包含戊糖乳杆菌菌株的组合物及其用途的制作方法

专利名称：包含戊糖乳杆菌菌株的组合物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)益生菌菌株，包含该细菌的可食用组合物和药物组合物，以及该细菌的医学应用，用于促进健康，尤其是用于刺激免疫系统，对抗念珠菌病，总体上帮助消化，及缓解肠易激综合症(IBS)的症状。
背景技术：
健康肠内寄生微生物菌群包括寄居的有益细菌，主要是乳杆菌属(lactobacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)成员。感染、饮食改变、抗生素治疗和压力或生理创伤可打破微生物平衡。当此情况发生时可引发许多副反应。消化模式可被改变，出现腹泻、便秘和其他肠易激惹症状。免疫系统可被削弱，导致对感染性疾病的抵抗力降低。病原细菌或真菌可占领消化系统或身体其他部位并建群。
传统地，发酵奶产品如酸奶被认为是能够安抚消化系统的健康食品；此观察现在由乳酸菌的存在可以解释。可促进健康的微生物例如乳杆菌和双歧杆菌被称为“益生菌”。研究表明特定益生菌微生物可通过竞争排斥病原细菌和酵母影响肠道微生物群的组成。据称益生菌也可通过降低肠道通透性和提高局部肠道免疫反应促进例如奶过敏患者的肠道粘膜的愈合。益生菌被推荐用于预防和治疗腹泻和促进抗生素治疗后共生菌群的恢复。益生菌的临床实验还证实抗癌活性。
市场上的一些“活性”乳制品声称包含特别高数量的特定益生乳杆菌或双歧杆菌种用来促进消化和健康的免疫系统。然而，只有选定的几种菌株显示出所需益生效应的全部方面。另外，还必须记住的一点是菌株在胃肠道(GI)内的生存力对该菌株原位的生物学功效是关键的。为使菌株植入肠道并建立其自身的菌群，理想地其应粘附于胃肠道粘膜表面并能够穿过严酷的环境，例如暴露于胃酸和胆酸而存活。
本发明涉及新的益生乳杆菌菌株，称为戊糖乳杆菌LPK，其根据布达佩斯条约于2001年8月28日保藏在NCIMB，Aberdeen，英国，并接受保藏号NCIMB41114。除了显示乳杆菌通常的典型特征，该菌株还具有令人吃惊的特性它能够抑制念珠菌(Candida)的生长，且抑制程度是之前通过使用益生菌而从未达到的程度。进一步地，四环素和相关抗生素对该菌株的生长没有影响。这些特性的独特结合可用来对抗身体任何区域内不被期望的念珠菌的生长。尤其是，由于念珠菌被认为是肠易激综合症(IBS)的致病因素，可以预料到此戊糖乳杆菌新菌株可用来治疗或预防该疾病。
发明简述本发明一方面提供了具有保藏号NCIMB 41114的戊糖乳杆菌菌株。
本发明的第二方面提供了具有戊糖乳杆菌菌株NCIMB41114的所有鉴定特征的乳杆菌菌株的生物学纯培养物。
本发明的第三方面提供了包含戊糖乳杆菌菌株NCIMB41114的营养组合物或药物组合物。
本发明的第四方面提供了包含戊糖乳杆菌菌株NCIMB41114和抗生素的营养组合物或药物组合物或药盒。
本发明的另一方面提供了将戊糖乳杆菌菌株NCIMB41114作为药物的用途。
本发明的再一方面提供戊糖乳杆菌菌株NCIMB41114在生产药物或营养制品中的用途，所述药物或营养制品用于促进健康的肠道微生物菌群；和预防或治疗细菌或酵母感染；念珠菌病；腹泻或其他胃肠道失调；肠易激综合症或其症状；以及削弱的免疫系统。
本发明的另一方面提供分离乳酸菌的益生菌株的方法，包括在存在杀细菌水平的四环素时培养粪便细胞培养物，和自培养物收集存活的乳酸菌细胞；以及通过此方法获得的乳酸菌菌株。


