专利名称：抑制人Akt2基因表达的siRNA序列及其融合表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体是一段能抑制人Akt2基因表达的 s iRNA序列及其融合表达载体。
背景技术：
RM干扰(RNAi )是多数真核细胞本身固有的一种自我保护现象，既 能对抗如病毒基因或人工转基因所表达的mRNA等外源基因的侵害，又能 降解自身异常基因产生的mRNA。以基因转录后沉默的方式或诱导DNA曱 基化的方式对含有其同源序列的基因表达进行干涉。
近年来，人们利用这一现象针对要研究的基因表达进行阻断，从而 产生相应的功能缺失表型，形成RNAi技术。新近的RNAi技术，是利用 DNA表达载体直接在体内表达短发夹状RNA(shRNA)，特异性封闭相应的 靶基因mRNA，抑制mRNA的翻译。与早期的RNA干扰技术相比，该方法的
特异性和干扰效率均有较大提高，已广泛应用于多种研究领域。
蛋白激酶B(Akt)是一种丝氨酸苏氨酸蛋白激酶，包含Aktl、Akt2、Akt3 三种亚型，其中Akt2在多种肺瘤中均有表达。Akt最早发现于引起鼠白血 病的逆转录病毒癌基因v-Akt编码的融合蛋白中，至今在哺乳动物体内还 没有发现Akt基因的突变体。研究证明，Akt是胰岛素样生长因子l受体(IGF 一1R)、表皮生长因子受体HER^/neu、血管内皮生长因子受体(VEGF—R)、 血小板源性生长因子受体(PDGF—R)等受体酪氨酸激酶或G.蛋白偶联受体 等参与的细胞外信号通路上游的重要会聚点，同时Akt也是磷酯酰肌醇3 激酶(PI3K)信号传导通路的中心环节。其功能除了涉及细胞周期调控，凋 亡启动等细胞生存调节外，还参与血管生成、端粒酶活性和细胞侵袭,f生等 诸多重要的生理及病理过程。目前的研究发现，Akt是肿瘤发生的重要信 号分子，其亚型Akt2是由481个氨基酸组成的蛋白质，当其第308位的丝氨 酸和473位的苏氨酸磷酸化时，激酶活性增高，发挥促进细胞增殖和抑制 细^^凋亡的作用。
发明内容
本发明是为了进一步研究Akt2在肿瘤发生发展中的作用提供一个有 效的工具，也为肿瘤的基因治疗提供了一个新的技术手段，而提供一段抑 制人Ak 12基因表达的s i RN A序列及其融合表达载体。
本发明通过基因敲除技术，即siRNA的方法抑制Akt2的表达。利用 RNAi技术特异地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达，使这 些基因保持在沉默或休眠状态，从而使肿瘤细胞增殖速度减慢，凋亡加快，显示了 RNAi技术用于肿瘤基因治疗的可行性和有效性。RNAi过程中， 由双链RNA分子加工而成的19-23个核芬酸的RNAs就称为siRNA，是诱 导基因沉默的第一步，它与-RNAi特异性酶结合，形成沉默复合物，特异 降解与s iRNA同源的靶mRNA。
抑制人Akt2基因表达的siRNA序列，该序列与Akt2 mRNA互补；具 有抑制人Akt2基因表达的功能，其作用位点Akt2 mRNA ( NM—001626 CDS: 263-1708) 1570-1588，
其核酸序列如下5 ，-TTCATCATCGAAGTACCTT- 3 ，。
一种抑制人Akt2基因表达的siRNA序列的融合表达载体，其融合表 达载体由合成的抑制人Akt2基因表达的siRNA序列模板与 pRNAT-U6. 1/Hygro载体相连接而成，将其转染人乳腺癌细胞后能够特异 降解与siRNA同源的Akt2的mRNA，抑制人Akt2基因表达；
其中合成抑制人Aia2基因表达的siRNA序列模板为两端带有酶切 位点，3'端为HindIII， 5'端为BamH I ，合成抑制人Akt2基因表达的siRNA 序列模板的核酸序列如下
