专利名称：一种融合蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种融合蛋白及其编码基因与应用，特别涉及一种融合蛋白及其编码基因与在制备治疗新生血管异常生长引起的疾病的药物中的应用。
背景技术：
科学研究发现，肿瘤的生长和转移是依赖于人体内新生血管的。血管新生即形成新的毛细血管是体内一种非常重要的过程。它不仅涉及再生、创伤愈合等生理过程，还参与糖尿病、视网膜病变、风湿性关节炎和肿瘤生长与侵袭等病理过程。新生血管的形成为肿瘤细胞的迁移和实体瘤体积增大提供了营养和通道(Folkman，J.，1995，Nat.Med.1，27-31；Folkman，J.，1992，Exs.61，4-13；Battegay，E.J.，1995，J.Mol.Med.73，333-346；Bicknell，R.，and Harris，A.L.，1996，Curr.Opin.Oncol.8，60-65)。
因此，如何有效的截断肿瘤的血供、抑制新生血管，已经成为肿瘤治疗及防止肿瘤扩散的研究方向。
90年代以来，人们相继发现一些血管生成因子抑制剂。其中的血管生长抑素(Angiostatin)和内皮生长抑素(Endostatin)，分别是纤维蛋白溶酶原和胶原蛋白X VIII的片段(O’Reilly，M.S.，Holmgren，L.，Shing，Y.，Folkman，J.，1994，Cell.79315；O’Reilly，M.S.，Boehm，T.，Shing，Y.，Folkman，J.，1997，Cell.88277)。近来，血纤溶酶原(Plasminogen)的kringle 5(K5)蛋白片段被证明对内皮细胞的增殖和迁移有很强的抑制作用(Cao，Y.，Ji，R.W.，DavidsonD.，Folkman，J.，1996，J.Biol.Chem.27129461；Ji，W.R.，Barrientos，L.G.，Trail，P.A.，1998，BBRC 247，414-419)。血管生成因子抑制剂的发现，使得人们从干预血管生成方面着手，治疗由于新生血管异常生成引起的疾病成为可能。
血管形成因子抑制剂对实体瘤的治疗前景尤为引人注目。目前为止，还没有一种有效的治疗实体肿瘤的药物。因为化疗法直接作用于癌细胞本身，所以大部分化学疗法都伴有较明显的副作用。而血管形成抑制疗法直接作用于内皮细胞，由于内皮细胞遗传上的稳定性，同源性和低突变，因而减轻或消除了药物反应(Boehm，T.，Folkman，J.，Browder，T.，O’Reilly，M.S.，1997，Nature 390，404-407)。医学研究证明实体瘤的血管生成能力特别旺盛，因而与正常机体争夺营养(Molema，Grietje；Griffioen，Arjan W.，1998，Immunology Today 19(9)，392-394)。如能抑制新生血管的生成，就能有效的抑制肿瘤生长，并导致肿瘤死亡。这就使医学从抑制血管的生成来治疗肿瘤的途径成为可能。动物实验的结果已经显示出这样的前景(Molema，Grietje；Griffioen，Arjan W.，1998，Immunology Today 19(9)，392-394)。因此，把血管生成抑制剂作为治疗肿瘤的新药来开发，已成为医药界的热点之一。
恶性肿瘤最本质的特征是侵袭和转移，侵袭是贯穿肿瘤转移全过程的重要步骤。侵袭涉及到粘附即肿瘤细胞通过膜表面的受体与基底膜、基质成分层粘连蛋白、纤粘连蛋白和胶原蛋白结合；还涉及到肿瘤细胞分泌或利用包括金属蛋白酶在内的多种蛋白酶降解基底膜和基质。抑制金属蛋白酶一直是肿瘤治疗中比较常用的靶点。采用基因工程方法可以将具有不同机制的抗血管生成抑制剂组合在一起，二者联合达到早期抑制移植瘤的功效。目前，构建双功能嵌合分子正成为抗血管生成研究的新动向(Veenendaal LM，Jin H，Ran S.Proc Nacl Acad Sic USA，2002，997866-7871)。
发明创造内容本发明的目的是提供一种融合蛋白及其编码基因。
本发明所提供的融合蛋白，名称为FK5，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。
序列表中序列2的氨基酸残基序列是由102个氨基酸残基组成的蛋白质。
一种融合蛋白编码基因，名称为FK5是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有95％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列1中的DNA序列由306个碱基组成。
含有本发明基因的表达载体及细胞系均属于本发明的保护范围。
扩增该融合蛋白编码基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
该蛋白同时具有抑制增殖和迁移的双重功效，比单一的任何一种将具有更好的疗效。细胞实验证明，本发明的融合蛋白可有效地抑制血管内皮细胞的增殖，从而抑制血管的新生，进一步可抑制肿瘤生长；该融合蛋白可用于制备治疗新生血管异常生成引起的疾病(如肿瘤)的药物，具有广阔的工业应用前景。
