专利名称：：对年幼动物免疫接种以抵抗胞内劳森菌感染的制作方法
技术领域：
：本发明概言之是关于用于免疫接种以对抗由专性胞内细菌胞内劳森菌增生性回肠炎的改良接种方法。特另i是，本发明提供一种藉:自一(1)天大开始接种年幼动物以对抗胞内劳森菌感染来提供对抗胞内劳森菌的增强性保护的方法。该等年幼动物优选在1天大至21天大，更优选在1天大至10天大，更优选在1天大至9天大，更优选在1天大至6天大，更优选在1或2天大，且最优选在1天大时接受接种。特别是，该年幼动物为年幼小猪(youngpiglet),优选为断奶前小猪(pre-weanedpiglet)。现有技术猪增生性肠炎(Porcineproliferativeenteropathy,PPE)是天然发生的疾病，其可影响断奶至成年期早年(yoimgadult)的猪。已确定其病原体为胞内劳森菌。胞内劳森菌是专性胞内菌，不能在不含细胞的常规培养基上用普通的细菌学方法培养，一般认为其生长需要有细力包。S.McOristwa/.，InfectionandImmunity,Vol.61，No.19，4286-4292(1993)和G.Lawson"a/"J.ofClinicalMicrobiology,Vol.31,No.5，1136-1142(1993)讨论了在常Mi且织培养瓶中、用正C-18大鼠单层肠上皮细胞培养胞内劳森菌。美国专利5,714,375和5,885,823(都全文引入作参考)描述了在悬浮宿主细胞中培养胞内劳森菌。胞内劳森菌的致病抹和非致病减毒才朱是本领域熟知的。例如，WO96/39629和WO05/011731描述了胞内劳森菌的非致病减毒抹。胞内劳森菌的减毒抹可参见WO02/26250和WO03/00665。4该疾病的特征首先在于其肉眼及微观病理，且随后在于受感染细胞内证实有胞内细菌。该疾病的典型病理特征为在回肠(小肠的末端部分)、大肠或两者的隐窝(crypt)中未成熟上皮细胞的增生。受感染组织的切片特征为类似"橡胶软管(gardenhose)"的变红增厚粘膜及肠损害。肠增厚最终阻止正常肠功能、吸收能力及营养转移。该疾病的临床表现为慢性重量减轻、不壮实(unthriftiness)、腹泻及死亡。该疾病由于受感染动物死亡造成损失、医疗成本增加、增重困难及食物转化率降低而具有经济学重要性。最值得注意的为在6-20周龄的猪中观察到回肠炎的临床病例。然而，已在刚断奶不久的猪(3-4周龄)中证实(藉由PCR)胞内劳森菌的存在，此表明暴露于胞内劳森菌的情况发生在养殖场且可能源于劳森菌阳性母畜(Mauch及Bilkei(2004)VetRec155:532;Marsteller等人(2003).SwineHealthProd11:127-130;Stege等人(2004).VetMicro104:197-206)。此等观察结果强调在生产系统中引入预防策略(诸如及早接种)的重要性。目前对抗回肠炎的免疫法的接种策略涉及仅对来自三周龄及三周龄以上的未接触过劳森菌的猪进行疫苗口服投予，此是因为低于此年龄组的仔猪由于先前母猪的暴露或接种而可能具有对胞内劳森菌呈阳性的母体抗体。在本发明的方法之前，一般认为母体抗体或其他催乳因子的存在可潜在地干扰该等仔猪中接种的功效，因为在仔猪的免疫系统可识別疫苗且开始分泌其自身抗体之前，母体抗体具有中和疫苗的能力。因此，已在面临母体免疫时避免接种年幼仔猪。图1展示在IFAT中对IgG、IgM及IgA呈阳性的初乳样品的数目。图2展示在具有不同Ig含量的母猪乳液样品中胞内劳森菌培养物的滴定度(两次滴定的平均值)。
