专利名称：：原核分泌型表达载体及用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及重组DNA技术，更具体地涉及一种新的、通用的原核分泌型表达载体。本发明还涉及该新型表达载体的构建方法和用途。近年来，人们对大肠杆菌分泌型表达重组蛋白分子的生物技术越来越重视，并已成功地表达了几种活性的免疫分子。大肠杆菌分泌型表达的原理是将目的蛋白的编码序列融合到信号肽编码序列之后，表达产物在通过大肠杆菌细胞内膜分泌至胞周质(periplasmicspace)时，信号肽可被信号肽酶正确识别并切除。分泌后的外源蛋白不含N端甲硫氨酸，并已经空间折叠(包括形成二硫键)成具有天然构象的活性蛋白，无需后续的复性过程，从而简化了生产工艺。另外，蓄积在胞周质的外源蛋白避免了细胞内一些蛋白酶的降解，因而更加稳定。为了高效稳定地实现外源基因的表达和分泌，就需要选择合适的分泌型表达载体。虽然已有许多分泌型表达载体可供选择，但是这些载体大多或多或少地具有如下起点表达量不高、表达蛋白只有少部分被表达、载体的通用性差。因此，本领域迫切需要通用性好、表达量高、分泌效率高的表达载体。本发明的目的就是提供一种原核分泌型表达载体，它含有复制起点和标记基因，其特征在于，它还依次包括以下元件(1)控制外源基因转录的大肠杆菌的碱性磷酸酶启动子，(2)大肠杆菌耐热型肠毒素Ⅱ信号序列，(3)多克隆位点，(4)rrnB终止序列。本发明的另一目的是提供上述原核分泌型表达载体的用途，它被用于表达外源基因。较佳地，被表达的外源基因选自GM-CSF、IL-2、IL-11、IL-18。图1是本发明新颖的通用性原核分泌型表达载体pBPS9.0的结构图。图2是退火形成STⅡ信号序列和MCS序列时各片段的连接示意图。图3是载体pBV-STⅡ的结构图。图4是原核分泌型表达载体pBPS9.0的构建示意图。图5显示了原核分泌型表达载体pBPS9.0中的包含phoA启动子、STⅡ信号序列、MCS序列和rrnB的部分序列。图6是质粒PBluescriptⅡSK(+/-)的结构图。图7是原核分泌型表达载体pBPS9.0的酶切图谱。对于分泌型表达载体而言，通常启动子序列、信号序列、和终止序列等元件的选择至关重要。本发明的发明人经过多年研究，通过筛选，发现了可用于分泌型表达载体的最佳启动子和信号肽组合，即大肠杆菌的碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,phoA)启动子和大肠杆菌耐热型肠毒素Ⅱ(heat-stableenterotoxinⅡ,STⅡ)信号肽。在此基础上，构建了本发明的新颖的通用性原核分泌型表达载体。大肠杆菌的碱性磷酸酶(phoA)启动子是化学诱导性强启动子(ChangCetal.Gene,1986；44:121-125)，目前已经在分泌型表达外源蛋白中被选用。phoA位于细菌胞周质，参与细菌磷酸代谢，在外界磷酸盐供应充足时，phoA的合成受抑制；而在外界磷酸盐供应不足，达到一定的程度，就启动phoA系统来合成phoA。合成的phoA被跨膜运输到胞周质，因此phoA启动子十分易于调控。利用phoA的分泌型表达及其启动子的化学诱导性，将外源cDNA置于phoA启动子及其信号肽下游，可构建成原核分泌型表达载体。目前应用该类分泌型载体已成功表达了人生长激素(GrayGLetal.Gene,1985；39:247-254)、人表皮生长因子(OkaTetal.ProcNatlAcadSciUSA,1985；7212-7216)和α干扰素(MiyakeTetal.JBiochem,a985；97:1429-1436)，所表达的蛋白具有正确的氨基酸序列及生物学活性，但是此表达体系的不足之处是表达水平较低，往往不适合于大规模生产。