图1为重组质粒pPIC9K-FK5的转化菌培养液的上清液电泳图谱图2融合蛋白FK5抑制人脐静脉内皮细胞实验结果具体实施方式
实施例1、融合蛋白FK5的表达1、融合蛋白编码基因的合成和表达载体的构建以5’-cttcctcgagatgtgtacaactcactggggtttcacactttgcaaaagagatgtagagac和3’-tagcgaattcgcaaagtgtgaaaccccagtgagttgtacattatcaggcacactgagg为引物，以Kringle-PET21b载体为模板(Intravitreal injection of plasminogen kringle 5，an endogenous angiogenic inhibitor，arrests retinal neovascularization inrats.Zhang D；Kaufman PL；Gao G；Saunders RA；Ma JX Diabetologia，2001Jun，44(6)757-65)进行PCR扩增，将人工合成编码CTTHWGFTLC十肽的DNA序列(序列表中的序列3)连接到K5的N端编码基因(序列表中的序列4)上。所采用的PCR条件为94℃30秒55℃30秒72℃1分钟。所获得的PCR产物两端具有XhoI和EcoRI限制性内切酶位点，利用XhoI和EcoRI的酶切位点，按照常规方法将通过PCR合成的融合DNA序列连接入高效表达质粒pPIC9K(购自美国Invitrogen公司)，得到重组质粒pPIC9K-FK5。经过常规方法测序，证明融合DNA序列(序列表中的序列1)正确。
2、融合蛋白FK5的表达将重组质粒pPIC9K-FK5用SacI线性化，采用浙江新芝公司电基因导入仪，将线性化的重组质粒pPIC9K-FK5导入GS115毕赤酵母菌(购自Invitrogen公司)内，经培养，挑选，His+和G418筛选，获得抗G418 2mg/ml的单克隆菌。挑选单克隆菌，接种于5ml YPD培养基中，30℃过夜，然后转入250ml BMGY培养基中，继续培养至OD600＝2-3，收集菌体，用无碳源BMMY培养基稀释至OD600＝1，继续培养，每隔24小时加甲醇一次，加入甲醇至终浓度为0.5％诱导表达，至96小时。离心取上清液。取10ul上清液，用10％tricin SDS-PAGE电泳，并经考马斯亮兰染色。结果如图1所示，在11KD的位置，融合蛋白的分子量为11KD，这表明该菌株在甲醇诱导下，可以表达FK5。图1中，泳道1为重组质粒pPIC9K-FK5的转化菌培养液的上清液电泳结果，泳道2为分子量标准。
3、融合蛋白的纯化将上清液按照常规方法，经硫酸铵沉淀和Phenyl Sepharose 6 Fast Flow和DEAE Sepharose柱层析进行纯化，获得纯化的FK5。经验证，经上述纯化的FK5的纯度95％。
实施例2、融合蛋白FK5抑制人脐静脉内皮细胞实验材料人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购自北大医院肿瘤研究所；MTT购自Amresco公司；细胞培养液1640购自GIBCO公司；小牛血清来自BIO WHITTAKER公司。
人脐静脉内皮细胞株在1640，10％FBS培养基中，37℃培养1天。将培养好的细胞按105个均等转移至12孔细胞板中，每孔1ml培养基，37℃下继续培养一天，然后更换为0.5ml 5％FBS的1640，分别加入实施例1中纯化的FK5使其终浓度分别为10ug/ml、20ug/ml、40ug/ml，同时分别设加入相同浓度的天然的K5和bk5对照，以及0.02M的磷酸盐缓冲溶液对照和未加任何形式的K5的人脐静脉内皮细胞株培养物作为空白对照。其中，先将FK5，nk5和bk5用0.02M的磷酸盐缓冲溶液溶解，再加入上述培养基中。处理半小时，补加0.5ml 5％FBS的1640，培养3天后每孔加入100ml 5mg/ml MTT，4小时后吸干培养基加入2ml无水乙醇，570nm检测紫外吸收情况。结果如图2所示，融合蛋白FK5具有更好的抑制内皮细胞增殖的作用其抑制效果，其抑制效率比天然k5提高15％左右。图2中，ck为未加FK5的空白对照；pbs为FK5，nk5和bk5的溶解缓冲液-磷酸盐缓冲液，设为对照；nk5为天然的k5(Intravitreal·injection of plasminogen kringle 5，an endogenous angiogenicinhibitor，arrests retinal neovascularization in rats.Zhang D；Kaufman PL；Gao G；Saunders RA；Ma JX Diabetologia，2001 Jun，44(6)757-65)。bk5为K5突变体(在天然K5的氨基酸序列中，去除了首尾的两个半胱氨酸，突变掉了自氮端的第3个半胱氨酸为苯丙氨酸)；rk5为本发明的融合蛋白FK5。
