专利名称：：表达新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗rFPV-1218NDF及其构建方法
技术领域：
：本发明涉及一种表达新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗的构建领域。
背景技术：
：鸡痘病毒(FowlpoxVims，简称FPV)是继痘苗病毒VV之后的一种具有独特优越性和广阔应用前景的表达载体，是当今分子生物学领域的研究热点之-。禽痘病毒属痘病毒科，禽痘病毒属，鸡痘病毒是其代表种。FPV做为表达载体有其独特的优越性。其基因组庞大，长度约为VV的1.5倍，含较多的复制非必需区，可构建FPV多价和多联疫苗；FPV具有自身的酶系统和调控信号，其转录、翻译和装配均发生在胞浆中，可对外源基因的表达产物进行翻译后加工、修饰，保留其相应的生物学活性，诱导机体产生体液免疫和细胞免疫；与VV相比，FPV的宿主范围较窄，仅感染禽类，不易散毒，对哺乳动物和人类无潜在的威胁；重组病毒的构建方法相对简单；表达水平较高；便于对重组鸡痘病毒免疫鸡群和自然感染鸡群进行鉴别。近十几年来，FPV载体疫苗的研究已取得了很大进展，有多种病原体的保护性抗原基因在FPV中得以成功表达，如MDV的gB/pp38基因、NDV的F和HN基因、IBDV的VP2/VP2-3-4基因、AIV的HA/NA/NP基因、IBV的Sl基因、ALV的env基因、REV的env基因等，并在SPF鸡上有很高甚至100%的保护率(BoyleDB,HeineHG.Recombinantfowlpoxvirusvaccinesforpoultry.Immunol.CellBiol，1993,71:391-397.)。但迄今为止，重组FPV活载体疫苗在国内外尚未获得广泛应用。究其原因，主要是重组FPV疫苗的免疫效力在很大程度上受到商品鸡所携带的母源抗体的干扰。我国商业鸡群携带母源抗体的情况更为严重，因为在我国的养禽业中，种鸡一般要多次接种针对NDV、AIV等病原体的疫苗，包括能产生高抗体滴度的油乳剂灭活疫苗。因此，我国市场上的商品鸡普遍带有相当高的母源抗体，其中ND的母源抗体HI效价平均可达28-29，这无疑给疫苗，尤其弱毒苗和活载体疫苗的早期应用和疫情监测带来很大的困难。重组FPV受到针对FPV的母源抗体和针对外源基因表达产物的母源抗体的双重干扰，而且针对外源蛋白的母源抗体也会干扰其免疫效力。许多研究已经证明，针对外源蛋白的母源抗体会干扰重组FPV的免疫效力，而且母源抗体越高干扰越大。Taylor等发现，在有较高ND母源抗体的试验鸡上，共表达NDVF和HN基因的重组FPV抵抗NDV强毒攻击的免疫保护率较在SPF鸡上有所下降(TaylorJ,ChristensenL,GettigR,etal.E伍cacyofarecombinantfowlpox-basedNewcastlediseasevimsvaccinecandidateagainstvelogenicandrespiratorychallenge.AvianDis,1996,40:173-80.)。本室丁炜东、韦栋平等的试验结果也表明，重组FPV的免疫效力因存在针对NDV或AIV的母源抗体而受到很大的影响(丁炜东，曹丽萍，张体银等.表达新城疫病毒F和HN基因重组鸡痘病毒疫苗的遗传稳定性和免疫效力试验.中国兽医杂志,2005,41:10-14.韦栋平，刘玉良，邵卫星等.共表达新城疫F基因和H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒.微生物学报,2004,44:14-18.)。关于针对FPV的抗体是否影响重组FPV的免疫效力，目前尚无一致的看法。Taylor等对1日龄带有FPV母源抗体的试验鸡免疫共表达NDVF和HN基因的重组FPV，免疫后28攻击NDV强毒，保护率达94%-100%，表明针对FPV的母源抗体几乎不影响重组病毒抵抗NDV攻击的免疫效力(TaylorJ,ChristensenL,GettigR,etal.Efficacyofarecombinantfowlpox-basedNewcastlediseasevirusvaccinecandidateagainstvelogenicandrespiratorychallenge.AvianDis,1996，40:173-80.)。而乔传玲等通过在SPF鸡上预先感染FPV，然后接种重组FPV，来探讨FPV抗体对重组病毒的免疫效力是否存在影响。