发明内容本发明是基于两种令人惊奇的观测结果。首先，在途经胃肠道期间，母体抗体及母猪乳液并未显现有效于灭活胞内劳森菌。在室温4小时培育期间以母猪初乳或乳液培育胞内劳森菌不影响胞内劳森菌培养物的滴定度。具有高或低Ig含量的样品之间无差异。即使在1:20稀释度(5%胞劳森菌培养物/95%乳液)下未观测到对培养物滴定度的影响。总之，活体外未检测到任何受测试母猪乳液样品对胞内劳森菌培养物的滴定度的直接影响。然而，由于年幼小猪通常不罹患回肠炎，因此已讨论对抗胞内劳森菌的母体免疫性(Holyoake,P.K.等人(1994)JClinMicrobiol32,第1980-1985页；Mauch，C.H.Y.及G.Bilkei(2004)Vet.Rec.155,532)。如此研究中所示，在途经胃肠道期间，母体抗体及母猪乳液并未显现有效于灭活胞内劳森菌。其次，母体抗体及母猪乳液并不干扰胞内劳森菌抗原，且因此不防止由接种提供的对抗胞内劳森菌感染的主动保护的建立。事实上，与未接种小猪相比，在1天大时接种的小猪的与该疾病有关的肉眼可见病理表现已有减少。因此，本发明克服先前技术的不足且提供新方法用于对动物提供对抗回肠炎(胞内劳森菌感染)的增强性保护。详言之，本发明提供一种接种年幼动物以对抗胞内劳森菌感染的方法，该方法包含投予该年幼动物有效剂量的胞内劳森菌抗原的步骤。该年幼动物的年龄优选为一(l)天大或一天大以上。此外，根据另一方面，本发明提供一种用于接种具有或暴露于抗胞内劳森菌抗体，尤其为母体来源的抗胞内劳森菌抗体的年幼动物以对抗胞内劳森菌感染的方法，该方法包含投予该年幼动物有效剂量的胞内劳森菌抗原的步骤。该年幼动物的年龄优选为一(l)天大或一天大以上。根据另一方面，本发明提供一种用于接种具有或暴露于抗胞内劳森菌抗体，尤其为母体来源的抗胞内劳森菌抗体的动物以对抗胞内劳森菌感染的方法，该方法包含^L予该动物有效剂量的胞内劳森菌抗原的步骤。如本文中所用的术语"接种，，("vaccination"或"vaccinating")意谓(但不限于)一种包括对动物投予胞内劳森菌抗原的方法，其中该胞内劳森菌抗原在投予该动物时在该动物体内引发或能够引发对抗胞内劳森菌的免疫反应。如本文中所用的术语"动物"意谓(但不限于)鸟、鱼及诸如牛、猪、马或灵长类动物等哺乳动物。然而，根据本发明的优选实施例，该动物为猪，优选为断奶前小猪。因此，根据另一方面，本发明是关于一种接种年幼动物以对抗胞内劳森菌感染的方法，该方法包含自一(l)天大开始投予该年幼动物有效剂量的胞内劳森菌抗原的步骤，其中该动物为鸟、鱼或诸如牛、猪、马或灵长类动物等哺乳动物。该动物优选为哺乳动物。该动物更优选为猪。该动物最优选为断奶前小猪。如本文中所用的术语"年幼动物"是指1天大至20天大的动物。术语"年幼动物"优选是指1天大至IO.天大的动物。术语"年幼动物"更优选是指1天大至9天大，更优选为1天大至8天大，更优选为1天大至7天大，更优选为1天大至6天大，更优选为1天大至5天大，更优选为1天大至4天大，更优选为1天大至3天大，更优选为1或2天大的动物，最优选是指l天大的动物。术语"年幼动物"的个别含义(respectivemeaning)亦是指当以胞内劳森菌抗原第一次接种动物时其年龄。因此，本发明的另一方面是关于一种接种年幼动物以对抗胞内劳森菌感染的方法，该方法包含投予该年幼动物有效剂量的胞内劳森菌抗原的步骤，其中该动物在1天大至20天大时接受接种。根据另一实施例，本发明是关于该接种方法，其中该动物在1天大至10天大时接受接种。根据另一实施例，本发明是关于该接种方法，其中该动物在1天大至9天大时接受接种。根据另一实施例，本发明是关于该接种方法，其中该动物在1天大至8天大时接受接种。根据另一实施例，本发明是关于该接种方法，其中该动物在1天大至7天大时接受接种。根据另一实施例，本发明是关于该接种方法，其中该动物在1天大至6天大时接受接种。根据另一实施例，本发明是关于该接种方法，其中该动物在1天大至5天大时接受接种。才艮据另一实施例，本发明是关于该接种方法，其中该动物在1天大至4天大时接受接种。根据另一实施例，本发明是关于该接种方法，其中该动物在l天大至3天大时接受接种。根据另一实施例，本发明是关于该接种方法，其中该动物在1或2天大时接受接种。