图1显示白色念珠菌(Candida albicans)(■)和戊糖乳杆菌NCIMB41114(◆)的共培养生长，和相同条件下相同培养基内白色念珠菌(▲)的纯培养生长。
发明详述本申请的主题新的戊糖乳杆菌菌株从获自健康成年个体的粪便培养物中分离，并在四环素存在下培养。
两个不寻常且在意料之外的观察导致了本微生物的发现和分离。首先，在含有广谱抗生素四环素的培养基中本发明的乳杆菌菌株，且仅仅该细菌菌株得以存活并旺盛生长，而培养物中的其他所有乳酸菌均被四环素杀死。其次，尽管开始时念珠菌存在于大多数粪便培养物中，但该酵母菌的生长在本发明乳杆菌存在时停滞。反之，在缺乏本发明新菌株的粪便培养物中，念珠菌生长并独占四环素杀死细菌后留下的小生境。
本发明的新细菌和包含该细菌的组合物对健康通常有益，并为各年龄的人所良好地耐受。戊糖乳杆菌NCIMB 41114可预防地或治疗地用于健康人以防止较小的疾病例如胃不适，胃炎，胃溃疡，轻度腹泻(包括抗生素相关的腹泻)，不规则消化模式，胃灼热和其他消化道疾病。健康肠道微生物菌群促进、免疫刺激、癌症预防、骨骼生长刺激和胆固醇降低的效果也可使一般人群受益。本发明的新细菌尤其对住院患者，生活在疗养院的个体，免疫缺陷人群，抗生素治疗中的患者，以及婴儿，例如新生婴儿有益。例如，本发明的细菌也可用来产生与母乳喂养的婴儿的微生物菌群更相似的婴儿微生物菌群。
本发明的细菌也可用来靶向特定疾病状况，尤其是作为药物治疗的替代品或与药物治疗结合。例如，通过使用本发明的细菌可治疗或缓解婴儿腹泻(例如由轮状病毒引起)，霍乱，痢疾，和志贺氏菌(Shigella)、大肠杆菌(E.coli)0157H7、艰难梭菌(Clostridium difficile)和沙门氏菌(Salmonella)的感染。对于因任何原因(例如化疗后，白血病，HIV/AIDS等)引起免疫缺陷的人群，摄入戊糖乳杆菌NCIMB 41114是非常有用的预防或抑制致病微生物感染的防病和治疗方法。
由于戊糖乳杆菌LPK对四环素及相关抗生素有抵抗性，在使用抗生素治疗的过程中服用或应用此微生物而产生的益生性益处将继续存在。
该乳杆菌种较其他已知乳杆菌的主要益处是该菌株能够对抗酵母菌的过度生长，尤其是念珠菌感染。念珠菌感染一般会在特定类别的易感个体中遇到，所述个体包括生活在疗养院中的个体，免疫缺陷患者例如HIV阳性或AIDS患者，接受放疗、化疗和骨髓移植的患者，增加暴露于念珠菌的住院患者，新生婴儿，服用避孕药的妇女，和抗生素治疗当中的任何人。念珠菌病可由近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)，热带假丝酵母(Candida tropicalis)或光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)引起，但典型地由白色念珠菌(Candida albicans)引起。
白色念珠菌可感染口腔(鹅口疮)，泌尿道，阴道(Vaginal thrush或阴道炎)，食道，肠道和皮肤(例如尿布疹)，导致刺激、炎症和其他症状。这些感染通常通过使用抗真菌药剂被治愈。念珠菌过度生长在IBS中的作用也已被提出。IBS目前的疗法主要是旨在缓解症状的药物制品，而不针对引起疾病的原因。尽管益生菌的特定菌株据报道具有抗念珠菌活性，但活性的表现水平不足以高至引起胃肠学家产生较大兴趣将其作为可能的治疗性疗法。由于戊糖乳杆菌LPK，即菌株NCIMB 41114抑制念珠菌生长的惊人能力，本发明是治疗和预防念珠菌感染的突破性方法。