结果表明，FPV与表达AIVHA和NA基因的重组FPV同时接种和间隔4周接种时，FPV抗体对重组疫苗的免疫效力不构成影响，对高致病性AIV的保护率为100%。而间隔时间为l、2、3周时，重组疫苗的免疫效力则受到不同程度的影响(乔传玲，李呈军，于康震等.禽痘病毒感染对禽流感病毒疫苗免疫效力的影响.中国预防兽医学报，2005,27:154-156.)。在此之前，Swayne等也对此进行了研究，首先用FPV免疫12周龄鸡，然后在间隔4、9、15周后分别用表达AIVHA基因的重组FPV进行免疫，免疫3周后用高致病性AIV攻击，结果重组病毒未能提供坚强的免疫保护(SwayneDE,BeckJRandKinneyN.Failureofarecombinantfowlpoxvirusvaccinecontaininganavianinfluenzahemagglutiningenetoprovideconsistentprotectionagainstinfluenzainchickenspermmunizedwithafowlpoxvaccine.AvianDis，2000,44:132-137.)。目前，克服母源抗体的干扰作用主要有DNA疫苗免疫、共表达细胞因子、粘膜免疫以及利用新的佐剂和载体释放系统等几种途径，但尚有许多理论和技术问题需要解决，没有从根本上解决重组FPV受母源抗体干扰这一难题。
发明内容本发明的第一个目的在于发明一种表达新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗rFPV-1218NDF，该疫苗具有较强的抵抗母源抗体干扰的能力，从而克服重组鸡痘疫苗在应用过程中受母源抗体干扰这一难题。本发明表达新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗rFPV-1218NDF，于2007年1月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo:1916。本发明具有较强的抵抗母源抗体干扰的能力，从而克服重组鸡痘疫苗在应用过程中受母源抗体干扰这一难题。本发明的第二个目的在于发明一种表达新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗rFPV-1218NDF的构建方法，利用FPV表达载体pl2-18，将新城疫病毒F基因通过同源重组插入到282E4株鸡痘病毒的复制非必需区FPV12-18，从而获得了表达新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗rFPV-1218NDF。本发明与本室原来构建的以复制非必需区FPV7S为插入位点构建的相应的重组FPV相比，该疫苗在高母源抗体商品鸡上具有较强的抵抗母源抗体干扰的能力。本发明的具体技术方案如下(1)表达新城疫病毒F基因的转移载体的构建将ZJ1株新城疫病毒(NDV)的F基因插入表达载体pl2-18，获得表达NDVF基因的重组FPV转移载体pl218NDF。用碱裂解法制备转移载体的质粒DNA并以PEG纯化质粒DNA。(2)表达新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒的构建将(1)中构建的转移载体p1218NDF与282E4株FPV共转染CEF。在35mm培养皿中培养CEF，使形成60%的单层后以0.1MOI的282E4株FPV感染，37。C吸附2小时后倾去上清培养基，加lml含10%小牛血清的DMEM培养基；将l吗转移载体溶解于的无血清DMEM培养基；取5|il转染试剂FuGENETM6缓慢加入到lOOpl无血清DMEM培养基中，两者混匀置室温作用15min，然后缓缓滴加至上述CEF中，边滴边混匀，置37。C培养3小时后补加lml含10°/。小牛血清的DMEM培养基；12h后更换为含1%小牛血清的DMEM培养基，置37。C继续培养；CEF产生80%病变后收获病毒，反复冻融3次，低速离心去除细胞碎片，上清用于重组病毒的筛选和纯化。将上清稀释液接种60mm平皿上长成致密单层的CEF，37"C培养约72h，待出现较多病毒蚀斑后，用含有200吗/mlX-gal的营养琼脂覆盖，待出现蓝色蚀斑后挑取蓝色蚀斑，用吸管将其吸出，转入0.5ml细胞培养维持液中，冻融3次，低速离心去除细胞与琼脂碎片，取上清感染次代细胞。