根据另一实施例，本发明是关于该接种方法，其中该动物在1天大时接受接种。术语"具有或暴露于抗胞内劳森菌抗体"意谓(但不限于)具有或暴露于优选为每毫升至少1:4,更优选为1:16以上，更优选为1:64以上，更优选为1:128以上，更优选为1:256以上，更优选为1:512以上，且最优选为1:1024以上的可检测抗胞内劳森菌抗体滴定度的动物。彼抗胞内劳森菌抗体滴定度优选在特异性抗胞内劳森菌免疫试验中，优选在如实施例4中所述的试验中是可检测及量化的。彼等抗胞内劳森菌抗体更优选为母体来源的抗体。术语"暴露于抗胞内劳森菌抗体，，意谓(但不限于)以例如初乳或乳液等营养物饲喂动物获得优选为每毫升或每克营养物至少1:4，更优选为1:16以上，更优选为1:64以上，更优选为1:128以上，更优选为1:256以上，更优选为1:512以上，且最优选为1:1024以上的可检测抗胞内劳森菌抗体滴定度的事实。术语"具有抗胞内劳森菌抗体"应意谓(但不限于)在该动物的1ml血清中具有优选为至少1:4，更优选为1:16以上，更优选为1:64以上，更优选为1:128以上，更优选为1:256以上，更优选为1:512以上，且最优选为1:1024以上的可检测抗胞内劳森菌抗体滴定度。因此，根据另一方面，本发明提供一种用于接种动物以对抗胞内劳森菌感染的方法,该方法包含投予该动物有效剂量的胞内劳森菌抗原的步骤，其中该动物具有或暴露于优选为每毫升至少1:4,更优选为1:16以上，更优选为1:64以上，更优选为1:128以上，更优选为1:256以上，更优选为1:512以上，且最优选为1:1024以上的可检测抗胞内劳森菌抗体滴定度。彼等抗体优选为母体来源的抗体。彼等抗体滴定度更优选在接种日存在于彼动物体内。因此，根据另一方面，本发明提供一种用于接种年幼动物以对抗胞内劳森菌感染的方法，该方法包含投予该年幼动物有效剂量的胞内劳森菌抗原的步骤，其中该年幼动物具有或暴露于优选为每毫升至少1:4,更优选为1:16以上，更优选为1:64以上，更优选为1:128以上，更优选为1:256以上，更优选为1:512以上，最优选为1:1024以上的可冲企测抗胞内劳森菌抗体滴定度。彼等抗体优选为母体来源的抗体。该年幼动物的年龄优选为1天大至20天大之间。该年幼动物的年龄更优选为1天大至10天大之间，更优选为1天大至9天大之间，更优选为1天大至8天大之间，更优选为1天大至7天大之间，更优选为1天大至6天大之间，更优选为1天大至5天大之间，更优选为1天大至4天大之间，更优选为1天大至3天大之间，更优选为1或2天大，最优选为1天大。如本文中所用的术语"有效剂量"("aneffectivedose")意谓(但不限于)在投予该有效剂量的胞内劳森菌抗原的动物中引发或能够引发该动物的免疫反应的抗原的量。对组合物或疫苗的"免疫学反应或免疫反应"为在宿主中对所关注的纽合物或疫苗发生细胞免疫反应及/或抗体介导的免疫反应。因此，术语"引发或能够引发免疫反应"意谓(但不限于)宿主内的免疫学过程，其特征在于反应。通常，"免疫反应，，包括(但不限于)以下作用中的一或多者产生或激活特异性针对于包括在所关注的组合物或疫苗中的抗原的抗体、B细胞、辅助性T细胞、抑制性T细胞及/或细胞毒T细胞及/或ydT细胞。宿主优选将展现治疗或保护性免疫学反应以便增强对新感染的抵抗力及/或降低疾病的临床严重性。该保护作用将藉由与如上文所述的宿主感染相关的症状的量或严重性减少或缺乏来证实。在动物体内有效于引发免疫反应或能够引发免疫反应的抗原量视疫苗的成份及投予进程而定。通常，当杀死的细菌抗原用于疫苗时，疫苗每剂量含有约103至约1(^个菌落形成单位(CFU)的量的细菌，优选每剂量含有约104至约1()S个(CFU)的细菌，更优选每剂量含有约105至约1()S个(CFU)。