因此，在本发明一方面，施用有效量的戊糖乳杆菌菌株NCIMB 41114可以用于预防或治疗如下任何一种疾病的方法中细菌或酵母菌感染；念珠菌病，尤其是泌尿道感染，例如泌尿感染，鹅口疮；腹泻或其他胃肠失调；肠易激综合症或其症状；和削弱的免疫系统。本发明的新细菌也可被用于促进健康肠道微生物菌群的方法中。
本发明的一个实施方案提供了治疗或预防细菌或酵母菌感染，例如念珠菌感染、泌尿感染、鹅口疮、肠易激综合症(IBS)或其症状、腹泻或其他胃肠失调的方法，包括对需要此种治疗的对象施用有效量的包含活的、减毒的或杀死的戊糖乳杆菌菌株NCIMB 41114的组合物。
本发明的另一方面提供了促进健康肠道微生物菌群和刺激免疫系统的方法，包括对需要此种治疗的对象施用有效量的包含活的、减毒的或杀死的戊糖乳杆菌菌株NCIMB 41114的组合物。
本发明的包含戊糖乳杆菌NCIMB 41114的营养组合物或药物组合物可经肠，例如口服，肠外或通过与皮肤或粘膜的物理接触给药。本发明的营养或药物组合物可被直接给予肠道，例如通过管子或导管。
本发明的戊糖乳杆菌菌株可被大规模培养并以低压冻干的，冻干的或水化的形式治疗使用。本发明的新细菌也可以与可药用的载体物质或营养基质联合使用。
在药物制品的情况下，产品可以以片剂，胶囊，植入物，栓剂，阴道栓剂，例如阴道拴，粉末，溶液，胶体，液体细菌悬液等形式提供。缓释形式可能尤其可取。本发明的一个实施方案中，新戊糖乳杆菌菌株作为抗细菌抗生素(例如四环素)治疗疗程的辅助治疗被施用，以减少抗生素的危险性和副作用。为此可将抗生素和细菌共同配制于单一剂型中。或者，可在药盒形式中提供该细菌和抗生素用以分开、同时或相继施用。另一选择是共用戊糖乳杆菌NCIMB 41114和抗真菌剂，例如那些常规用于治疗念珠菌病的药物，包括氟康唑，伊曲康唑和克霉唑。这两种成分可以联合对抗真菌生长，并可以以单一剂型提供或以药盒形式提供以便分开、同时或相继施用。
当戊糖乳杆菌NCIMB 41114以营养物形式施用时，其可被加入任何食物或软饮料产品中，尤其是冷藏，冷冻或长保质期的乳制品例如奶，奶粉，酸奶，酸乳酒，冰淇淋，奶昔，干酪，奶油，凝乳，发酵奶，和基于奶的发酵产品，和豆制品，基于发酵谷物的产品，食物糊，烘焙品，全营养品，管子进食制品(tube feeding formuation)和婴儿配方制品。也可以以适于喂养动物，例如马和陪伴动物的可食用形式提供该细菌。
常常，优选在可发酵的基质例如奶，或含有淀粉的基质例如谷物粥上培养本发明的细菌菌株，然后在营养组合物例如食物或软饮料中使用发酵产物。
在营养组合物例如食物或软饮料制品中，除戊糖乳杆菌LPK外，该产品还可以包含选自脂肪，蛋白质，碳水化合物，纤维，矿物质和维生素中的一种或多种营养成分。由于纤维在消化调节中的重要性，在本发明的营养或药物产品中优选包括某种纤维。已知当益生菌与称为“益生素”成分的食用纤维物质一起提供时，益生细菌可以被刺激增殖。这在促进培养物在胃肠道的建群和保持培养物的活力方面具有优势，甚至在益生菌的摄入终止后也一样。因此，在本发明优选的实施方案中，可在单一常用剂型中共同施用本发明的益生菌与益生素物质，或作为药盒用于同时、分开或相继的施用。
尽管戊糖乳杆菌新菌株自身就能够产生健康的益处，但也可以共同施用该细菌与任何其他已知具有益生特性的细菌。
菌株优选以约105cfu/g至约1011cfu/g，优选约106至约1010cfu/g，最优选约107至约109cfu/g载体的量加入食物或药物载体中。优选该细菌菌株以活的形式施用，但消费前该细菌可被减毒或杀死。
