专利名称：治疗丙型肝炎病毒相关性疾病的反义寡核苷酸的结构与用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程药物领域，具体地说是一种针对丙型肝炎病毒(hepatitisC virus，HCV)的反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide，ASODN)的序列与结构及其成为治疗HCV相关性疾病、减小HCV相关性疾病危害性的新型药物。
丙型肝炎是由HCV引起的一种严重威胁人类健康的重要传染病。据世界卫生组织最新统计，全世界约有1.7亿HCV携带者，其中95％以上分布在发展中国家。我国健康人群和散发性急性病毒性肝炎病例中HCV感染率分别达2.2％和2.15％以上，与血液接触频繁的人群丙肝流行率可高达60％以上，属丙型肝炎的高发区(康来仪等。中华传染病杂志，1997，1571-75)。丙型肝炎慢性化率高达85％以上，其中20％的患者在10年内发展为肝硬化，且与肝细胞癌的发生密切相关(Seeff.Hepatology，1997，26(Suppl 1)21S-28S.Di Bisceglie AM，et al.Hepatology，1997，26(Suppl 1)34S-38S)。目前尚无有效的丙肝预防疫苗和特异性治疗药物。α-干扰素是目前最常用的抗HCV药物，在严格选择适应证的患者中，有效率仅15-25％，且有明显副作用(Dusheiko G.Hepatology，1997，26(Suppl 1)112S-1218S)。因此，急需寻求特异高效的抗HCV药物。
ASODN是研究细胞与病毒基因功能的重要工具，另一方面，由于ASODN与特定基因按碱基配对原理结合即杂交，从而抑制该基因表达，因此被认为是理想的具有精确选择性的基因靶向治疗药物(Milligan JF，et al.J Med Chem，1993，361923-1937.Askari FK，et al.New Engl J Med，1996，334316-318)。实验研究表明ASODN能有效地抑制体外培养细胞中艾滋、肝炎等病毒的复制。I-III期临床资料显示ASODN对艾滋、巨细胞及乳头瘤等病毒感染疾病有较好的疗效。ASODN还可特异性抑制细胞粘附分子，对Crohn’s病、类风湿性关节炎、牛皮癣、肾移植排斥等免疫反应性疾病有显著的疗效。此外，初步研究证明ASODN对心血管及肿瘤等疾病也有一定的应用前景。针对肿瘤相关基因BCL2、c-myb、Ras、Bgl-2、Raf、PKC-a、P53及Bcl-ABL的ASODN也已进入I-II期临床观察(Bennett CF.Science，1996，271434.Bomm D.Lancet，1996，347820.Edgington SM.Nature Biotechnology，1997，15519-524.Zurer P.ChemEngineer News，1997，35-39.)。由于ASODN作用的高度特异性，因此被认为是极具潜力的抗病毒和抗肿瘤新药。近年来逐渐成为国内外医药学界注意的焦点，国外已有一些著名制药企业已将反义药物作为其新药研究开发的重点方向之一。美国基因工程通讯还将反义核酸列为90年代十大热门生物技术之一。目前已申请有关专利200余篇，包括抗病毒、抗肿瘤ASODN序列及不同的修饰方法等。有关丙型肝炎的反义寡核苷酸已有两家申请专利(专利号WO 94/05813；WO95/30746)。
HCV基因组为一单股正链RNA，长约9.4kb，含5’与3’NCR及一个大的开读框，只有一个起始密码子，编码一个大的多聚蛋白前体，在细胞及病毒蛋白酶作用下，从5’端到3’端依次产生C、E1、E2、NS2-NS5蛋白。不同国家、不同地区HCV基因组存在明显的异质性。其5’NCR在所有病毒分离株中是最保守的区域，由341个核苷酸组成，形成了复杂的二、三级结构，有4个茎环结构包括多聚蛋白翻译起始位点，含帽非依赖性mRNA翻译所必需的IRES。HCV5’NCR在HCV RNA翻译与复制过程中可能发挥重要的调控功能(徐东刚等.国外医学分子生物学分册，1995，17180-182.Major ME，et al.Hepatology，1997，251527-1538.)。从HCV分子生物学特征来看，HCV可能是ASODN的理想作用靶标。ASODN作用靶序列的明确是ASODN研究的关键步骤，ASODN必须与靶mRNA杂交，才能发挥活性，这明显受靶mRNA在细胞内的空间结构影响，尽管计算机已预测了HCV5’NCR及翻译起始区的二级结构图，成为ASODN设计的重要依据，但由于靶mRNA在细胞内的状态难以预测，因此，所设计的ASODN能否接近靶序列，有待在体内、外对ASODN作进一步的活性筛选与评价。
本发明的目的在于寻找特异高效的新型抗HCV药物即对HCV基因具有较好抑制活性的ASODN及能改善其生物活性的化学修饰衍生物。