大肠杆菌耐热型肠毒素Ⅱ(heat-stableenterotoxinⅡ,STⅡ)是产毒素性大肠杆菌产生的一种分泌型蛋白，其信号肽含23个氨基酸残基，成熟蛋白由48个氨基酸残基组成(PickenRetal.InfectImmunol,1983；42:269-275)，含有4个半胱氨酸(Cys)，可形成两对二硫键。研究表明只有形成正确的二硫键，STⅡ蛋白分子才被分泌到胞周质，这样就保证了蛋白分子构型的准确性。此外，以STⅡ作信号肽时表达率较高而且形成的蛋白分子绝大部分被分泌到胞周质，因此尽管STⅡ的表达调控机理还不十分明确，已有实验室将其作为信号肽来构建分泌型表达载体，以表达人源化的基因工程抗体(CaterPetal.Bio/technology,1992；10:163-167.ZhuZetal.Biotechnoplogy,1996；14:192-196)。在本发明中，STⅡ序列位于phoA启动子下游。为了使表达载体具有通用性，就必须使载体具有多克隆位点(multiplecloningsite，简称为“MCS”)(也称为“多克隆接头”)。目前现有的各种多克隆位点序列几乎都可用于本发明，例如在各种通用性载体(如pUC18)中的多克隆位点序列。可包含于多克隆位点的限制性内切酶酶切位点包括(但并不限于)MluⅠ、NsiⅠ、EcoRⅠ、KpnⅠ、SmaⅠ、BamHⅠ、SalⅠ等。为了提高表达效率，在多克隆位点中也可含有平末端类型的限制性内切酶的酶切位点，如SspⅠ、Bst1107Ⅰ、HpaⅠ、DraⅠ和EcoRV位点等。较佳地，MCS序列中宜含有MluⅠ位点。当外源基因可以经过通用位点上的MluⅠ与STⅡ信号肽序列融合时，可保证表达产物与天然序列完全一致。在表达外源基因时，外源基因被插入到该多克隆位点中。由于本发明的分泌型表达载体具有多克隆位点，因此在引入外源基因时具有极好的灵活性和通用性。在本发明中，紧接着STⅡ序列的下游是多克隆位点，这使得表达外源基因时，所表达的蛋白带有STⅡ信号肽。本发明的分泌型表达载体还含有终止序列。在本领域中已知众多终止序列元件几乎都可用于本发明。较佳地是原核生物的终止序列。在本发明的一个例子中选用了rrnB序列，该序列是强终止序列，而且还有稳定作用。至于复制起点ori和标记基因(如抗性基因)等元件，没有任何特别限制。比如，用于筛选的抗性基因可选用四环素抗性基因、新霉素抗性基因、或氨苄青霉素抗性基因等。通过合并phoA启动子、STⅡ信号肽序列、多克隆位点序列以及终止序列，本发明人获得了一种新颖的通用性原核分泌型表达载体。这种载体充分发挥了phoA启动子和STⅡ信号肽的优点并消除了各自的缺点，而且具有很高的通用性从而可高效稳定地分泌表达诸如hGM-CSF、IL-2等多种外源基因。利用该载体制备诸如GM-CSF、IL-2等外源蛋白时，具有产量高，下游纯化工作简便等突出优点。可用于本发明的宿主细胞宜为原核细胞，更佳地为大肠杆菌，最佳地为大肠杆菌K12的W3110菌株。在本发明的一个实例中，为了获得构建分泌型表达载体的几个构件，首先根据已知的phoA启动子的序列，合成用PCR引物，用PCR的方法从大肠杆菌XL-1Blue菌株的基因组DNA中克隆phoA启动子。根据STⅡ的序列和所选定的多克隆位点序列，采用化学合成的方法合成4个片断，然后退火连接形成了STⅡ全序列和多克隆位点序列(STⅡ-MCS序列)。再将该STⅡ-MCS序列克隆入pBV220载体(该载体带有rrnB终止序列)，形成质粒pBV-STⅡ。然后将适当酶切后的pBR322片段、phoA启动子序列和适当酶切后的pBV-STⅡ片段(含有STⅡ-MCS序列和rrnB终止序列)连接在一起，就形成了本发明的一种新颖的通用性分泌表达载体pBPS9.0。本发明新颖的原核分泌型表达载体可用于表达各种外源基因，其中包括(但并不限于)GM-CSF、IL-2、IL-11、IL-18等。