专利名称：一种内酯单体化合物及其在制备治疗抗癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗癌药物，具体地说是以番荔枝种子为原料提取的一种番荔枝内酯单体化合物及其在制备治疗抗癌药物中的应用。
背景技术：
癌症是危害人类健康的大敌。我国每年新发癌症病例约有160万人，每年死于癌症的约有130万人，全国因癌症而死亡的人数逐年上升，我国为肝癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌等癌症的高发区域，癌症死亡率居高不下。
目前尚无有效的药物治愈大多数癌症患者。化疗药物对癌症虽有一定疗效，但毒副作用大，中成药对癌症的疗效普遍较低，如参莲胶曩对肺、胃癌的癌灶缓解率仅为3.5％，疗效均不理想。
本发明人研究了番荔枝(Annona squamosa Linn)的树皮、枝叶、种子的抗癌有效物质和化学成分，从中提取出多种抗癌单体化合物(活性成分)，经抗癌实验研究表明，对人肝癌细胞、人胃癌细胞、人食管癌细胞和动物移植性肿瘤(如S180、H22和Heps)均有显著的体外和体内抗癌治疗效果，并已申请获得3项抗癌产品发明专利证书(专利号分别为ZL02148474.0、ZL02148475.9、ZL03112707.X)。在上述研究的基础上，本发明人继续提取分离、筛选番荔枝(Annona squamosa Linn)种子的抗癌有效化学成分，从中又发明了4种内酯单体成分具有特别显著抗癌活性的抗癌用途(其抗癌活性数倍高于化疗药5-氟脲嘧啶)。
发明内容
1、发明目的本发明的目的是提供一种抗癌活性高、抗癌谱广的抗癌单体化合物，具体地说是以番荔枝种子为原料提取的一种番荔枝内酯单体化合物(annonareticin)在制备抗癌药物方面的应用。
2、技术方案本发明从番荔枝(Annona squamosa Linn)种子提取分离到一种抗癌药物番荔枝内酯单体化合物(经资料查阅目前还没有文献报道该化合物有抗癌活性)，其特征是白色粉末状物质，易溶于乙酸乙酯、甲醇、氯仿等有机溶剂。其鉴定为annonareticin，化学结构式如下
一种抗癌药物番荔枝内酯单体化合物，它是从番荔枝种子中提取得到的抗癌单体化合物。其制备方法是番荔枝种子风干后，粉碎成粗粉，先用10倍量石油醚冷浸提取3次(室温)，每次2天；回收石油醚得红色油状液体，室温放置，底部有大量白色沉淀析出，过滤出白色沉淀，白色沉淀经多次硅胶柱层析；用石油醚，石油醚-乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，得到一种番荔枝内酯单体化合物(annonareticin)。经体内外抗癌药理实验，其对人肝癌细胞、小鼠移植性肝癌的生长有明显的抑制作用，其抗癌活性数倍高于化疗药5-氟脲嘧啶。
本发明涉及一种抗癌药物番荔枝内酯单体化合物(annonareticin)在制备抗癌药物中的应用。
采用MTT显色法，取2×104/ml活细胞(人肝癌细胞SMMC-7721或HepG2)接种于96孔板，每孔90ul，设四复孔。待细胞贴壁后分别加入不同浓度的药物10ul，对照孔加入10ulPBS，置37℃、5％CO2条件下培养至预定时间，每孔加浓度为1mg/ml的MTT50ul/孔，继续培养4小时，去全部上清，加DMSO100ul/孔，微型振荡器振荡5min使结晶完全溶解，用酶联仪，于570nm波长处测定吸光度值(OD)，调零孔只含有培养液。细胞活力用加药细胞平均吸光度值/对照细胞平均吸光度值×100％，抑制率(％)＝(1-加药细胞平均吸光度值/对照细胞平均吸光度值)×100％。
结果显示，抗癌药物番荔枝内酯单体化合物(annonareticin)对人肝癌细胞的抑制活性非常高，其对人肝癌细胞的抑制活性数倍高于化疗药5-氟脲嘧啶(5-Fu)。
3、有益效果本发明的一种抗癌药物番荔枝内酯单体化合物，它是从番荔枝种子中提取得到的抗癌单体化合物。抗癌实验结果显示，抗癌药物番荔枝内酯单体化合物(annonareticin)对癌中之王——肝癌的抑制活性非常高，其对肝癌的体内抑制活性数倍高于化疗药5-氟脲嘧啶(5-Fu)。这为提高抗癌临床疗效提供了非常有前景的高效预选药物。
具体实施例方式
实施例1一种抗癌药物番荔枝内酯单体化合物(annonareticin)提取方法一种抗癌药物番荔枝内酯单体化合物，它是从番荔枝种子中提取得到的抗癌单体化合物。其制备方法是番荔枝种子风干后，粉碎成粗粉，先用10倍量石油醚冷浸提取3次(室温)，每次2天；回收石油醚得红色油状液体，室温放置，底部有大量白色沉淀析出，过滤出白色沉淀，白色沉淀经多次硅胶柱层析；用石油醚，石油醚-乙酸乙酯，乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，得到一种番荔枝内酯单体化合物(annonareticin)。