本发明的主要内容是，根据从中国患者血清中克隆及序列分析获得的HCV5′NCR全长序列，部分C基因序列(25个氨基酸)，参考其计算机预测的二级结构，采用计算机辅助设计了15条S-ASODNs、三条正义寡核酸及1条随机序列(见表1)。采用PE公司产391A型自动DNA合成仪合成并在合成时进行硫表1 硫代反义寡核苷酸序列及性质序号 名称 HCV靶位 长度 特 序列5’-3’(nt)(nt) 性1 HCV41 21-41 21A AGT GAT TCA TGG TGG AGT GTC2 HCV65 45-65 21A GAA GAC AGT AGT TCC TCA CAG3 HCV88 68-88 21A CCA TGG CTA GAC GCT TTC TGC4 HCV123 103-12321A GGG GTC CTG GAG GCT GCA CGA5 HCV173 153-17321A TTC CGG TGT ACT CAC CGG TTC6 HCV217 196-21722A CAT TGA GCG GGT TGA TCC AAG A7 HCV243 223-24321A CGT GGG GGC ACG CCC AAA TCT8 HCV279 257-27923A GCC TTT CGC CAC CCA ACA CTA CT9 HCV313 293-31322A GCA CTC GCA AGC ACC CTA TCA G10HCV363 341-36323A GAG GTT TAG GAT TCG TGC TCA TG11HCV349 327-34923A GTG CTC ATG GTG CAC GGT CTA CG12HCV373 351-37323A GTT TTT CTT TGA GGT TTA GGA TT13HCV345 324-34522A TCA TGG TGC ACG GTC TAC GAG A14HCV358 339-35820A TTA GGA TTC GTG CTC ATG CT15HCV352 333-35220A TTC GTG CTC ATG GTG CAC GG16HCV279s 257-27923S AGT AGT GTT GGG TCG CGA AAG GC17HCV363s 341-36323S CAT GAG CAC GAA TCC TAA ACC TC18HCV349s 327-34923S CGT AGA CCG TGC ACC ATG AGC AC19NS - 21R GCA GAG GTG AAA AAG TTG CATA反义；S正义；R随机序列代修饰。经Micro Pure II反相纯化柱(Solid Phase Sciences)纯化备用。建立HCV5’NCR调控荧光素酶基因在HepG2细胞中的瞬间表达系统及HCV RNA 5’NCR调控荧光素酶基因的转基因细胞模型HepG2.9706。采用该两种体外活性评价模型，对上述ASODNs进行筛选及评价。在瞬间表达系统中，5条S-ASODN即HCV65、HCV279、HCV363、HCV349及HCV352在25-100nmol/L浓度范围内，对HCV调控基因具有特异性的剂量依赖性抑制活性。当浓度为100nmol/L时，这些ASODN的抑制率基本在80％以上。在稳定表达细胞模型中进一步论证了HCV363、HCV349及HCV279对HCV调控基因仍具有明显的抑制活性。此外，对具有较好抑制活性的HCV363序列进行了多种化学修饰并分析了不同修饰对ASODN体外稳定性及对HCV5’NCR调控基因的抑制活性的影响。结果证明硫代修饰ASODN稳定性及细胞内的抑制活性最好。
根据本发明，针对HCV 5’NCR第二茎环结构IIa(HCV 65)、第三茎环结构IIId(HCV279)和翻译起始区(HCV363及HCV349)的ASODNs能特异性抑制HCV调控基因的功能，有可能成为治疗及预防HCV相关疾病的新型生物工程药物。
根据本发明，HCV65的长度为21个核苷酸，HCV279、HCV363及HCV349的长度均为23个核苷酸。反义寡核苷酸的长度与其细胞通透性、与靶序列结合亲和性及作用特异性等因素相关。HCV65、HCV279、HCV349及HCV363的长度根据实验确定，本发明包含了与HCV65、HCV279、HCV349及HCV363具有相同序列的任何长度寡核苷酸。
根据本发明，HCV65、HCV279、HCV349及HCV363可用于抑制I、II、III及IV型HCV RNA。因其所互补的序列在各型中是保守的区域。
根据本发明，为增强反义寡核苷酸的核酸酶抗性、生物利用度及组织靶向性等，本发明包含了HCV65、HCV279、HCV349及HCV363的各种化学修饰，例如硫代修饰、半乳糖直接修饰、亲脂性分子或pH敏靶向脂质体修饰等。
根据本发明，本发明优选的抗HCV反义寡核苷酸序列为HCV363。
根据本发明，本发明的寡核苷酸及其修饰物可按本领域已知方法配成非肠道给药的制剂。
根据本发明，本发明的寡核苷酸及其修饰物治疗组成可应用单独的有效成分或组合物形式包括联合其它反义寡核苷酸及衍生物形式。
根据本发明，本发明的治疗组成，依不同情况包括特定药物的药物动力学、药代动力学、给药模式、给药途经、受者的年令、体重、肝肾功能状态、疾病的性质、程度及治疗时限等，以适宜的剂量给药。