在60mm平皿中重复进行以上步骤后，f96孔板上筛选数次，直至在X-gal存在的条件下，重组病毒在CEF上所形成的蚀斑全部呈蓝色。即可得到纯化的重组病毒，即282E4株重组病毒rFPV-1218NDF。重组病毒中外源基因的插入和表达可通过PCR扩增外源基因和间接免疫荧光试验予以鉴定。(3)新构建的重组鸡痘病毒rFPV-1218NDF与原有重组鸡痘病毒rFPV-NllSF在有母源抗体商品鸡上的免疫效力比较试验将l日龄商品蛋鸡随机分组，25-26只/组，进行隔离饲养。1日龄ND的HI抗体效价平均约为28。分别于5、10、15、25日龄颈部皮下接种rFPV-NllSF、rl;PV-1218NDF和野生型鸡痘病毒FPV282，1(^PFU/只，同时设ND油苗对照组，0.2mi/只。免疫后28d进行滴鼻攻毒，每只试验鸡接种10"ELD5。的F48E8株NDV强毒。观察14d，记录发病死亡情况。对免疫效力试验结果进行统计分析。本发明构建的新的重组病毒rFPV-1218NDF和原有的rFPV-NllSF在免疫效力方面存在很大的差异。rFPV-1218NDF组较rFPV-NllSF组的保护率高，能够使重组FPV更好地抵抗母源抗体的干扰，提高重组FPV的免疫效力。亍旦这种差异不显著，可能与样本数太小有关由于我们的样本太小，每个试验组j又有25-26只鸡。因此，我们将重组病毒rFPV-1218NDF与重组病毒rFPV-NllSF分别在5、10、15和25日龄商品鸡上进行的4次免疫效力试验结果一并统计，从而将样本扩大到每组101只鸡，然后用SPSS软件对它们之间免疫保护率的差异性进行分析，结果表明它们的保护率之间差异极显著，rFPV-1218NDF和rFPV-NllSF的综合免疫保护率分别为85.9%和67.1%。这进一步确证了重组病毒rFPV-1218NDF能够更好地抵抗母源抗体的干扰。图1为转移载体pl218NDF的构建过程图。图2为感染重组FPV的CEF中F基因表达产物的间接免疫荧光鉴定图。图3为4株重组FPV在不同龄商品鸡上的4次免疫效力试验的保护率图。具体实施例方式本发明涉及的FPV(鸡痘病毒)表达载体pl2-18，于2005年6月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO:1385，其长度为10450bp，该载体以鸡痘病毒新鉴定的复制非必需区FPV12-18为外源基因插入位点，是一个含有鸡痘病毒复制非必需区侧翼区FPV1和FPV2的表达载体，FPV1的核苷酸长度为1863bp,FPV2的核苷酸长度为1554bp。构建FPV(鸡痘病毒)表达载体pl2-18的具体步骤是1、定向克隆法筛选鸡痘病毒的新复制非必需区FPV12-18病毒的增殖及基因组的提取按常规方法取9-10日龄的SPF鸡胚，制成CEF单层。接种282E4株(中国疫苗株)FPV，在5。/。C02，37。C的培养箱培养。待病变达80%以上弃去原培养基，细胞用PBS洗两遍后，加入适量PBS，用吸管将细胞吹下。低速离心弃上清，用少量PBS(50ml的细胞培养瓶用200^1)悬浮。提取方法参照HighPurePCRTemplatePreparationKit说明书进行1.5ml的Eppendorf管中依次加入上述200^1样品、200|ilBindingBuffer和40(ilProteinaseK，混匀；72。C作用lOmin后，加入lOOpl异丙醇；将上述混合物混匀后加入特定的离心管，8000rpm离心lmin，弃滤液；然后加入500^1WashingBuffer,离心，洗涤两遍；13000rpm离心10s，去除残余的液体；加入200^1ElutionBuffer(70。C预热)，8000rpmlmin离心至干净的Eppendorf管中，所得即为282E4株FPV基因组DNA。PCR扩增FPV复制非必需区FPV12-18的侧翼区FPV1和FPV2根据己发表的美国致病株鸡痘病毒FPV的基因组全序列(AF198100)设计两对引物，引物表达式P,5，一CGTAAGACTTATCCATACCGAG—3'P25，一GTTTCTAAGATCATCATGTCCTAC—3'P35，一CTGTAGTAGTTACTACATACGCAG—3'P45，一AACAGAAATAGCTCCTCTCATAC—3，P,位于ORF077的内部，P2和Ps均位于ORF073与ORF074两个ORF之间的间隔区，P4位于ORF071的内部。P!和P2跨幅约为1880bp，艮卩FPV1，P3和P4跨幅约为1570bp，即FPV2。