特别是，当经修饰的活胞内劳森菌细菌用于疫苗时(例如，命名为分离抹B3903的细菌分离抹，ATCC保藏编号PTA-4926;及命名为分离才木N34NP40wk的细菌分离抹，ATCC保藏编号55783,二者描述于WO96/39629及WO05/011731中)，待^L予易感动物的推荐剂量优选为约3.0TCIDso(组织培养半数感染剂量终点)/剂至约6.0TCIDso/剂且最优选为约4.0TCID50M'J至约5.0TCIDso/剂。在一优选实施例中，如藉由组织培养半数感染剂量终点稀释试验法(TCIDso)所测定，疫苗的滴定度为约4.9TCIDso/剂。一般而言，免疫原的量将在5与5000微克之间且在102°与109°TCID5。之间，优选在1030与1060TCIDso之间，更优选在1040与1050TCIDso之间(当使用纯化细菌时)。通常以每剂至少0.2jig抗原、优选以每剂约0.2至约400pg、更优选以每剂约0.3至约200pg、更优选以每剂约0.35至约100pg、更优选以每剂约0.4至约50(ig、更优选以每剂约0.45至约30(ig、更优选以每剂约0.6至约15昭、更优选以每剂约0.75至约8吗、更优选以每剂约1.0至约6吗且更优选以每剂约1.3至约3.0吗的抗原内含量投予亚单位疫苗。如本文中所用的术语"增强性保护，，意谓(但不限于)经接种动物组与未接种对照动物组相比较，在前者中一或多种与胞内劳森菌感染有关的临床症状(交叉损害频率等)在统计上显著的降低。术语"临床症状在统计上显著的降低"意谓(但不限于)在以传染性胞内劳森菌攻击后，在经接种动物组中至少一种临床症状的发生频率比在未接种对照组中低至少20%,优选30%，更优选50%，最优选70%。如本文中所用的术语"胞内劳森菌"意谓由C.Gebhart等人，Int，l.J.ofSystemicBacteriology,第43巻，第3期，533-538(1993)及S.McOrist等人，Int，l.J.ofSystemicBacteriology,第45巻，第4期，820-825(1995)(各文献以引用的方式全文并入本文中)详述的胞内弯曲革兰氏阴性细菌且包括(i"旦不限于)WO96/39629及WO05/011731中所述的分离抹。详言之，术语"胞内劳森菌"亦意谓(但不限于)根据布达佩斯条约(BudapestTreaty)保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801UniversityBoulevard,Manassas,Virginia离抹。分别在WO96/39629及WO05/011731中描述两种分离林。术语"胞内劳森菌"亦意谓(但不限于)任何其他胞内劳森菌细菌抹或分离抹，该等细菌抹中的至少一者的免疫原性性质，尤其具有根据布达佩斯条约保藏于ATCC，10801UniversityBoulevard,Manassas,Virginia20110-2209且ATCC保藏编号为PTA4926或ATCC保藏编号为55783的分离抹中的至少一者的免疫原性性质。当一种菌抹或分离抹可至少以WO06/01294中所述的抗胞内劳森菌特异性抗体之一在一种亦描述于WO06/01294的检测试验中得以检测时，该菌抹或分离抹具有WO96/39629及WO05/011731中所述的胞内劳森菌菌抹，尤其以ATCC保藏编号PTA4926或ATCC保藏编号55783保藏的分离抹中至少一者的"免疫原性性质"。该等抗体优选是选自编号为301:39、287:6、268:29、110:9、113:2及268:18的抗体。该检测试验优选为如WO06/12949的实施例2及3中所述的三明治EUSA,而抗体110:9用作捕捉抗体及抗体268:29用作偶联抗体。