典型地，施用至少104cfu/天本发明的菌株在临床上将有效。更优选的日剂量范围是106至1012cfu/天。最优选是107至1010cfu/天。
实施例实施例1戊糖乳杆菌菌株LPK(NCIMB 41114)的分离(i)连续培养系统三个恒化器平行设定每个保持在氮气中，37℃下，pH6.5和稀释速率0.066h-1。这些条件被设定以便与在人结肠远端区域中存在的典型条件相似。恒化器中加入的对照生长培养基包含(gl-1于蒸馏水中)酵母提取物2，蛋白胨水2.NaCl 0.1，K2HPO40.04，KH2PO40.04，MgSO4.7H2O 0.01，CaCl2.H2O 0.01，NaHCO32，Tween 80 2，氯高铁血红素0.05，维生素K1 0.01，半胱氨酸.HCl 0.5，胆盐0.5，葡萄糖0.4，淀粉3，果胶2和阿拉伯半乳聚糖1。培养基在121℃下高压灭菌30分钟，并在仍热时置于氮气中。培养基冷却后，1gl-1经过滤除菌的四环素或1gl-1经过滤除菌的制霉菌素在无菌条件下被加入培养基贮存容器中。没有加入抗微生物剂的对照恒化器也运行。
(ii)接种自健康志愿者(n＝6)获得新鲜排出的粪便样品并使用0.1moll-1磷酸盐缓冲液pH7(26)在无氧条件下制备10％(w/v)浆液。志愿者均没有任何胃肠疾病的病史并在研究前至少3个月避开抗生素。300ml的恒化器容器的一半装有培养基并在每个容器中加入150ml浆液。在培养基泵启动前将该系统放置24h进行平衡。对6个不同的粪便供体各重复3次进行试验。
(iii).微生物培养技术自各粪便浆液中取样用作接种体并在发酵系统达稳态时(164小时后)自各恒化器中取出1ml样品。然后以预还原的半浓度的蛋白胨水系列稀释(6倍)这些样品。将各稀释液分成三份铺于预还原(在37℃下，10％CO2，10％H2，80％CO2的无氧气氛中)的琼脂上，所述琼脂设计用于选择肠道细菌的主要群体Wilkins Chalgren(Oxoid)用于全部厌氧菌，Rogosa(Oxoid)用于乳杆菌，Beerens用于双岐杆菌，KVLB用于类菌体，强化梭菌琼脂(Oxoid)+新生霉素(novobocin)8mg/l和colostin 8mg/l用于梭菌，和Azide琼脂(Oxoid)用于革兰氏阳性球菌。然后将各稀释物在有氧条件下铺于Nutrient Agar(Oxoid)上来选择全部需氧菌，而沙氏葡萄糖琼脂+氯霉素和环己亚胺用于选择酵母菌，MacConkey琼脂No.3(Oxoid)用于选择大肠菌，琼脂板在37℃孵育。孵育24-48h后计数有氧菌菌落，孵育48-72h后计数厌氧板。通过革兰氏染色从平板上挑出不同形态的菌落，显微镜检和进行表型(生化)表征以确定培养物的身份。
结果对照恒化器中，所用六个接种体中的优势肠道微生物的数量在达稳态条件后保持不变。这肯定了使用的生长培养基对于在连续培养试验中维持这些群体是有效的。因此，抗生素暴露导致的任何分布差异事实是由于这些附加物而非试验差异引起。在6个志愿者其中4个的粪便样品中检测到酵母菌。
较对照组，四环素的作用是显著减少所有被测细菌的菌群，由此肯定了其广谱活性。一个有趣的观察是，与对照恒化器的水平相比，四环素的作用允许酵母菌在发酵系统中增加。这对四环素的使用及相关的酵母过度生长危险具有临床提示。实际上，在此处使用的接种体之一中，酵母开始未被检测到，而在四环素恒化器发酵过程中被富集。