两对引物分别用于扩增鸡痘病毒FPV复制非必需区各自的两个侧翼区(FPV1和FPV2)。引物中加入了便于克隆操作的限制性酶切位点和保护性碱基。以282E4株FPV的基因组DNA为模板，用高保真PCR系统(ExpandHighFidelityPCRSystem)扩增FPV复制非必需区侧翼区FPVl和FPV2并进行序列测定。2、构建载体pP12:(1)用III+loI双酶切克隆载体pSK和上述回收的FPV2片段，37°C消化2h以后，电泳并回收约3.0kb的载体片段和约1.57kb的FPV2。然后按一定比例进行连接成pSKP2，转化感受态大肠杆菌DH5a，挑取白色菌落提质粒并以MwdIII+硃I双酶切(20fil体系)，37。C消化1.5h以后，加4^16xLoadingbuffer,用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。阳性质粒命名为pSKP2。(2)将pSKP2和FPVl分别用SawHI、Bg/Il+SacI进行双酶切，37。C消化2h后，电泳并回收约4.57kb的载体片段和约1.88kb的FPVl片段，按一定比例连接形成pSKPlP2，转化宿主菌DH5a，然后挑取白色菌落提质粒并用历Mdni+SacI双酶切(20(!l体系)，加4^16xLoadingbuffer,用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，阳性质粒命名为pSKPlP2。pSKPlP2分别以历"dlII+loI和历"dIll+SacI双酶切后电泳，可见预期目的条带FPV2和FPV1，条带大小分别约为1.57kb禾B1.93kb(其中包括约50bp的酶切位点)，表明FPV1和FPV2己成功插入载体。(3)将pSKPlP2和pFGl175-1分别用MzeI、J^^I进行单酶切，37。C消化2h后，电泳并回收约6.45kb的载体片段和约3.80kb的Pll-丄acZ标记基因表达框，按一定比例连接构成pP12，转化宿主菌DH5a，然后挑取蓝色菌落提质粒并用5bcI进行酶切(20pl体系)，37。C消化1.5h后，加4|il6xLoadingbuffer,用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。筛选P11-丄MZ标记基因表达框正向插入的阳性质粒，阳性质粒命名为pP12。3、FPV复制非必需区的筛选将纯化的载体质粒pP12与282E4株FPV共转染CEF，转染试剂为FuGENE6TransfectionReagent,转染及重组病毒的筛选纯化按照转染试剂说明书进行。在35mm培养皿中培养CEF，使形成60%的单层后以0.1MOI的282E4株FPV感染，37。C吸附2小时后倾去上清培养基，力Qlml含10%小牛血清的DMEM培养基；将l吗载体质粒pP12溶解于50(il的无血清DMEM培养基；取5^1转染试剂FuGENETM6缓慢加入到100|il无血清DMEM培养基中，两者混匀置室温作用15min，然后缓缓滴加至上述CEF中，边滴边混匀，置37。C培养3小时后补加lml含10%小牛血清的DMEM培养基；12h后更换为含1%小牛血清的DMEM培养基，置37。C继续培养；CEF产生80%病变后收获病毒，反复冻融3次，低速离心去除细胞碎片，上清用于重组病毒的筛选和纯化。将上清稀释液接种60mm平皿上长成致密单层的CEF，37。C培养约72h，待出现较多病毒蚀斑后，用含有200吗/mlX-gal的营养琼脂覆盖，待出现蓝色蚀斑后挑取蓝色蚀斑，见图3，用吸管将其吸出，转入0.5ml细胞培养维持液中，冻融3次，低速离心去除细胞与琼脂碎片，取上清感染次代细胞。在60mm平皿中重复进行以上步骤后，于96孔板上筛选数次，直至在X-gal存在的条件下，重组病毒在CEF上所形成的蚀斑全部呈蓝色。即可得到纯化的重组病毒。重组病毒rFPV-1218NDF的获得表明，预先假定的复制非必需区均为真正的FPV复制非必需区，命名为FPV12-18。4、复制非必需区的遗传稳定性试验重组鸡痘病毒接种CEF，在5。/。C02,37t:的培养箱培养，2-3天后待病变达80%以上后收获，反复冻融3次，用于下次扩增，连续传10代。空斑计数后保存于-70。C冰箱备用。分别取重组病毒的O、5、10代以10—3、10—4、10—5、10—6稀释，接种生长在24孔板上单层次代CEF，100pl/L。待出现单个蚀斑后，覆盖含200)ig/mlX-gal的琼脂，37°C，C02箱中培养1-2天观察蚀斑纯度。