盐琼脂培养基蛋白胨 10g甘露醇 10g牛肉膏 1gNaCl75g酚红0.025g琼脂15g蒸馏水 1000ml普通营养琼脂培养基蛋白胨10g牛肉膏3gNaCl 5g琼脂 15g蒸馏水1000ml以上培养基调pH7.2，121℃灭菌20分钟。甲苯胺兰(Toluidine blue)DNA琼脂平皿鱼精DNA 0.03gNaCl 1.00g琼脂 1.00g2％甲苯胺兰 0.3ml0.01M CaCl 0.1ml0.05M Tris-HCl(pH9.0)100ml121℃灭菌15分钟。
为了筛选产葡激酶的金葡菌，将167株，取其单菌落接在3mlLB液体培养基试管中，37℃振荡培养过夜，离心4000rpm 5分钟，上清液作为粗酶液，取10μl点在人血纤维蛋白平皿中，37℃保温16小时，现察是否有透明圆形成。经多次重复，证明金葡菌SL1.063菌株产Sak水平最高。为了确认这是葡激酶活性还是蛋白酶活性，按同样方法制做了两个相同的人血纤维蛋白平皿，一个加热85℃、40分钟。另一个按常规作为标准平皿，见图5-1，打孔后，分别点10μl发酵上清液，37℃保温16小时。结果是在标准平皿上，3，5号为SL1.063粗酶液；1，2号分别为尿激酶和t-PA；4号为蚓激酶，均产生透明圈。在加热平皿上，见图5-2所示，除4号蚓激酶产生透明圈外，3，5号SL 1.063粗酶液与尿激酶和t-PA一样，均无透明圈，结果表明SL 1.063的酶是通过激活纤溶酶原产生纤溶酶水解纤维蛋白，经85℃加热40分钟处理，使纤溶酶原全部失活，因而， SL 1.063产生的酶像尿激酶和t-PA一样在加热纤维平皿上不再产生透明圈。2、SL 1.063 Sak基因的克隆(1)金葡菌染色体DNA制备将菌株单菌落接种在25ml LB液体培养基中，37℃振荡培过夜，离心4000rpm、8分钟收集菌体，菌体悬浮在2.5mlGTE溶液(50mM Glucose-50mM Tris-HCl-10mM EDTA，pH8.0)中。加溶菌酶终浓度为10mg/ml，37℃保温60分钟，加300μl的10％SDS，RNase A(10mg/ml)和RNase T1(2000U/ml)各40μl，37℃保温60分钟，加等体积苯酚-氯仿-异戊醇(12∶12∶1)抽提三次，对界面上的白色膜以等体积的TE溶液(20mM Tris-HCl(pH8.0)-1mMEDTA)反抽提两次，水相合并后，加入1/10体积3M NaCl和2倍体积的95％乙醇，以玻棒搅出纤维状的DNA，以70％乙醇和无水乙醇冲洗各两次，赶掉乙醇。DNA溶在适量的TE溶液中，浓度约0.2μg/μl。经SDS-PAGE检查，没有RNA存在。(2)引物设计参考已知的Sak基因的结构，设计了若干个引物，并引入适当的限制酶切位点。
引物酶切位点核苷酸序列(5′→3′)键长P-Nm1EcoRICGCGAATTCATGTCAAGTTC 32ATTCGACAAAGGP-C BamH1CGCGGATCCTATTTCTTTTCT34ATAACAACCTTTG(3)聚合酶链反应(PCR)系统组成 反应液(μl)1.SL 1.063模版DNA(0.2μg/μl)3.02.引物P-Nml(33pmol/μl)3.03.引物P-C(33pmol/μl)3.04.10×PCR缓冲液 5.05.4×dNTP(2mM) 4.06.ddH2O 31.07.Taq DNA聚合酶(2.5U/μl)1.0
1-6混匀，变性处理95℃、7分钟，然后加Taq DNA聚合酶混匀，在Progene PCR循环仪中，进行扩增。
延伸反应10分钟。(4)DNA片段的分离、纯化、酶切、连接与转化①纯化经1.5％Agarose电泳检查，在360mn波长下，切下扩增DNA片段。采用Genelute Agarose Spin Columns方法纯化PCR扩增的DNA片段。DNA溶于20μlTE(PH8.0)溶液中。
②酶切酶切反应液(μl)DNA片段 2010×缓冲液 5EcoRI (20U/μl)2BamH1(12U/μl)3ddH2O 2037℃、2小时。
再以Genelute Agarose Spin Columns方法纯化，将DNA片段溶于20μl TE中。
③连接pUC 19质粒提取参照Sambrook等人的方法。按上述方法，以EcoRI和BamH1酶切pUC19质粒，经Genelute AgaroseSpin Columns方法纯化。与经EcoRI和BamH1酶切的Sak基因连接，16℃保温12小时。