本发明的实施对严重危害人类健康的丙型肝炎及其相关疾病的治疗具有重要的社会效益和经济效益。结合附表
本发明的具体实施方法图1 HCV5’NCR调控荧光素酶表达质粒的构建图2 HCV5’NCR-C片段的PCR扩增ADNA标准(pBR 344/Hinf I)，BPCR产物图3 pHCV-luc09与pGL3荧光素酶在HepG2细胞中的表达1. HepG2细胞(0.11±0.02)，2. pHCV-luc09(1141.9±151.1)3. pGL 3(5716.0±435.1)图4 HCV5’NCR调控荧光素酶稳定表达质粒的构建图5 HepG2.9706细胞内HCV片段的PCR及RT-PCR检测MDNA标准(100bp DNA Ladder，)1-3分别为第15代细胞RNA、RNA(无反转录酶)及DNA的扩增产物4-6分别为第60代细胞RNA、RNA(无反转录酶)及DNA的扩增产物7HepG2细胞RNA扩增产物，8HepG2细胞DNA扩增产物，9水图6 HepG2.9706细胞荧光素酶表达的动力学曲线A第15代HepG2.9706细胞，B第60代HepG2.9706细胞图7 ASODN对HCV调控基因抑制的序列特异性图8 翻译起始区S-ASODN序列的优化图9 S-ASODNs对HCV调控基因的剂量依赖性抑制活性图10 S-ASODNs对HCV调控基因的特异性抑制活性图11 HCV连续7天用药对HCV调控基因的影响图12 停药后HCV363对HCV调控基因的持续性作用实施例一材料与方法1. HCV-RNA 5’NCR-C区片段的制备(见图1)1.1模板pHCV376(军事医学科学院王升启博士构建)含有HCV-RNA 5’NCR及C区部分序列(第25-400nt)。1.2引物设计与合成根据中国人HCV基因组(II型)序列，设计合成一对引物，上游引物H1(5’GCATCAAGCTTGCCAGCCCCCGATTGGGGGCGACACTCCACCATGAATCA3’，50个nt)含有HindIII酶切位点及HCV基因组1-39位核苷酸(nt)，下游引物H2(5’AACGATCTGACCACCACCCCGGAACTTGACGTCCTGTGGGCGGCGGTTG3’，49个nt)位于HCV基因组第419-386位核苷酸，引物采用PE公司产391A型自动DNA合成仪合成。1.3 PCR扩增反应体系20μl，含10×PCR缓冲液2μl(Promega公司产品)，dNTPs 0.2mmol/L，MgCl21.5mmol/l，引物H1及H2各0.1μg，pHCV376 0.1μl，Taq酶0.5U(Promega公司产品)，石腊油20μl。PCR反应条件为94℃变性30秒；72℃延伸40秒；60C退火10秒；循环35次后72C延伸10分钟。扩增产物采用1.5％低溶点琼脂糖凝胶电泳分离并用PCR产物纯化试剂盒(Promega)纯化。纯化产物用Klenow大片段(华美生物工程公司)处理后进行纯化及HindIII酶切。2. HCVRNA 5’NCR调控荧光素酶表达质粒(pHCV-luc09)构建如图1所示将pGL3载体采用NcoI(Promega)酶切，绿豆核酸酶(华美生物工程公司)削平，再用HindIII酶切。每次酶切后均用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提及乙醇沉淀。最后用0.8％低溶点琼脂糖凝胶电泳纯化，去除切割下的小片段。载体与5’NCR-C片段的连接及转化参照《分子克隆》，插入片段与载体的摩尔比为6∶1，感受态细胞为Promega公司产品。3.克隆鉴定3.1 PCR鉴定在pGL3 Control Vector上5’NCR-C插入片段两侧各合成1条引物，上游引物G1序列为5’AGAAGTAGTGAGGAGGCTT T3’(20nt)，下游引物G2序列为5’AGAATGGCGCCGGGCCTTTC3’(20nt)，用PE公司产391A型自动DNA合成仪合成。采用不同的引物组合进行菌体PCR扩增鉴定。载体引物G1-G2组合，鉴定是否为阳性克隆。载体5’端引物G1与插入片段3’端引物H2组合及载体3’端引物G2与插入片段3’端引物H2组合，鉴定插入片段的方向。3.2序列分析采用Promega公司Wizard Minipreps DNA Purification System试剂盒，按操作说明进行质粒提取。采用双脱氧链终止法及fmol DNA SequencingSystem(Promega公司)按说明书操作进行序列分析。4.质粒在HepG2细胞中的表达4.1细胞培养HepG2肝癌细胞由军事医学科学院微生物与流行病研究所王海涛研究员惠赠。采用DMEM培养基含10％小牛血清，青霉素10OU/ml，链霉素100ug/ml，在37℃，5％CO2条件下进行培养及传代。4.2质粒转染HepG2肝癌细胞接种于24孔板(Costar)，0.5×105/孔，70-80％细胞融合后，采用脂质体Lipofectin(1mg/mL，Life Technologies公司产品)试剂盒进行转染并按说明书操作。