以表达GM-CSF为例，可按常规方法将GM-CSF的编码序列克隆入本发明表达载体的多克隆位点，将形成的携带外源GM-CSF的质粒pBPS9.0/GM-CSF转化大肠杆菌(如菌株W3110)。对于筛选出的转化的宿主细胞，可在本领域惯常使用的培养条件下培养以表达GM-CSF，其中对培养基中的磷酸盐控制极为重要，合适的磷酸盐浓度既可使细菌生长至较高的浓度，同时也可使GM-CSF表达率也较高。当培养发酵时间一般为20-40小时，更佳地为24-36小时；pH可在5.8-7.8之间，更佳地为6.0-7.6之间时，GM-CSF均有较好的表达。最佳的发酵时间为28-32小时，pH值为6.5-7.2，此时可得到数倍于包含体表达法的产量。随后的纯化工艺设计可以充分利用分泌型表达的优点。以GM-CSF为例，在从大肠杆菌中提取GM-CSF时，可采用冻融低渗法，这样可在十分温和的方法下使GM-CSF释放出来。既有利于保持GM-CSF的活性，又有利于纯化。后续的纯化方法可以采用温和的纯化手段在温和的条件下完成。选用本领域中常规的纯化方法。以GM-CSF为例，在纯化方案中可使用了DEAE阴离子层析、苯基琼脂糖凝胶HP疏水层析、凝集过滤等液相色谱方法，经过合理组合，使整个纯化容易快速，最终得到的GM-CSF纯度大于98％。这一结果在进一步的鉴定中得到了证实。对于IL-2、IL-18等各种外源基因，也可用基本上类似于GM-CSF的方法进行克隆和表达。以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而并非用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1细菌碱性磷酸酶启动子(phoA)序列的克隆用PCR方法从XL-1Blue菌株的细菌基因组DNA中克隆phoA启动子。采用溶菌酶处理、SDS裂解、酚抽提和透析方法，从XL-1Blue细菌制备细菌基因组DNA，以其为模板进行PCR扩增。所用的上游引物为5′-GTGAATTCAACTTCTCCATACTTTGGATAAGGAAA-3′(含EcoRⅠ位点)，下游引物为5′-GTACTAGTTACAAATACATTAAAAAATAAAAA-3’(含SpeⅠ位点)。PCR产物经EcoRⅠ/SpeⅠ双酶切后，低融点胶回收备用。实施例2STⅡ信号序列和多克隆位点序列的化学合成1．化学合成STⅡSD序列及信号肽的设计如图2所示，设计如下4个小片段片段#15′-GATCCACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTATCTAGAGGTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAAT-3′片段#25′-ATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATTGCTACAAACGCGTATGCATGGAATTCGGTACCCGGGATCCG-3′片段#35′-TCGACGGATCCCGGGTACCGAATTCCATGCATACGCGTTTGTAGCAATAGAAAAAACGAACATAGATGCAAGAAGAAATG-3′片段#45′-CGATATTCTTTTTCATAAAATCACCTCAACCTCTAGATACCCTTTTTACGTGAACTTGCGTACTAGTG-3′正负链间有部分碱基互补，利于片段的正确连接，连成的完整片段包括翻译增强子、SD序列(GGTG)和STⅡ的23个氨基酸残基组成的完整信号肽编码序列。5’末端和3’末端分别为BamHⅠ和SalⅠ位点。信号肽的氨基酸序列为MetLysLysAsnIleAla-PheLeuLeuAlaSerMetPheValPheSerIleAlaThrAsnAlaTyrAla。