④转化根据Sambrook等人的方法，感受态菌株为钙离子处理的DH5α或JM109，涂在平皿上培养过夜。以x_gal试验检测，挑出白色菌落，接入LB-AP液体培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒DNA，以EcoRI和BamH1酶切，经1.5％Agarose电泳检查，有431bp DNA片段区带，证明已经得获得pUK408重组质粒，见图6所示流程。(5)DNA序列测定
重组质粒DNA的提取，采取碱性SDS裂解细胞PEG NaCl方法，经7％Agarose凝胶电泳检查，基本上不含RNA，可供DNA序列测定用。DNA序列测定采用的是T7聚合酶测序系统(Promega公司产品)，结果如前所述序列。
已有报道的不同来源的Sak基因序列及其酶蛋白氨基酸同源性均很高。然而，在第34和43位的密码子及其编码的氨基酸往往有所不同。由表一可以看出，本发明的Sak63在这些位点上的密码子及其编码的氨基酸，不仅不同于噬菌体DNA来源的Sak s-c和Sak42D基因，而且也不同于金葡菌染色体DNA的Sak star基因。本发明Sak63第34位编码的是甘氨酸，Sak star是丝氨酸；本发明Sak63第43位编码的是精氨酸，而Sak star是组氨酸。显然，本发明提供的Sak63是一个新的葡激酶基因。(6)高效表达质粒pHK408的构建按图7的流程构建高效表达质粒pHK408。质粒DNA的制备参考Sambrook等人的方法。取DH5α(pUK408)质粒单菌落，接于LB-AP液体培养基中，37℃振荡培养过夜。以碱性SDS处理裂解大肠杆菌细胞，以PEG-NaCl沉淀掉RNA，得到质粒DNA。经SDS-PAGE检查，基本上不含RNA。以EcoRI和BamH1酶切pUK408 DNA，经1.5％Agarose电泳分离，切下小片段DNA，按Genelute Agarose Spin Columns方法，得到纯化DNA。
pUV606载体质粒，按上述方法分离纯化。以EcoRI和BamH1双酶切。
ddH2O36μl10×buffer 5μl质粒DNA(0.5μg/μl)5μlEcoRI(20U/μl) 2 μlBamH1(12U/μl) 2μl37℃保温2小时。
酶切反应液走0.7％Agarose电泳，在长波长紫外灯下切下DNA大片段。按Genelute Agarose Spin Columns方法纯化。将上述基因片段与pUV606质粒DNA进行连接，16℃反应12小时，转入DH5α受体菌。提取重组质粒DNA，经EcoRI和BamH1双酶切，走1.2％Agarose凝胶电泳，确认DNA基因片段的插入。将含重组质粒的DH5α(pHK408)菌株，接入LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，离心取上清液，点在人血纤维蛋白平皿上37℃保温16小时，产生透明圈，确认该菌株能够表达产生葡激酶。(7)工程菌TG2(pHK408)的高效表达pHK408质粒转入不同的大肠杆菌菌株，如JM109、DH5α、TG1或TG2均有较高的表达水平。
工程菌TG2(pHK408)接种于50ml PY培养基中(1000ml、16g胰蛋白胨，5g酵母粉，5g NaCl，PH7.2)30℃振荡培养6小时，立即升温至42℃继续振荡培养5-6小时，离心收集菌体。菌体悬浮在5mlTSE溶液中(20mM Tris-HCl-50mM NaCl-10mM EDTApH8.0)，用JY92-II型超声波细胞粉碎机进行超声处理，离心收集上清液，进行SDS-PAGE电泳分析。电泳完毕，将电泳凝胶板取下，贴在预先制成的含有人纤溶酶原的纤维平板上，拷贝约10-20分钟后，取出电泳凝胶进行考马斯亮兰染色。纤维平板室温放置或37℃保温约20分钟，即在葡激酶处出现透明区带。
为了考察工程菌TG2(pHK408)表达产物Sak在大肠杆菌可溶蛋白的比例，超声波细胞破碎上清液，走SDS-PAGE电泳。考马斯亮兰染色，褪色至背景清晰后，用Pharmacia Image MasterSoftware and Sharp J×330 Scanner扫描仪进行凝胶扫描，如图8所示。图8中1，9为细胞色素C(W.M 13370)2，10为RNaseA(W.M.15000)；3为未诱导DH5α(pHK408)全细胞裂解液；4为未诱导DH5α(pHK408)细胞超声破碎上清液；5为未诱导DH5α(pHK408)细胞超声破碎沉淀；6为诱导的DH5α(pHK408)全细胞裂解液；7为诱导DH5α(pHK408)细胞超声破碎上清液；8为诱导DH5α(pHK408)细胞超声破碎沉淀。葡激酶区带在细胞破碎上清液总蛋白各区带中约占40％。可见，这个表达系统十分有效。
权利要求