如所预料，酵母菌在制霉菌素恒化器中被抑制。然而，某些细菌属也受影响。主要地，这涉及乳杆菌的减少，该菌是通常被视为对胃肠健康重要的益生微生物。明显的指示是制霉菌素的使用无助于维持本来的益生菌水平。
在四环素恒化器实验中，其中一轮产生意外的结果。实验开始时存在酵母，但与通常观察到的趋势不同，酵母没有进一步生长。相反一种革兰氏阳性杆菌占优势，而且没有检测到其它细胞类型。因此进行基因型的工作以鉴定该微生物。
(iv)16S rRNA的分离和扩增使用InstaGene Matrix(Biorad，HemelHempstead，Hertfordshire，UK)根据生产商说明自乳杆菌提取总DNA。随后使用16S rRNA基因3’和5’末端附近的保守引物通过PCR扩增该基因。扩增的片段相应于大肠杆菌16S rRNA基因的位置～30到～1500。50μl终体积中的反应混合物包含扩增引物，预混合的三磷酸脱氧核苷，MgCl2，模板和预循环阶段后加入的Taq DNA聚合酶，在预循环阶段混合物被加热至96℃ 4分钟，然后置于0℃。PCR扩增的条件是95℃ 1分钟，55℃1分钟和72℃ 1.5分钟循环30次。终循环后，反应在72℃下延伸10分钟，然后置于10℃。在1x TAE(40mM Tris-醋酸盐，1m mol l-1EDTA)中通过含有溴化乙锭(0.5μg ml-1)的1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳显示扩增产物。使用QIA-quick PCR纯化药盒(QIAgen，Crawley，West Sussex，UK)根据生产商说明纯化显示出相应于正确大小的产物(对于引物pA-pH为1500碱基对)的带的反应产物。
(v)rRNA测序为PCR产物的测序，使用dRhodamine终止循环测序药盒(PE Applied Biosystems，Inc.，Foster City California，USA)和377型自动DNA测序仪(PE Applied Biosystems，Inc.，Foster City California，USA)靶向rRNA的5’末端近侧的约1500个核苷酸。使用FASTA程序和Ribosomal Database Project(RDP)比较产生的序列和GenBank/EMBL数据库提供的16S rRNA基因序列，产生与其他细菌物种的同一性百分比分数。
结果该基因的1600个碱基中，约1500个被测序，并显示该生物体是系统发生上相似的戊糖乳杆菌和植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)的近亲。
随后根据布达佩斯条约于2001年8月28日在NCIMB，Aberdeen，英国将戊糖乳杆菌LPK保藏，保藏号为NCIMB41114。
实施例2分离的乳杆菌和白色念珠菌之间的相互作用实验1自恒化器分离白色念珠菌和乳杆菌，并在沙氏葡糖培养液(Oxoid)和MRS培养液(Oxoid)中分别生长过夜。然后各取1ml接种于包含以下培养基成分(gl-1，蒸馏水中)的750ml分批发酵罐中酵母提取物2，蛋白胨水2，NaCl 0.1，K2HPO40.04，KH2PO40.04，MgSO4.7H2O 0.01，CaCl2.H2O 0.01，NaHCO32，Tween 80 2，半胱氨酸.HCl 0.5，和葡萄糖1.0。在121℃下高压灭菌该培养基30分钟，并在仍很热时置于氮气中。共培养发酵在无氧条件37℃，pH6.5下维持。48h过程中定期取样，并在显微镜下计数细胞数。结合表型和生化性状确定培养物身份。在发酵末，自发酵罐中取1ml，系列稀释并铺于MRS和沙氏葡糖琼脂上，在无氧条件下孵育48h。