2．寡核苷酸的合成与纯化用固相亚磷酰胺法合成，经PAGE纯化。3．连接取寡核苷酸片段(除5’端的2个片段)各0.2OD，于含T4多核苷酸激酶和ATP的20μl反应体系中，37℃温育1小时进行5′末端磷酸化；将磷酸化的小片段与未磷酸化的5’端两片段等摩尔混合，90℃退火，自然冷却至室温。然后将退火后的片段克隆人质粒pBluescriptⅡSK(+/-)(购自Stratagene公司)，形成质粒pSK-STⅡ。经测序验证，证明退火连接正确，且核苷酸序列正确。实施例3pBV-STⅡ质粒的构建在该实施例中，构建含有STⅡ-MCS序列和rrnB终止序列的质粒。提供rrnB序列的是质粒pBV220，这是一种已知的表达质粒。在该质粒中要表达的异源蛋白序列被置于PRPL启动子的下游，当热诱导时该PRPL启动子可使位于其下游蛋白序列表达(张智清等.病毒学报，1990；6:111-116)。已有报道表明，一些研究者已用pBV220质粒表达了一些细胞因子(智刚等．病毒学报，1991；7:142-147．周圆等.病毒学报，1993；9:37-42．张智清等。病毒学报，1988；4::165-66)。用BamHⅠ/SalⅠ双酶切实施例2中的质粒pSK-STⅡ，分离出含STⅡ-MCS序列的BamHⅠ/SalⅠ片段。然后将其克隆入质粒pBV220中，形成质粒pBV-STⅡ。pBV-STⅡ质粒的结构如图3所示，紧挨着STⅡ-MCS序列下游的就是rrnB终止序列。实施例4表达载体pBPS9.0的构建如图4所示，用EcoRⅠ/PvuⅠ双酶切质粒pBR322，然后分离出大片段。用SpeⅠ/PvuⅠ双酶切实施例3中获得的质粒pBV-STⅡ，然后分离小片段。将上述2种分离的片段与实施例1中获得的经EcoRⅠ/SpeⅠ双酶切后PCR产物(即两端分别为EcoRⅠ/SpeⅠ的phoA启动子序列片段)混合在一起，用连接酶连接过夜，从而构建成质粒pBPS9.0。质粒pBPS9.0的结构如图1所示。其酶切图谱如图7所示。实施例5克隆表达人GM-CSF人GM-CSFcDNA是从活化的中国健康成人外周血单个核细胞RT-PCR克隆的，其过程如下1．富含GM-CSFmRNA细胞的诱生经Ficoll-Paque梯度离心从正常成人外周血分离出单个核细胞，用Hanks缓冲液洗三遍后，置于含10μg/mlPHA(Sigma),10％小牛血清的RPMI1640完全培养基中(细胞浓度为1×106/ml)，在37℃,5％CO2中培养3天，然后在1000U/mlIL-2中连续培养14天，每3天换液一次，最后再用10μg/ml的PHA继续培养3天后，收获细胞。2．细胞mRNA的制备采用异硫氰酸胍一步法抽提细胞总RNA，经OligodT12柱纯化mRNA。3．反转录引物设计所用的引物可克隆到包括完整3’非编码区序列的GM-CSFcDNA。为了便于后续克隆，设计5’端含SalⅠ、EcoRⅠ位点的OligodT引物5’-GTGAATTCTCGAGCTCGTACGACCTTTTTTTTTTTTT-3’用于反转录。PCR扩增的上游引物为5’-CTGCAGCACCCGCCCGCTCGCCCAG-3’(含与NsiⅠ匹配的PstⅠ位点)，下游引物用反转录引物，扩增出的片段长约720bp。再设计一个下游引物5′-CGTCGACTTATCCTGGACTGGCTCCCAG-3′，该引物对应于天然GM-CSF的C末端的编码序列，但不含有终止序列，且该下游引物5′端含有SalⅠ酶切位点。用该下游引物与上述的上游引物对上述的约720bp的片段进行PCR扩增，获得两端带有PstⅠ和SalⅠ的GM-CSF编码序列。