5，-GGATCCCAATTCATCATCGAAGTACCTTTTCAAGAGAAAGGTACTTCGATGATGAA TTTTTTTTCCAAAAGCTT-3，。
本发明通过脂质体将融合载体转入MDA-MB-231人乳腺癌细胞系中， 以contro卜siRNA作为对照，通过潮霉素压力筛选得到稳定细胞抹，用 RT-PCR、 Western Blot方法检测细胞的Akt2表达水平。结果表明表达 Akt2-siRNA作用的细胞其Akt2的合成明显降低，与对照组相比具有显著 差异(P〈0. 05)。
本发明设计的靶向Akt2的siRNA的序列及融合表达载体能够在人乳 腺癌细胞中表达特定的siRNA，并能够有效地抑制Akt2的基因表达，为 进一步研究Akt2基因在肿瘤中的生物学功能提供了可行的手段。
这样设计的本发明能够为进一步研究Akt2在肿瘤发生发展中的作用 提供了一个有效的工具，也为肿瘤的基因治疗提供了一个新的技术手段。
附图是Akt2的mRNA和蛋白表达量。
具体实施例方式
下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。 一。实验材料来源
人乳&，癌MDA-231细月包由美国国家癌症研究所Dr. Joost J. Oppenheim赠送；pRNAT-U6. 1/Hygro质粒购自GenScript公司； Hygromysin来自Invitrogen。鼠抗人Akt2单克隆抗体购自Santa Cruz公司。
二.实施方法
1. Akt2-siRNA的设计与合成
依据Ambion公司在网上提供的设计软件 (www。 ambion. com/techl ib/misc/ siRNA finder, html )合成以下 Akt2特异的si隨:
5，-GGATCCCAATTCATCATCGAAGTACCTTTTCAAGAGAAAGGTACTTCGATGATGA ATTTTTTTTCCAAAAGCTT-3，
siRNA作用位点
Akt2 mRNA ( NM—001626 CDS: 263-1708)的1570-1588位点,siRNA 由GenScript公司合成。
2. Akt2-siRNA融合表达载体构建
表达载体pRNAT-U6. 1/Hygro其结构为线性，两端分别为BamHI和 HindIII酶切位点的粘性末端。将合成的Akt2-siRNA模板退火，连入 pRNAT-U6. 1/Hygro质粒载体中，转染感受态大肠杆菌DH5 ot ，铺平板过 夜培养。挑取转化菌扩增培养提取质粒，酶切测序验证插入序列。
阴性对照Control-siRNA载体由试剂盒提供，含有一段与人类已知 基因均不同源的siRNA。
3. 表达载体转染及稳定细胞抹筛选
应用EndoFree Plasmid Maxi试剂盒提取纯化质粒，用800 u 1低渗 液将20iag重组质粒与lxl(T细胞混合，采用1 OOOv电压电转lOOix s, 静置5min，传入96孔板，5。/。C02温箱孵育24h。添加0. 8mg/ml Hygromycin B压力筛选至非转染对照组细胞完全死亡，约20 d，将表达GFP的单克 隆挑出扩大培养。
结果表明得到4个稳定克隆，其编号分别为44、 98、 97、 102。
4. 检测细胞中Akt2的表达水平 ①.实验方法
将对照细胞和Akt2-siRNA转染的细胞(44、 98、 97、 102)，用Trizol 试剂提取细胞的总RNA,电泳;险测质量，紫外分光定量。以相同量RNA作 为起始才莫板，逆转录反应合成cDNA。 用QuantiTect SYBR Green PCR试 剂盒在定量PCR仪GeneAmp 5700上进行实时定量PCR，反应体系为95°C 预变性15min, 94。C变性15s， 5(TC退火30s， 72。C延伸30s，循环40次。 用SDS Software及琼脂糖凝胶电泳分析结果。