每次实验均做双孔。4.3荧光素酶活性检测采用荧光素酶测定试剂盒(Lucifer-ase Assay System，Promega)及推荐的操作步骤进行。化学发光仪为LKB公司的Wallac 1250Luminometer，输出值为毫伏(MV)。4.4转染条件的优化取不同剂量(2-10μl)的Lipofectin及pHCV-luc091μg混合后与细胞一起孵育5h进行转染，以确定Lipofectin的最佳浓度。取不同浓度pHCV-luc09质粒(0.25-4μg)及Lipofectin 6μl，混合后孵育5h转染，以确定最佳质粒浓度。采用不同孵育时间(2-12h)及Phcv-luc09 1μg和Lipofectin 6μl进行转染，以确定最佳孵育时间。结果1. HCV-RNA 5’NCR-C片段的特异性根据设计的引物，PCR产物(5’NCR-C片段)的扩增长度为430bp，实际扩增片段经琼脂糖电泳分析与设计长度一致(图2)，由此获得含有5’NCR完整序列及C区5’端25个密码子的目的基因片段，其上游含有HindIII酶切位点。2. HCV-RNA 5’NCR-C片段克隆的鉴定2.1阳性克隆鉴定转化菌落共35个，分别挑取少许菌体进行PCR扩增，阳性克隆的限制扩增片段长度为509bp，结果显示8个克隆扩增出与设计长度一致的阳性条带即509bp条带。2.2克隆方向鉴定采用引物G1与H2，G2与H2组合对8个阳性克隆进行菌体PCR扩增，G1与H2组合的扩增片段长度为469bp，出现阳性条带为正向插入，阴性结果为反向插入，G2与H2组合的扩增片段长度为464bp，出现阳性条带为反向插入，阴性结果为正向插入，实际结果表明8个阳性克隆均为正向插入，这与所设计的定向克隆相一致。2.3序列分析鉴定分别提取两个质粒(pHCV-luc09)及(pHCV-luc13)进行序列分析，结果表明pHCV-luc09的插入片段5’NCR-C序列与中国人HCV序列一致，但其3’端缺失了15个核苷酸，5’NCR-C片段第419位核苷酸C取代了A，两端与载体连接处序列与所设计的相一致，即荧光素酶基因的起始密码子被去除。而pHCV-luc13的插入片段5’NCR-C 3’端缺失20个核苷酸。2.4质粒在HepG2细胞中的表达8个阳性克隆提取的质粒分别转染HepG2肝癌细胞，通过化学发光的方法检测荧光素酶活性的表达，结果表明8个质粒中仅有一个质粒能够表达荧光素酶活性称为pHCV-luc09，其绝对值达1141.9±151.1MV(细胞对照为0.1l±0.02MV)(图3)，是pGL3报告载体荧光素酶活性的20％，其余7个质粒基本上不表达荧光素酶活性。当质粒用量为1μg，Lipofectin用量为6μl，Lipofectin-质粒复合物与细胞孵育4h时，pHCV-luc09在HepG2细胞中可获得最佳转染效果，此时酶活性测定值最高可达1126.8MV。实施例二材料与方法1.质粒构建及鉴定1.1 HCVRNA 5’NCR调控荧光素酶表达质粒(pHCV-neo4)构建如图4所示pHCV-luc09经Hind III(华美生物工程公司产品)酶切，klenow(Biolabs产品)补平(完全补平或部分补平)，再用Xba I(Biolabs产品)酶切，低溶点琼脂糖凝胶(Promega产品)电泳分离纯化，获得目的基因片段即HCV5’NCR-C与luc的融合基因片段。pCI-neo表达载体(Promega产品)进行NheI(Biolabs产品)酶切，klenow补平(完全补平或部分补平)，再用Xba I酶切及低溶点琼脂糖凝胶电泳纯化，去除切割下的小片段。目的基因片段与pCI-neo载体的连接及转化参照《分子克隆》，插入片段与载体的摩尔比为3∶1，JM109感受态细胞及T4 DNA连接酶为Promega产品。1.2克隆鉴定a. PCR鉴定在pCI-neo载体上插入片段上游合成1条引物P1，序列为5’TAATACGACTCACTATAGGG3’(20mer)，另一条引物G2互补于插入片段的HCV5’NCR-C基因的3’端，序列为5’AACGATCTGACCACCACCCCGGAACTTGACGTCCTGTGGGCGGCGGTTG3’(49mer)，用PE公司产391A型自动DNA合成仪合成。通过引物P1与G2进行菌体PCR扩增，鉴定阳性克隆。b.表达活性鉴定采用Promega WizardMinipreps DNA Purification System试剂盒提取质粒，进行luc表达活性鉴定。质粒转染时，HepG2肝癌细胞接种于24孔板(Costar)，细胞密度5×104/孔，70-80％细胞汇合后，采用脂质体Lipofectin(1mg/mL，GIBCO/BRL，LifeTechnolog ies公司产品)试剂盒进行转染并按说明书操作。荧光素酶活性检测方法同前。c.质粒大小及酶切鉴定将构建的质粒与pCI-neo载体电泳分析，通过质粒大小鉴定阳性克隆。选择构建质粒上唯一的Xba I和Nhe I位点进行酶切反应及1％琼脂糖凝胶电泳，通过电泳条带的大小鉴定插入片段的正确性。