实验2白色念珠菌和分离的乳杆菌在沙氏葡糖培养液和MRS培养液中分别生长过夜。铺6个均匀厚度的MRS琼脂(2％w/v)板，并在无氧条件下还原。随后将该分离的乳杆菌培养物划线培养于各板上。在50℃下维持7ml沙氏葡糖琼脂(0.7％w/v)，并接种50μl白色念珠菌培养物。然后将培养物均匀倒在乳杆菌培养物划线的板上。在37℃无氧条件下孵育该板48h并检查抑制区。两个试验均重复6次。
(除非说明，所有化学物质均购于Sigma Chemical Co.)在实验1中，新的此乳杆菌菌株生长良好并抑制念珠菌的生长，将其限制在接种水平(图1)。在实验2中，在乳杆菌菌落上方有念珠菌不能生长的大的抑制区(数据未显示)。该菌株在抗微生物剂攻击下的抵抗力和其对念珠菌属种(Candida spp.)强大的拮抗作用对于在治疗例如IBS等疾病中肠道功能的可能保持是适用的。
基于这些实验，可预期该微生物可用作酵母相关疾病例如鹅口疮或IBS的常规疗法的辅助或替代疗法。
权利要求
1.保藏号为NCIMB 41114的乳杆菌菌株。
2.具有戊糖乳杆菌菌株NCIMB 41114的所有鉴定特征的乳杆菌菌株的生物学纯培养物。
3.营养或药物组合物，其包含活的、减毒的或杀死的戊糖乳杆菌菌株NCIMB 41114和常规的载体。
4.权利要求3的组合物，其中，每克组合物包含105至1011cfu戊糖乳杆菌菌株NCIMB 41114。
5.权利要求3或权利要求4的药物组合物，其为片剂，胶囊，植入物，栓剂，阴道栓剂，粉末，溶液，凝胶或液体细菌悬液的形式。
6.包含戊糖乳杆菌菌株NCIMB 41114和抗生素的营养或药物组合物或药盒。
7.权利要求6的药物组合物或药盒，其中抗生素是四环素或相关抗生素。
8.权利要求6的药物组合物或药盒，其中抗生素是抗真菌剂。
9.权利要求3至8的任一项的组合物，其日剂量提供106到1012cfu的戊糖乳杆菌菌株NCIMB 41114。
10.戊糖乳杆菌菌株NCIMB 41114作为药物的用途。
11.戊糖乳杆菌菌株NCIMB 41114在生产用于预防或治疗细菌或酵母感染的药物或营养制品中的用途。
12.戊糖乳杆菌菌株NCIMB 41114在生产用于预防或治疗念珠菌病的药物或营养制品中的用途。
13.戊糖乳杆菌菌株NCIMB 41114在生产用于促进健康肠道微生物菌群和预防或治疗肠易激综合症或其症状的药物或营养制品中的用途。
14.戊糖乳杆菌菌株NCIMB 41114在生产用于预防或治疗腹泻或其它胃肠失调的药物或营养制品中的用途。
15.戊糖乳杆菌菌株NCIMB 41114在生产用于刺激允疫系统的药物或营养制品中的用途。
16.分离乳酸菌的益生菌株的方法，包括在存在杀细菌水平的四环素时培养粪细胞培养物，并自该培养物收集存活的乳酸菌细胞。
17.通过权利要求16的方法获得的乳酸菌菌株。
全文摘要
称为戊糖乳杆菌NCIMB41114的新益生菌菌株能够阻止胃肠道内病原微生物的生长。该细菌尤其抑制念珠菌的过度生长，并可用来预防和治疗相关疾病，包括IBS和鹅口疮。
文档编号A61P31/04GK1568365SQ02820204
公开日2005年1月19日 申请日期2002年10月11日 优先权日2001年10月12日
发明者A·G·温内, G·R·吉布森, J·布罗斯托夫 申请人:雷丁大学