序列表<160>4<210>1<211>306<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1tgtacaactc actggggttt cacactttgc aaaagagatg tagagactcc ttccgaagaa 60gactgtatgt ttgggaatgg gaaaggatac cgaggcaaga gggcaaccac tgttactggg120acgccatgcc aggactgggc tgcccaggag ccccatagac acagcatttt cactccagag180acaaatccac gggcgggtct ggaaaaaaat tactgccgta accctgatgg tgatgtaggt240ggtccctggt gctacacgac aaatccaaga aaactttacg actactgtga tgtccctcag300tgtgcc 306<210>2<211>102<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>2Cys Thr Thr His Trp Gly Phe Thr Leu Cys Lys Arg Asp Val Glu Thr1 5 10 15Pro Ser Glu Glu Asp Cys Met Phe Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly20 25 30Lys Arg Ala Thr Thr Val Thr Gly Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala35 40 45
Gln Glu Pro His Arg His Ser Ile Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg50 55 60Ala Gly Leu Glu Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly65 70 75 80Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asn Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys85 90 95Asp Val Pro Gln Cys Ala100<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3tgtacaactc actggggttt cacactttgc 30<210>4<211>276<212>DNA<213>人属人(Homo sapiens)<400>4ccagatgtag agactctttc cgaagaagac tgtatgtttg ggaatgggaa aggataccga 60ggcaagaggg cgaccactgt tactgggacg ccatgccagg actgggctgc ccaggagccc120catagacaca gcattttcac tccagagaca aatccacggg cgggtctgga aaaaaattac180tgccgtaacc ctgatggtga tgtaggtggt ccctggtgct acacgacaaa tccaagaaaa240ctttacgact actgtgatgt ccctcagtgt gcggcc 27权利要求
1.一种融合蛋白，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于所述融合蛋白是序列表中的SEQID №2。
3.一种融合蛋白编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有95％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述融合蛋白编码基因是序列表中的SEQ ID №1。
5.含有权利要求3所述基因的表达载体。
6.含有权利要求3所述基因的细胞系。
7.扩增权利要求3所述基因任一片段的引物对。
8.权利要求1所述融合蛋白在制备治疗新生血管不正常生长引起的疾病的药物中的应用。
9.权利要求1所述融合蛋白在制备治疗肿瘤药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种融合蛋白及其编码基因与应用，其目的是提供一种融合蛋白及其编码基因与在制备治疗新生血管异常生成引起的疾病的药物中的应用。该融合蛋白，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID№2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。细胞实验证明，本发明的融合蛋白可有效地抑制血管内皮细胞的增殖，从而抑制血管的新生，进一步可抑制肿瘤生长；该融合蛋白可用于制备治疗新生血管异常生成引起的疾病(如肿瘤)的药物，具有广阔的工业应用前景。
文档编号A61P35/00GK1666997SQ200410006549
公开日2005年9月14日 申请日期2004年3月8日 优先权日2004年3月8日
发明者顾军, 邹宇飞 申请人:北京大学