Xba I位点在质粒构建过程中重建，而pCI-neo载体上Nhe I位点在质粒构建过程中被破坏，但HCV 5’NCR内存在一个Nhe I位点。2.质粒转染及稳定表达克隆的筛选HepG2细胞以3×105密度接种于60mm培养皿(Costar产品)，60-70％细胞汇合后，采用脂质体lipofectin(1mg/ml，GIBCO/BRL)进行质粒的转染并按说明书操作，24小时后，转染细胞按1∶10传代，同时加G418 700μg/ml(GIBCO产品)进行筛选，每3天换液1次，4周后，进行阳性克隆的鉴定。3.阳性克隆的鉴定3.1表达荧光素酶的活性鉴定在显微镜下挑取单个细胞克隆至24孔板(Costar)培养，培养液中G418含量减小至400μg/ml，每孔细胞100％汇合后，进行荧光素酶活性检测，方法同前。3.2 DNA整合的鉴定取高水平表达荧光素酶活性的细胞(第15代与第60代)进行细胞内HCV片段的扩增。约3×105细胞用PBS(PH7.3)洗二次，加100μl含酚裂解液裂解细胞，加50μl氯仿摇匀，12000转/分离心2分钟，DNA用乙醇沉淀，75％乙醇洗涤后用10μl水溶解，取1μl进行PCR扩增。扩增体系为20μl，扩增试剂为军事医学科学院HCV-RNA PCR试剂盒中的PCRmix，Taq酶为Promega产品，扩增条件为94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共循环35次。扩增引物位于HCV 5’NCR内，限制性扩增片段长220bp。3.3 mRNA转录的鉴定取高水平表达荧光素酶活性的细胞(第15代与第60代)进行细胞内HCV片段相应mRNA的检测。采用TRIZOL试剂(GIBCO)，按说明书操作，分离提取细胞(约5×105)总RNA，并用RQ1 DNase(1u/μl，Promega)进一步处理以去除可能残留的DNA，取1μl(1μg/μl)总RNA溶解于19μl PCR混合物并加入酶混合物0.5μl(军事医学科学院HCV-RNA PCR试剂盒中的产品)，42℃反转录40分钟后，进行PCR扩增。扩增条件同上。同时设不加反转录酶仅加Taq酶的反应管为对照，设β2珠蛋白mRNA为内参照，其限制性扩增片段长317bp。3.4转基因细胞的表达动力学及稳定性检测第15代转基因细胞与第60代转基因细胞分别以7×104/孔接种24孔板，每24小时各取4孔细胞检测其荧光素酶活性，观测144小时。掊养细胞每天换液1次，培养液为含2％胎牛血清及G418μg/ml的DMEM。结果1构建质粒的鉴定由于Hind III与Nhe I酶切反应后产生的末端有部分互补性，因此，在klenow补平两个末端时采用了部分补平或完全补平的策略，结果提示部分补平与完全补平末端的连接效率均很高。1.1 PCR鉴定随机挑取20个转化菌落进行鉴定，根据设计的引物，阳性克隆的限制扩增片段长度为463bp，结果显示20个转化菌落中，15个克隆扩增出与设计长度一致的阳性条带。1.2表达活性鉴定取4个阳性克隆(4、5、8、9号)提取质粒分别转染HepG2细胞，结果显示4个质粒均能表达荧光素酶活性，分别为3267、2388、306、2150(MV)。1.3大小鉴定4个质粒与pCI-neo载体对照电泳显示迁移速率存在差异。pCl-neo载体为5474bp，构建的质粒大小应为7522bp，4个质粒的迁移速率应较pCl-neo载体缓慢，实际结果与此相一致。1.4酶切鉴定4号质粒(称为pHCV-neo4)经Xba I及Nhe I酶切后应产生1821bp及5701bp两个片段，实际结果与理论值相一致。2 HCV 5’NCR转基因细胞模型的建立选择pHCV-neo4转染HepG2细胞，经G418筛选，挑取了150个克隆进行荧光素酶活性检测，最终获得1个荧光素酶活性表达为1443MV的细胞株，称为HepG2.9706。对HepG2.9706进行细胞内HCV片段的PCR扩增，获得220bp的阳性条带，而对照HepG2细胞则阴性(图5)。由HepG2.9706细胞分离RNA，进行RT-PCR检测，HepG2.9706出现317bp(内参照)及220bp(目的基因)条带，而HepG2细胞仅出现317bp条带，表明HepG2.9706细胞内含有目的基因转录的mRNA(图5)。由于不加反转录酶的HepG2.9706反应管未见特异性条带，从而排除了DNA污染的可能。β2珠蛋白mRNA作为内参照，在相同的反应条件下，与特异性目的基因同时扩增。经凝胶成像仪(Bio-RAD Gel Doc 1000)对扩增产物密度定量，发现目的基因mRNA水平约为β2珠蛋白mRNA水平的51％。结果证实转基因确实存在于HepG2.9706细胞内，并在细胞内进行复制及表达，且表达水平相对较高。HepG2.9706接种24孔板，能够持续地表达荧光素酶活性，24小时时，荧光素酶活性表达最高，达952MV，随后稍有下降，培养144小时后，荧光素酶活性仍有716MV(图6)。