用免疫印迹的方法检测细胞中蛋白的表达水平是生物实验中一个传 统的方法。将对照细月包和Akt2-siRNA转染的细月包(44、 98、 97、 102)预留足够数量至离心管中，离心后裂解细胞，煮样，超声，再离心。制
得样品后，使用BCA试剂盒进行蛋白浓度的测定。根据样品的浓度，取 相同的蛋白总量进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，将胶上蛋白电转到PVDF 膜上，室温牛奶封闭2小时。简单洗涤后， 一抗(鼠抗人Akt2单克隆抗 体)室温孵育2小时。然后用抗鼠的二抗室温孵育1小时。最后用化学 发光试剂盒检测。根据曝光后条带的宽窄和深浅判断蛋白的表达量。每 个克隆至少通过3次免疫印迹进行;险测。
②.实^r结果见图1，与对照细^^目比，克隆44、 98、 97、 102中 的Akt2的mRNA和蛋白表达量均有明显降低。
从以上工作的结果中得出本发明设计的靶向Akt2的siRNA的序列 及融合表达载体能够在人乳腺癌细胞中表达特定的siRNA,并能够有效地 抑制Akt2的基因表达，为进一步研究Akt2基因在紳瘤中的生物学功能 提供了可行的手段。SEQUENCE LISTING
<110>天津医科大学附属肿瘤医院
<120>抑制人Akt2基因表达的siRNA序列及其融合表达载体 <130> 人 <160> 1
<170> Patentln version 3,1 <210> 1 <211> 74 <212> DNA
<213> 人 <220>
<221> siRNA <222> (1)..(74) <223> <400> 1
ggatcccaat tc3tcatcg3 3gt3cctttt c33g3g333g gt3cttcg3t g3tg33tttt 60 ttttccaaaa gctt 7权利要求
1. 抑制人Akt2基因表达的siRNA序列，其特征在于该序列与Akt2mRNA互补；具有抑制人Akt2基因表达的功能，其作用位点Akt2 mRNA(NM_001626 CDS263-1708)1570-1588，其核酸序列如下5’-TTCATCATCGAAGTACCTT-3’。
2. —种抑制人Akt2基因表达的siRNA序列的融合表达载体，其特征 在于该融合表达载体由合成的抑制人Akt2基因表达的siRNA序列模板 与pRNAT-U6. 1/Hygro载体相连接而成，将其转染人乳腺癌细胞后能够特 异降解与siRNA同源的Akt2的mRNA,抑制人Akt2基因表达；其中合成抑制人Akt2基因表达的siRNA序列模板为两端带有酶切 位点，3'端为HindIII， 5，端为BamH I ，合成抑制人Akt2基因表达的siRNA 序列模板的核酸序列如下5 ，-GGATCCCAATTCATCATCGAAGTACCTTTTCAAGAGAAAGGTACTTCGATGATGAA TTTTTTTTCCAAAAGCTT-3'。
全文摘要
本发明公开了一段抑制人Akt2基因表达的siRNA序列及其融合表达载体，属于生物技术领域。该序列与Akt2 mRNA互补；具有抑制人Akt2基因表达的功能，其核酸序列为5’-TTCATCATCGAAGTACCTT-3’；其融合表达载体由合成的抑制人Akt2基因表达的siRNA序列模板与pRNAT-U6.1/Hygro载体相连接而成，将其转染人乳腺癌细胞后能够特异降解与siRNA同源的Akt2的mRNA，抑制人Akt2基因表达；在人乳腺癌细胞中能够沉默Akt2的表达，可以有效地抑制人乳腺癌细胞Akt2蛋白合成，为进一步研究Akt2基因在肿瘤中的生物学功能提供了可行的手段。
文档编号A61P35/00GK101434629SQ20071015020
公开日2009年5月20日 申请日期2007年11月16日 优先权日2007年11月16日
发明者宁 张, 王静娜 申请人:天津医科大学附属肿瘤医院