1.一种葡激酶基因，其特征在于该基因是由金葡菌SL1.063菌株的染色体DNA，经PCR扩增获得的，该基因的核苷酸全序列及其编码的氨基酸如下序列TCA AGT TCA TTC GACAAAGGA AAA TATAAASer Ser Ser Phe AspLysGly Lys TyrLys10AAA GGC GAT GAC GCGAGTTAT TTT GAACCALys Gly Asp Asp AlaSerTyr Phe GluPro20ACA GGC CCG TAT TTGATGGTA AAT GTGACTThr Gly Pro Tyr LeuMetVal Asn ValThr30GGA GTT GAT GGT AAGGGAAAT GAA TTGCTAGly Val AspGly34LysGlyAsn Glu LeuLeu40TCC CCT CGT TAT GTCGAGTTT CCT ATTAAASer ProArg43Tyr ValGluPhe Pro IleLys50CCT GGG ACT ACA CTTACAAAA GAA AAAATTPro Gly Thr Thr LeuThrLys Glu LysIle60GAA TAC TAT GTC GAATGGGCA TTA GATGCGGlu Tyr Tyr Val GluTrpAla Leu AspAla70ACA GCA TAT AAA GAGTTTAGA GTA GTTGAAThr Ala Tyr Lys GluPheArg Val ValGlu80TTA GAT CCA AGC GCAAAGATC GAA GTCACTLeu Asp Pro Ser AlaLysIle Glu ValThr90TAT TAT GAT AAG AATAAGAAA AAA GAAGAATyr Tyr Asp Lys AsnLysLys Lys GluGlu100ACG AAG TCT TTC CCTATAACA GAA AAAGGTThr Lys Ser Phe ProIleThr Glu LysGly110TTT GTT GTC CCA GATTTATCA GAG CATATTPhe Val Val Pro AspLeuSer Glu HisIle120AAA AAC CCT GGA TTCAACTTA ATT ACAAAGLys Asn Pro Gly PheAsnLeu Ile ThrLys130GTT GTT ATT GAA AAGAAAVal Val Ile Glu LysLys136
2.根据权利要求1所述葡激酶基因的高表达工程菌株，其特征在于由产葡激酶活性高的菌株(SL1.063)的染色体模板DNA，采用引物P-Nm1和引物P-C经PCR扩增，得到完整的葡激酶基因DNA小片段；该基因DNA片段与pUC19载体质粒，分别以EcoR I和BamH1酶切；再将酶切的上述质粒和葡激酶基因DNA小片段，用T4DNA连接酶连接获得pUK408质粒DNA，再转化入DH5α或JM109大肠杆菌细胞内，构建成葡激酶高表达的工程菌株DH5α(pUK408)或JM109(pUK408)。
3.根据权利要求2所述葡激酶基因的高表达工程菌株，其特征在于所述的引物P-Nm1，其核苷酸序列5′-CGCGAATTCATGTCAAGTTCATTCGACAAAGG-3′，键长32；所述的引物P-C，其核苷酸序列5′-CGCGGATCGTATTTCTTTTCTATAACAACCTTTG-3′，键长34。
4.根据权利要求2所述葡激酶基因的高表达工程菌株，其特征在于所述的pUK408重组质粒DNA，还可与另一种pUV606载体质粒，分别经EcoRI和BamH1酶切pUK408重组质粒产生的小片段DNA，和酶切pUV606的大片段DNA，通过T4DNA连接酶连接成pHK408质粒DNA，转化入DH5α或TG1或TG2大肠杆菌细胞内，构建成含重组质粒pHK408的葡激酶高表达的工程菌株DH5α(pHK408)。
全文摘要
本发明公开了一种葡激酶(Sak)基因及其高表达工程菌株。以产Sak的金葡菌染色体DNA为模板,经PCR扩增获得编码Sak基因。该基因序列第34和43位编码的氨基酸,不同于已报道的Sak基因。并采用特定核苷酸序列的引物进行扩增,获得重组DNA片段,经纯化、鉴定、酯切、连接。转化入宿主细胞,构建成Sak高表达工程菌株,表达产物具有纤溶酶原激活剂作用,对人纤维蛋白有很高的水解活性。可治疗心肌梗塞,脑、肺血栓等栓塞性疾病。
文档编号C12N15/58GK1180106SQ97105988
公开日1998年4月29日 申请日期1997年7月19日 优先权日1997年7月19日
发明者张其玖, 张贵才, 徐广峰, 曲桂武, 别立亮, 徐婉学, 吴允山 申请人:白寒三