实施例2一种抗癌药物番荔枝内酯单体化合物，其特征是白色粉末状物质，易溶于乙酸乙酯、甲醇、氯仿等有机溶剂。其鉴定为annonareticin，分子式为C37H66O7，化学结构式如下 实施例3一种番荔枝内酯单体化合物(annonareticin)对人肝癌细胞的抑制作用1、细胞培养SMMC-7721或HepG2细胞株接种于培养瓶中，加入RPMI-1640培养液(含10％小牛血清、青霉素100u/ml、链霉素100ug/ml)，于37℃、5％CO2培养箱中培养，细胞呈单层贴壁生长，每3～5天传代一次，传代时用0.25％胰酶消化3min，以培养液吹打制成细胞悬液后接种。
2、药物处理取对数生长期的细胞按2×105/ml接种于细胞培养瓶中，待细胞完全贴壁(约4小时)后，再换加含药物的培养液，培养至预定时间。实验药物是经化学结构鉴定的一种番荔枝内酯单体化合物(annonareticin)；对照药物是5-氟脲嘧啶(5-Fu)。
2、实验方法采用MTT显色法，取2×104/ml活细胞接种于96孔板，每孔90ul，设四复孔。待细胞贴壁后分别加入不同浓度的药物10ul，对照孔加入10ulPBS，置37℃、5％CO2条件下培养至预定时间，每孔加浓度为1mg/ml的MTT 50ul/孔，继续培养4小时，去全部上清，加DMSO100ul/孔，微型振荡器振荡5min使结晶完全溶解，用酶联仪，于570nm波长处测定吸光度值(OD)，调零孔只含有培养液。细胞活力用加药细胞平均吸光度值/对照细胞平均吸光度值×100％，抑制率(％)＝(1-加药细胞平均吸光度值/对照细胞平均吸光度值)×100％。
3、实验结果结果如表1、表2显示，随着内酯单体化合物(annonareticin)浓度的升高，对人肝癌细胞的抑制率也升高，其对人肝癌细胞的抑制活性数倍高于化疗药5-氟脲嘧啶(5-Fu)。
表1 annonareticin对SMMC-7721肝癌细胞生长的抑制作用(n＝9)
*P＜0.05，**P＜0.01与对照组比较表2 annonareticin对HepG2肝癌细胞生长的抑制作用(n＝9)
*P＜0.05，**P＜0.01与对照组比较实施例4一种番荔枝内酯单体化合物(annonareticin)对移植性肝癌的抑制作用1、实验动物和瘤株雄性健康昆明种小鼠体重，18-22g，鼠龄6-8周，来自本校动物实验中心，昆明鼠传代腹水型鼠肝癌Heps瘤株均购自江苏省肿瘤研究所动物实验中心。小鼠在南京中医药大学动物实验中心的动物实验房饲养，温度21～25℃，湿度为45％～55％。
2、造模(移植性肝癌Heps)昆明种雄性小白鼠60只，按比例随机留10只为阴性对照组，其余50只进行造模。无菌抽取接种Heps瘤种8天的小鼠的腹水，以生理盐水稀释10倍，0.02％伊红染色，滴加到细胞计数板上计数后，调细胞浓度至1×107/ml，迅速地分别将50只小鼠右腋皮肤消毒，
盐酸水溶液浓度氨水溶液pH值装柱比例1、0.15％ 1、pH＝81、1∶152、0.20％ 2、pH＝92、1∶203、0.25％ 3、pH＝10 3、1∶25由以上实验方案得出植物福建马尾杉中含有一定量的石杉碱甲成份，该工艺符合中药标准提取物石杉碱甲的提取工艺路线。因此从福建马尾杉中分离石杉碱甲的收率在4/10万到11/10万之间。因此福建马尾杉也可以作为提取石杉碱甲成份的原料。
因此本发明采用伸筋草、柳杉、福建马尾杉三种植物作为提取来源的优点在于保护了石杉碱甲的原有提取物千层塔的有限资源；可节约资金和成本，降低药品价格，能产生较大的社会效益和经济效益；
权利要求
1.一种抗癌药物番荔枝内酯单体化合物，其特征在于该内酯单体化合物鉴定为annonareticin，分子式为C37H66O7，化学结构式如下
2.根据权利要求1所述的番荔枝内酯单体化合物，其特征在于该化合物是白色粉末状物质，易溶于乙酸乙酯、甲醇、氯仿。
3.权利要求1所述的番荔枝内酯单体化合物annonareticin在制备治疗抗癌药物中的应用。
全文摘要
一种抗癌药物番荔枝内酯单体化合物，它是从番荔枝种子中提取得到的抗癌单体化合物。其制备方法是番荔枝种子风干后，粉碎成粗粉，先用石油醚冷浸提取；回收石油醚得红色油状液体，室温放置，底部有大量白色沉淀析出，过滤出白色沉淀，白色沉淀经多次硅胶柱层析；用石油醚，石油醚－乙酸乙酯，乙酸乙酯－甲醇梯度洗脱，得到一种番荔枝内酯单体化合物annonareticin。经体内外抗癌药理实验，其对人肝癌细胞、小鼠移植性肝癌的生长有明显的抑制作用，其抗癌活性数倍高于化疗药5－氟脲嘧啶。
文档编号A61P35/00GK1861588SQ200610085998
公开日2006年11月15日 申请日期2006年6月16日 优先权日2006年6月16日
发明者章永红 申请人:南京中医药大学