结果发现所有病毒蚀斑均呈蓝色。用PBS吹下扩增的三个代次重组鸡痘病毒的单层细胞，以HighPurePCRTemplatePreparationKit(宝灵曼公司)提取核酸模板DNA。按常规方法针对/」CZ基因部分片段进行PCR并测序，检测外源基因在重组FPV传代过程中是否发生变异，结果序列没有发生任何变异。以上试验表明，重组病毒基因组中的丄"CZ基因能够稳定遗传和表达，同时也证明了筛选的FPV复制非必需区FPV12-18具有良好的遗传稳定性。5、鸡痘病毒表达载体pl2-18的构建将pNllS用7/z'"dIll+SmaI进行双酶切，37。C消化2h后，电泳并回收约200bp的含MCS的Ps启动子，与同时用历"dni+5VwaI双酶切的载体pP12按一定比例连接构建鸡痘病毒表达载体pl2-18，将该载体转化宿主菌DH5a，然后挑取蓝色菌落提质粒，并用Z/^dI双酶切(20(^1体系)，加4(_il6xLoadingbuffer,用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，阳性质粒分别命名为pl2-18。经测序，鸡痘病毒表达载体pl2-18的长度为10450bp，该载体以鸡痘病毒新鉴定的复制非必需区FPV12-18为外源基因插入位点，是一个含有鸡痘病毒复制非必需区侧翼区FPV1和FPV2的表达载体。一、表达新城疫病毒F基因的转移载体的构建质粒pTF用化/1双酶切，回收约1.7kb的ZJ1株NDV的F基因片段，与经6flmH1+1双酶切的表达载体pl2-18进行连接，转化宿主菌DH5a，然后挑取蓝色菌落提质粒，并用/Z/"din酶切(20)!l体系)，加4^16xLoadingbuffer,用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，阳性质粒可见约1.9kb的条带。阳性质粒即转移载体命名为pl218NDF，其具体构建过程见图l。用碱裂解法制备转移载体的质粒DNA并以PEG纯化质粒DNA。二、表达新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒的构建将纯化的载体质粒pl218NDF与282E4株FPV共转染CEF，转染试剂为FuGENE6TransfectionReagent,转染及重组病毒的筛选纯化按照转染试剂说明书进行。在35mm培养皿中培养CEF，使形成60%的单层后以0.1MOI的282E4株FPV感染，37。C吸附2小时后倾去上清培养基，力卩lml含10%小牛血清的DMEM培养基；将l吗转移载体溶解于50pl的无血清DMEM培养基；取5^1转染试剂FuGENETM6缓慢加入到100jil无血清DMEM培养基中，两者混匀置室温作用15min，然后缓缓滴加至上述CEF中，边滴边混匀，置37°C培养3小时后补加lml含10%小牛血清的DMEM培养基；12h后更换为含1%小牛血清的DMEM培养基，置37。C继续培养；CEF产生80%病变后收获病毒，反复冻融3次，低速离心去除细胞碎片，上清用于重组病毒的筛选和纯化。将上清稀释液接种60mm平皿上长成致密单层的CEF，37。C培养约72h，待出现较多病毒蚀斑后，用含有200^ig/mlX-gal的营养琼脂覆盖，待出现蓝色蚀斑后挑取蓝色蚀斑，用吸管将其吸出，转入0.5ml细胞培养维持液中，冻融3次，低速离心去除细胞与琼脂碎片，取上清感染次代细胞。在60mm平皿中重复进行以上步骤后，于96孔板上筛选数次，直至在X-gal存在的条件下，重组病毒在CEF上所形成的蚀斑全部呈蓝色。即可得到纯化的重组病毒，即282E4株重组病毒rFPV-1218NDF。感染表达NDVF基因的重组病毒和阳性对照rFPV-F或rFPV-HN的CEF胞浆和胞膜区呈特异性黄绿色荧光，而感染阴性对照亲本282E4株FPV的CEF则未呈现特异性荧光着色，表明重组FPV中的F基因已获得表达。重组病毒rFPV-1218NDF及其阳性对照rFPV-F、阴性对照野生型282E4株FPV的荧光照片见图2。图2中，A图为感染rl2LSF的CEF;B图为感染rFPV-F的CEF，C图为感染野生型282E4株FPV的CEF。重组病毒的O、5、10代接种24孔板上的单层次代CEF，待出现单个蚀斑后，覆盖含200Hg/mlX-gal的琼脂，发现所有病毒蚀斑均呈蓝色。而间接免疫荧光试验发现所有病毒蚀斑均呈现特异性荧光，阴性对照组无特异性荧光。