该GM-CSFPCR产物经PstⅠ酶切后，5’端的第二个GCA与STⅡ信号肽的最后一个氨基酸的编码DNA相连，从而编码人GM-CSF成熟蛋白的第一个氨基酸(Ala)，因此信号肽切除后分泌的GM-CSF氨基末端不含Met，而与天然GM-CSF相一致。将如上获得的GM-CSF编码序列克隆人质粒pBPS9.0的NsiⅠ和SalⅠ位点，形成质粒pBPS9.0-hGM-CSF。然后将该重组表达载体转入大肠杆菌W3110，建立人GM-CSF分泌型表达的工程菌W3110/pBPS9.0-hGM-CSF。4．种子培养保存的菌种，接种人含5μg/ml四环素的LB培养基中，250ml的培养基放人1L的培养瓶中，摇床中培养，培养温度30℃，转速为200rpm，培养时间为15小时，培养后OD600光吸收在2.5左右。发酵罐培养发酵培养基酪蛋白水解氨基酸10.0g/L酵母提取物2.0g/L葡萄糖2.5g/L(NH4)2SO45.0g/LNaH2PO4·2H2O1.3g/LK2HPO4·3H2O2.6g/L一水合柠檬酸三钠1.0g/LMgSO4·7H2O2.42g/L四环素5mg/l微量元素添加物FeCl3·6H2O16.90gZnSO4·7H2O2.88gMnSO·H2O1.69gCuSO4·5H2O2.50gCoCl2·6H2O2.38gH3BO30.62gNaMoO·2H2O2.42g上述物质溶于500ml0.1N的HCl中，过滤除菌。发酵过程补料葡萄糖100-200g/L上述培养基中蛋白胨、酵母提取物和(NH4)2SO4、NaH2PO4、K2HPO4、柠檬酸钠、MgSO4等盐类混合后，发酵罐中高压灭菌。用前无菌加入四环素终浓度为5mg/l，微量元素1ml/l，葡萄糖2.5g/l。发酵参数为培养温度30℃；pH值使用NH3H2O控制在6.9；罐压3.45×104Pa(5PSI)，通气量每升发酵培养基11/min；溶解氧控制在20％以上，可通过提高搅拌速率或通入纯氧来控制；搅拌速率起始为400rpm，以后与溶解氧参数级联控制。发酵时以2％的比例在发酵罐中无菌加入种子培养基，发酵3小时左右葡萄糖基本耗尽时，加入葡萄糖，加入速率根据细菌生长速率来调整。发酵过程中加入消泡剂Antifoam204(Sigma)消泡。发酵过程中不断监测细菌的生长状况，发酵30小时左右当细菌生长至OD600光吸收为130左右光密度不再增加时，使用Hitachi连续流离心机离心收集细菌，每升最终发酵培养物可得到约85-130g湿菌，冻存于-70℃保存备用。此外，在发酵过程中的不同时间取样，进行SDS-PAGE电泳分析，检测GM-CSF的表达量，发现在发酵30小时左右时的GM-CSF表达量最高(图5)。5．纯化GM-CSF的粗提粗提缓冲液为2mMEDTA,20mMPBpH7.4。粗提方法从-70℃取出菌体，按每克湿菌加入10ml上述缓冲液，悬浮细菌，放在4℃振荡1h，悬液经4℃,12000g,20min离心后收集上清，上清经5μm滤膜正压过滤后，即为GM-CSF提取液。离子交换层析层析介质为Pharmacia公司的DEAEFF阴离子交换填料，柱体积为7.5cm×6cm。柱子经缓冲液A(20mMPBpH7.4)充分平衡后，将GM-CSF粗提液以10ml/min流速上样，改用20ml/min流速，以20％缓冲液B(1MNaCl，20mMPBpH7.4)洗柱至280nm紫外吸收到基线，再以30％缓冲液B洗柱，收集洗脱蛋白峰。疏水层析填料为Pharmacia公司的Phenyl-SepharoseHP，柱体积为3.5×12cm。柱经平衡缓冲液A(1.5M(NH4)2SO4,20mMPBpH7.4)充分平衡。离子交换层析得到的组分中加入固体(NH4)2SO4，使其终浓度为1.5M，离心去沉淀后以5ml/min流速上样，改用10ml/min流速，以40％缓冲液B(20mMPBpH7.4)洗柱至280nm紫外吸收到基线，再作40-60％B线性梯度洗脱，收集GM-CSF活性蛋白峰。