以上均为HepG2.9706细胞建立早期(第15代)细胞的鉴定结果，为观测HepG2.9706细胞内转基因的稳定性，对第60代HepG2.9706细胞进行了mRNA、DNA及荧光素酶活性表达检测，结果显示第60代HepG2.9706细胞内mRNA及DNA仍阳性，与第15代细胞基本一致(图5)，第60代HepG2.9706细胞荧光素酶活性表达较高，接种24小时，可达2247MV，1-4天内荧光素酶活性变化较第15代细胞明显，随后趋于稳定。实施例三材料与方法1. S-ASODN的设计和合成根据从中国患者血清中克隆及序列分析获得的HCV5’NCR全长序列，部分C基因序列(25个氨基酸)，参考其计算机预测的二级结构，采用计算机辅助设计了15条S-ASODNs、三条正义寡核酸及l条随机序列(见表1)。所有寡核苷酸均采用PE公司产391A型自动DNA合成仪合成并在合成时进行硫代修饰。合成完毕浓氨水55℃切割并脱保护15小时后，经Micro Pure II反相纯化柱(Solid Phase Sciences)纯化，紫外(Beckman DU640)定量后真空(Oligo Prep OPl20，SAVANT)干燥，-20℃保存备用。2.质粒转染HepG2肝癌细胞接种于96孔板(NUNC)，1×104细胞/孔，37℃，5％CO2孵育18-20小时，80-90％细胞汇合后，在无血清状态下，采用脂质体lipofectin(GIBCO，1mg/ml)试剂并参照说明书操作进行pHCV-neo4质粒转染。每孔细胞用质粒0.1μg，脂质体lμg，总体积l00μl。转染时，在消毒的1.5ml离心管中，质粒0.1μg与脂质体1μg分别用无血清DMEM培养基12.5μl稀释，室温放置30分钟后，将脂质体与质粒溶液混匀，室温下再置30分钟，以便形成脂质体-质粒复合物，然后加入无血清DMEM培养基75μl。培养细胞用无血清DMEM培养基洗二次，每孔细胞加入总体积100μl的质粒-脂质体复合物溶液，作用5小时，换含l0％小牛血清的DMEM生长培养基，继续培养24小时后，检测荧光素酶活性。3. S-ASODN活性评价将S-ASODN分别与质粒共转染HepG2肝癌细胞，方法同上。以不加S-ASODN的质粒转染为阳性对照。每次实验中，每一S-ASODN均设3孔，结果取其平均值。4.荧光素酶活性检测荧光素酶活性检测采用荧光素酶测定试剂盒并参考其推荐的操作步骤进行。待测细胞用PBS(pH7.3)洗二次，每孔细胞加1×细胞裂解液20μl，室温下裂解10分钟，加荧光素酶作用底物50μl，混匀，立即在多标记检测仪(VICTORTMWallac1420MULTILABEL COUNTER)上测1秒钟发光强度，输出值为CPS。结果1. S-ASODN抑制HCV调控基因的有效靶序列及剂量依赖性从表2中可见，12条S-ASODN中，有6条即HCV65、HCV88、HCV279、HCV313、HCV363及HCV349对HCV调控基因的抑制活性超过50％，浓度在25-l00nmol/L范围内时，具有明显的剂量依赖性。HCV88与HCV313的抑制活性相对较低，IC50值分别为101.1nmol/L与74.7nmol/L，在l00nmol/L浓度时，其抑制率分别为50.2％与63.2％。HCV65、HCV279、HCV363及HCV349的抑制活性较强，IC50值分别为44.7nmol/L、50.2nmol/L、36.3nmol/L及41.6nmol/L，在l00nmol/L浓度时，其抑制率分别为88.8％、81.9％、82.8％及87.8％。另外6条S-ASODN未见明显的抑制活性，且无剂量依赖性关系，其中4条S-ASODN可见促进荧光素酶表达的作用。ASODN的GC含量与其活性之间无明显关系。2. S-ASODN抑制HCV调控基因的序列特异性选择S-ASODN HCV279、HCV363与HCV349靶序列的正义寡核苷酸HCV279s、HCV363s与HCV349s及无关序列NS与pHCV-neo4共转染，同时将S-ASODN HCV279、HCV363
表2 12条S-ASODN对HCV调控基因的抑制活性名称 二级结构 GC含量(％) 抑制率(％) IC50值25nmol/L 50nmol/L 100nmol/L (nmol/L)HCV41 单链 50 3.917.0 -4.1＞100HCV65 茎环结构IIa50 25.3 53.2 88.844.7HCV88 茎环结构IIb60 24.0 34.6 50.2＞100HCV123 茎环结构IIc75 -16.4 10.6 -48.3 ＞100HCV173 茎环结构IIIa 60 32.2 39.1 28.1＞100HCV217 茎环结构IIIb 55 3.99.828.2＞100HCV243 茎环结构IIIc 70 -296.630.7＞100HCV279 茎环结构IIId 65 14.1 50.3 81.950.2HCV313 假结结构 65 7.128.5 63.274.7HCV363 茎环结构IV 55 39.1 57.0 82.836.3HCV349 茎环结构IV 70 25.4 62.0 87.841.6HCV373 单链 35 -17.9 5.7-8.0＞100及HCV349与不含HCV靶序列的pGL3荧光素酶报告载体共转染作为阴性对照实验。