对5、IO代重组病毒中的F基因进行PCR，结果均可以扩增出1.7Kb的目的条带，与预期值相符。测序结果显示，所测序列没有发生任何变异。以上试验表明，重组病毒基因组中的F基因均能够稳定地遗传和表达。三、新构建的重组鸡痘病毒rFPV-1218NDF与原有的重组鸡痘病毒rFPV-NllSF在有母源抗体商品鸡上的免疫效力比较试验将重组病毒rFPV-NllSF与重组病毒rFPV-1218NDF分别在5、10、15和25日龄的存在不同水平母源抗体的商品鸡上进行免疫效力试验。将l日龄商品蛋鸡随机分组，25-26只/组，进行隔离饲养。1日龄ND的HI抗体效价平均约为28。分别于5、10、15、25日龄颈部皮下接种rFPV-NllSF、rFPV-1218NDF和野生型鸡痘病毒FPV282，10》FU/只，同时设ND油苗对照组，0.2ml/只。免疫后28d进行滴鼻攻毒，每只试验鸡接种105ELDso的F48E8株NDV强毒。观察14d，记录发病死亡情况。5日龄商品鸡商品鸡5日龄时的ND母源抗体相当高，其平均HI效价达至1J2(6飼'4)。由表1可见，重组病毒rFPV-NllSF和rFPV-1218NDF的免疫保护率之间存在很大的差异，分别为43.8%和75.0%;ND油苗的保护率为100%。rFPV-N11SF组与ND油苗组的保护率之间存在显著差异，而rFPV-1218NDF组与ND油苗组的保护率之间无显著差异。表1重组FPV在5日龄商品鸡上的免疫郊〔力试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>NDHi效价=平均HI效价(log2x)士标准差；FPV旭:282E4株野生型鸡痘病毒免疫保护率=(攻毒对照组死亡率一疫苗免疫组死亡率)/攻毒对照组死亡率xl00。/。10日龄商品鸡商品鸡10日龄时ND母源抗体的平均HI效价为2(5.0±0.6)。由表2可见，重组病毒rFPV-NllSF和rFPV-1218NDF的免疫保护率之间也存在很大的差异，分别为50.0%和70.8%，ND油苗的保护率为83.3%。表2重组FPV在10日龄商品鸡上的免疫效力试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>NDHI效价=平均HI效价(log2x)土标准差；FPV282:282E4株野生型鸡痘病毒免疫保护率=(攻毒对照组死亡率一疫苗免疫组死亡率)/攻毒对照组死亡率><100%15日龄商品鸡商品鸡15日龄时ND母源抗体的平均HI效价为2(4，4)。由表3可见，rFPV-NllSF和rFPV-1218NDF组的保护率均较各自5、10日龄免疫的保护率均有一定的提高，其中rFPV-1218NDF组的保护率达到了95%，比rFPV-NllSF组略高；重组FPV组和ND油苗组的保护率之间没有显著差异。表3重组FPV在15日龄商品鸡上的免疫效力试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>NDHI效价=平均HI效价(log2x)土标准差；FPV282:282E4株野生型鸡痘病毒免疫保护率=(攻毒对照组死亡率一疫苗免疫组死亡率)/攻毒对照组死亡率xl00。/。25日龄商品鸡商品鸡25日龄时ND的母源抗体已经很低，平均HI效价下降到2aQ±a4)。由表4可见，重组FPV组较其5和15日龄免疫的保护率明显上升，rFPV-NllSF组为88%，rFPV-1218NDF组则与油苗组一样达到100%，各免疫组之间差异不大。表4重组FPV在25日龄商品鸡上的免疫效力试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>NDHI效价=平均HI效价(log2x)±标准差；FPV282:282E4株野生型鸡痘病毒免疫保护率=(攻毒对照组死亡率一疫苗免疫组死亡率)/攻毒对照组死亡率x100%综上所述，商品鸡上普遍存在的母源抗体对重组FPV的免疫效力存在很大的影响；在5、10、15、25日龄的带有不同水平母源抗体的商品鸡上，rFPV-1218NDF禾nrFPV-NllSF在免疫效力方面存在很大的差异。rFPV-1218NDF组较rFPV-NllSF组的保护率高，表明rFPV-1218NDF能够更好地抵抗母源抗体的干扰。但这种差异不显著，可能与样本数太小有关。因此，我们将以重组病毒rFPV-1218NDF与重组病毒rFPV-NllSF分别在5、10、15和25日龄商品鸡上进行的4次免疫效力试验结果一并统计(见表5和图3)，从而将样本扩大到每组101只鸡，然后用SPSS软件对它们之间免疫保护率的差异性进行分析，结果表明它们的保护率之间差异极显著，这进一步确证了rFPV-1218NDF较rFPV-NllSF能够更好地抵抗母源抗体的干扰。