超滤浓缩把疏水层析得到的GM-CSF活性组份，在Minitan超滤器上用PTGC滤膜(MW10000)超滤浓缩至90-100ml。凝胶过滤填料为Pharmacia公司的Sephacry1S-200，柱体积为5cm×115cm。柱子先用缓冲液(100mMNaCl,20mMPBpH7.4)充分平衡后，将超滤浓缩样品上样层析，流速为60ml/h，收集GM-CSF活性蛋白峰。纯化后GM-CSF的鉴定对用上述方法纯化后的GM-CSF，用常规方法进行HPLC纯度测定，结果测得其纯度大于98％。纯化后GM-CSF比活性测定采用TF-1细胞、MTT测定细胞增殖的方法来测定GM-CSF的活性，标准参照品为Boehringer公司产品，所测的活性与GM-CSF的绝对量之比为比活性(单位为U/mg)，结果GM-CSF的比活性为1.0×108U/mg。在该实施例中，在优选条件下发酵结束时GM-CSF95％以上均分泌入大肠杆菌细胞周质，表达量占胞周质蛋白总量的40％,1L发酵液中GM-CSF的产量为350-500mg，这比迄今为至以包含体形式表达的GM-CSF产率高出近10倍。此外不必复性，所以工艺简便，而且获得的GM-CSF的活性很高。实施例6克隆表达人125Ser-rhIL-2按基本上类似于实施例5，用pBPS9.0来克隆表达125Ser-rhIL-2，不同点在于用125Ser-rhIL-2的编码序列代替GM-CSF的编码序列。按照中国专利申请No.98105441.2(1998年3月6日申请)所述的方法，获得125Ser-rhIL-2的编码序列。简而言之，该编码序列是这样获得的采用中国人外周血单个核细胞作为人白细胞介素2基因的来源，采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法获得编码125位为丝氨酸的白细胞介素2的cDNA(突变后的白细胞介素2cDNA序列经测序证实)。结果表明，形成的pBPS9.0-125Ser-rhIL-2可稳定高效地分泌表达125Ser-rhIL-2。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。权利要求1．一种原核分泌型表达载体，它含有复制起点和标记基因，其特征在于，它还依次包括以下元件(1)控制外源基因转录的大肠杆菌的碱性磷酸酶启动子，(2)大肠杆菌耐热型肠毒素Ⅱ信号序列，(3)多克隆位点，(4)rrnB终止序列。2．如权利要求1所述的载体，其特征在于，该标记基因选自四环素抗性基因和氨苄青霉素抗性基因，而且该多克隆位点含有MluⅠ位点。3．如权利要求1所述的载体，其特征在于，该载体是pBPS9.0，其结构如图1所示。4．如权利要求3所述的载体，其特征在于，该载体含有图5所示的核苷酸序列。5．如权利要求1所述的原核分泌型表达载体的用途，其特征在于，它被用于表达外源基因。6．如权利要求5所述的用途，其特征在于，该载体是pBPS9.0，其结构如图1所示。7．如权利要求5所述的用途，其特征在于，该外源基因选自GM-CSF、IL-2、IL-11、IL-18。全文摘要本发明公开了一种通用性的原核分泌型表达载体,它含有复制起点和标记基因。此外,它还依次包括以下元件:(1)控制外源基因转录的大肠杆菌的碱性磷酸酶启动子,(2)大肠杆菌耐热型肠毒素Ⅱ信号序列,(3)多克隆位点,和(4)rrnB终止序列。本发明还涉及该新型表达载体的构建方法和用途。该表达载体的通用性好、表达量高、分泌效率高,适用于高效稳定地分泌表达多种外源基因,如GM－CSF、IL－2等。文档编号C12N15/70GK1288952SQ9911688公开日2001年3月28日申请日期1999年9月16日优先权日1999年9月16日发明者曹雪涛,章卫平,陶群,鞠佃文申请人:上海华晨生物技术研究所