从图7可见，在25-100nmol/L浓度范围内，HCV279s、HCV363s、HCV349s及NS对pHCV-neo4荧光素酶活性的最高抑制率分别为51.1％、17.2％、19.6％及7.6％，HCV363s可见促进表达的作用。图2显示HCV279、HCV363及HCV349对pGL3荧光素酶活性的最高抑制率分别为40.2％、43.3％及48.4％。在25-100nmol/L浓度范围内，均未见剂量依赖性关系。在该浓度范围内，S-ASODN存在轻度的非特异性作用。此外，ASODN浓度超过200nmol/L时，抑制率均超过50％，出现明显的非特异性作用。3.作用于翻译起始区S-ASODN序列的优化参考HCV翻译起始区二级结构，在HCV多聚蛋白翻译起始区324-363核苷酸区域合成了5条重叠的S-ASODN，进行翻译起始区的ASODN序列优化。结果表明HCV363、HCV349与HCV352对HCV调控基因有明显的抑制作用，在100nmol/L浓度时，抑制率分别为64.1％、69.1％与69.4％，而HCV345及HCV358则未见明显的抑制活性，最高抑制率分别为28.7％及9.2％，见图8。4. S-ASODN抑制HCV基因表达调控的协同作用选择作用于HCV RNA不同区域的ASODN HCV65、HCV279及HCV363，以50nmol/L浓度，分别采用两条ASODN组合，同时与pHCV-neo4共转染，观察S-ASODN的协同作用。HCV65+HCV279、HCV279+HCV363及HCV65+HCV363对HCV调控基因的抑制率分别为92.5％、85.8％及91.0％，而HCV65、HCV279及HCV363各自在100nmol/L浓度时，抑制率分别为95.7％、86.4％及90.0％。结果提示，浓度为50nmol/L的两条ASODN协同作用与其各自在100nmol/L浓度时的作用效果相当。实施例四材料与方法1. S-ASODN的设计和合成根据实施例三的实验结果，选择设计了3条S-ASODN及3条相应的正义寡核苷酸(见表3)。所有ASODN的合成同前。
表3 硫代反义寡核苷酸的结构及性质S-ODN性质长 度HCV靶位(nt) 序列(5’-3’)(nt)HCV363A 23 341-363GAGGTTTAGGATTCGTGCTCATGHCV349A 23 327-349GTGCTCATGGTGCACGGTCTACGHCV279A 23 257-279GCCTTTCGCGACCCAACACTACTHCV363s S 23 341-363CATGAGCACGAATCCTAAACCTCHCV349s S 23 327-349CGTAGACCGTGCACCATGAGCACHCV279s S 23 257-279AGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCA反义，S正义2. HepG2.9706细胞株及培养HepG2.9706细胞株系pHCV-neo4质粒转染HepG2肝癌细胞，经G418筛选，获得的能够高水平持续稳定地表达荧光素酶活性的细胞株，其荧光素酶基因的表达受HCV5’NCR调控。该细胞采用DMEM培养基，内含10％胎牛血清(GIBCO)，G418ug/ml(GIBCO)，青霉素100U/ml，链霉素100ug/ml，在37C，5％CO2条件下进行培养，传代。3. S-ASODN活性评价HepG2.9706细胞接种于48孔板(Costar)，0.8×105/孔，37C，5％CO2孵育24小时，80-90％细胞融合后，在无血清状态下，采用脂质体Lipofectin(GIBCO，1mg/ml)包裹S-ASODN进行HepG2.9706细胞转染。每孔细胞用脂质体3μg。转染时，在消毒的1.5ml离心管中，不同浓度S-ASODN及脂质体3μg分别加无血清DMEM培养基25μl稀释，室温下静置40分钟后，将脂质体加到S-ASODN中，轻轻混匀，室温下置30分钟，以便形成脂质体-S-ASODN复合物，然后加入无血清DMEM培养基200μl。培养的HepG2.9706细胞用无血清DMEM洗二次，每孔细胞加入总体积250μl的脂质体-S-ASODN复合物溶液，作用5小时，换含10％胎牛血清及G418的DMEM生长培养基，继续培养24小时后，检测细胞的荧光素酶活性。每次实验中，每一条S-ASODN及每一浓度均设3-4孔，最终结果取其平均值。4.荧光素酶活性检测荧光素酶活性检测采用荧光素酶测定试剂盒(Luciferase Assay System，Promega)并参考其推荐的操作步骤进行。待测细胞用PBS(pH7.3)洗二次，加1×细胞裂解液25μl，室温下裂解10分钟，将细胞裂解物移至小离心管中进行离心，去除细胞碎片，取上清20μ1，加荧光素酶作用底物100μl，立即混匀，在化学发光仪上测10秒钟发光强度。结果1. S-ASODNs对HCV基因调控抑制的剂量依赖性三条S-ASODNs分别取0.1mol/L，0.3μmol/L，0.5μmol/L三个浓度，通过脂质体介导，对HepG2.9706细胞作用24小时，以不加S-ASODN的HepG2.9706细胞为对照。