表5重细FPV在不同龄商品鸡上的4次免疫效力试验结果<table>complextableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>a、b差异极显著(PO.01);FPV282:282E4株野生型鸡痘病毒免疫保护率=(攻毒对照组死亡率一疫苗免疫组死亡率)/攻毒对照组死亡率x100%图3中，l为rFPV-NllSF，2为rFPV-1218NDF，3为ND油苗。cgtaagacttatccataccgaggtttctaagatcatcatgtcctacctgtagtagttactacatacgcag犯c绍犯ategctcctctcatec权利要求1、表达新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗rFPV-1218NDF，其特征在于其保藏号CGMCCNo1916。2、如权利要求1所述表达新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗rFPV-1218NDF的构建方法，其特征在于利用FPV表达载体pl2-18，将新城疫病毒F基因通过同源重组插入到282E4株鸡痘病毒的复制非必需区FPV12-18，从而获得表达新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗rFPV-1218NDF。3、根据权利要求2所述表达新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗rFPV-1218NDF的构建方法，其特征在于包括以下步骤(1)表达新城疫病毒F基因的转移载体的构建将NDV的F基因插入表达载体pl2-18，获得表达NDV的F基因的重组FPV转移载体pl218NDF;用碱裂解法制备转移载体的质粒DNA并以PEG纯化质粒DNA。(2)表达新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒的构建将(1)中构建的转移载体pl218NDF与282E4株FPV共转染CEF:在35mm培养皿中培养CEF，使形成60%的单层后以0.1MOI的282E4株FPV感染，37"C吸附2小时后倾去上清培养基，加lml含10%小牛血清的DMEM培养基；将l吗转移载体溶解于5(Hil的无血清DMEM培养基；取5^1转染试剂FuGENETM6缓慢加入到10(^1无血清DMEM培养基中，两者混匀置室温作用15min，然后缓缓滴加至上述CEF中，边滴边混匀，置37。C培养3小时后补加lml含10%小牛血清的DMEM培养基；12h后更换为含1%小牛血清的DMEM培养基，置37'C继续培养；CEF产生80。/。病变后收获病毒，反复冻融3次，低速离心去除细胞碎片，上清用于重组病毒的筛选和纯化；将上清稀释液接种60mm平皿上长成致密单层的CEF，37。C培养约72h，待出现较多病毒蚀斑后，用含有200)ig/mlX-gal的营养琼脂覆盖，待出现蓝色蚀斑后挑取蓝色蚀斑，用吸管将其吸出，转入0.5ml细胞培养维持液中，冻融3次，低速离心去除细胞与琼脂碎片，取上清感染次代细胞。在60mm平皿中重复进行以上步骤后，于96孔板上筛选三至十次，直至在X-gal存在的条件下，重组病毒在CEF上所形成的蚀斑全部呈蓝色，即得纯化的重组病毒，即282E4株重组病毒rFPV-1218NDF。全文摘要表达新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗rFPV-1218NDF及其构建方法，涉及疫苗的构建领域。利用FPV表达载体p12-18，将新城疫病毒F基因通过同源重组插入到282E4株鸡痘病毒的复制非必需区FPV12-18，从而获得了表达新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗rFPV-1218NDF。本发明疫苗在高母源抗体商品鸡上具有较强的抵抗母源抗体干扰的能力。文档编号A61P31/12GK101096685SQ20071002268公开日2008年1月2日申请日期2007年5月25日优先权日2007年5月25日发明者刘武杰,刘秀梵,蕾孙,陈素娟申请人:扬州大学