活性检测结果表明三条S-ASODN对HCV基因调控均有剂量依赖性抑制活性(图9)。当浓度为0.5μmol/L时，HCV363、HCV349及HCV279抑制活性分别为42％、37％及58％。2. S-ASODNs对HCV基因调控抑制的特异性S-ASODNs及相应的硫代正义寡核苷酸以0.5μmol/L浓度，通过脂质体介导，连续3天分别作用于HepG2.9706细胞，活性检测结果显示HCV363、HCV349及HCV279对HCV基因调控的抑制率分别为61％，55％及48％，而相应正义寡核苷酸对HCV基因调控不仅无抑制活性，反而呈现促进作用(图10)。3.连续给药对S-ASODN抑制活性的影响分别取HCV363及HCV363s 0.2μmol/L，0.4μmol/L，0.8μmol/L三个浓度，通过脂质体介导，连续7天作用于HepG2.9706细胞，从图11可见HCV363呈现剂量依赖特异性抑制活性。当浓度为0.8μmol/L时，HCV363抑制率可达81％，而HCV363s仅为19％，后者显示轻度的非特异性抑制作用。4. S-ASODN抑制作用的持续性HCV363以0.5μmol/L浓度，通过脂质体介导，连续3天作用于HepG2.9706细胞，于停药后24小时，48小时，72小时，96小时，120小时及144小时后，分别测荧光素酶活性，从图12可见随着时间延长，HCV调控基因活性逐渐恢复。
权利要求
1.与丙型肝炎病毒5’非编码区及翻译起始区互补的寡核苷酸，其长度是10-30个碱基并包含下列序列的寡核苷酸硫代反义寡核苷酸序列及性质序号 名称 HCV靶位 长度 特性 序列5’-3’(nt)(nt)1 HCV4121-41 21 A AGT GAT TCA TGG TGG AGT GTC2 HCV6545-65 21 A GAA GAC AGT AGT TCC TCA CAG3 HCV8868-88 21 A CCA TGG CTA GAC GCT TTC TGC4 HCV123 103-12321 A GGG GTC CTG GAG GCT GCA CGA5 HCV173 153-17321 A TTC CGG TGT ACT CAC CGG TTC6 HCV217 196-21722 A CAT TGA GCG GGT TGA TCC AAG A7 HCV243 223-24321 A CGT GGG GGC ACG CCC AAA TCT8 HCV279 257-27923 A GCC TTT CGC GAC CCA ACA CTA CT9 HCV313 293-31322 A GCA CTC GCA AGC ACC CTA TCA G10HCV363 341-36323 A GAG GTT TAG GAT TCG TGC TCA TG11HCV349 327-34923 A GTG CTC ATG GTG CAC GGT CTA CG12HCV373 351-37323 A GTT TTT CTT TGA GGT TTA GGA TT13HCV345 324-34522 A TCA TGG TGC ACG GTC TAC GAG A14HCV358 339-35820 A TTA GGA TTC GTG CTC ATG GT15HCV352 333-35220 A TTC GTG CTC ATG GTG CAC GG
2.根据权利要求书1中的寡核苷酸，其最佳序列为HCV363、HCV349、HCV279及HCV65。
3.根据权利要求书1中的寡核苷酸，经不同化学修饰后，可以用于治疗丙型肝炎及相关性疾病。
4.权利要求书3中的寡核苷酸的化学修饰物可以是硫代修饰、半乳糖修饰、亲脂性分子及pH敏靶向脂质体等修饰物。
5.权利要求4中经化学修饰后的寡核苷酸可以制成各种不同的剂型，通过不同的给药途经用于I、II、III及IV型丙型肝炎及其相关性疾病的治疗。
全文摘要
本发明是根据丙型肝炎病毒基因结构设计、合成的五种反义寡核苷酸,可用于抑制丙型肝炎病毒基因的表达。本发明采用丙型肝炎病毒基因5’非编码区调控荧光素酶基因在HepG2细胞中的瞬间表达系统及丙型肝炎病毒基因5’非编码区调控荧光素酶基因的转基因细胞模型HepG2.9706,对15条互补于丙型肝炎病毒5’非编码区及翻译起始区的反义寡核苷酸进行了活性筛选及评价,首次发现互补于丙型肝炎病毒基因5’末端特定功能区域的寡核苷酸HCV279、HCV349、HCV363、HCV65、HCV313及其化学修饰物在培养的转基因细胞模型中能有效地抑制丙型肝炎病毒基因的表达。故本发明涉及到针对丙型肝炎病毒的反义寡核苷酸的序列与结构及其成为治疗丙型肝炎病毒有关性疾病、减小丙型肝炎病毒相关性疾病危害性的新型药物。
文档编号C12N15/11GK1253138SQ98124388
公开日2000年5月17日 申请日期1998年11月9日 优先权日1998年11月9日
发明者王升启, 王小红, 朱宝珍 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所