WO06/12949中所揭示的所有抗体是藉由杂交瘤细胞制造，该等杂交瘤细胞根据布达佩斯条约作为专利保藏物保藏于应用农i生物学研究中心(CentreforAppliedMicrobiologyandResearch,CAMR)及欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)，Salisbury,WiltshireSP40JG,UK。保藏日期为2004年5月11日。以ECACC保藏编号04092204成功地保藏杂交瘤细胞系110:9。以ECACC保藏编号04092201成功地保藏杂交瘤细胞系113:2。以ECACC保藏编号04092202成功地保藏杂交瘤细胞系268:18。以ECACC保藏编号04092206成功地保藏杂交瘤细胞系269:29。以ECACC保藏编号04092203成功地保藏杂交瘤细^^包系287:6。以ECACC保藏编号04092205成功地保藏杂交瘤细胞系301:39。如本文中所用的术语"胞内劳森菌抗原"意谓(但不限于)包含至少一种抗原的物质的任何组合物，该抗原在投予动物时可诱发、刺激或增强对抗胞内劳森菌引起的感染的免疫反应。该胞内劳森菌抗原优选为完全胞内劳森菌细菌(尤其为灭活形式)(所谓杀死的细菌)、经修饰的活的或减毒的胞内劳森菌细菌(所谓MLB)、胞内劳森菌的任何亚单位、多肽或组分或任何嵌合载体(各自包含胞内劳森菌的至少一个免疫原性氨基酸序列)。如本文中所用的术语"免疫原性蛋白"、"免疫原性多肽"或"免疫原性氨基酸序列"是指在宿主中引发对抗包含该免疫原性蛋白、免疫原性多肽或免疫原性氨基酸序列的病原体的免疫反应的任何氨基酸序列。特别是，胞内劳森菌的"免疫原性蛋白"、"免疫原性多肽"或"免疫原性氨基酸序列"意谓编码在投予该"免疫原性蛋白"、"免疫原性多肽"或"免疫原性氨基酸序列"的宿主中引发对抗胞内劳森菌的免疫学反应的抗原的任何氨基酸序列。如本文中所用的"免疫原性蛋白"、"免疫原性多肽"或"免疫原性氨基酸序列"包括(但不限于)任何蛋白的全长序列、其类似物或其免疫原性片段。术语"免疫原性片段"意谓包括一或多个表位，且因此引发对抗相关病原体的免疫学反应的蛋白的片段。可使用本领域熟知的多种表位定位技术来识别此等片段。例如，参见EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecularBiology,第66巻(GlennE.Morris编,1996)HumanaPress,Totowa，NewJersey。(其教示及内容以引用方式并入本文中。)举例而言，藉由在固体支持物上同时合成大量肽(该等肽对应于蛋白分子的部分)及当该等肽仍附着至该等支持物时使该等肽与抗体反应可测定线性表位。此等技术在本领域已知且描述于例如美国专利第4,708,871号；Geysen等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:3998-4002;Geysen等人(1986)Molec.Immunol.23:709-715中。(其教示及内容以引用方式并入本文中。)类似地，藉由测定氨基酸的空间构象(诸如藉由例如X光晶体分析术及二维核磁共振)来容易i也石角定才勾象表4立(conformationalepitope)。i"列i口参见上述EpitopeMappingProtocol。在该定义中亦包括合成抗原，例如多表位(polyepitope)、侧翼表位及其它重组或合成得到的抗原。例如，参见Bergmann等人(1993)Eur,丄liImmunol.23:2777-2781;Bergmann等人(1996)，J.Immunol.157:3242-3249;Suhrbier，A.(1997),Immunol,andCellBiol.75:402-408;Gardner等人，(1998)12thWorldAIDSConference,Geneva,Switzerland,6月28日画7月3日，1998。(其教示及内容以引用方式并入本文中。)合适胞内劳森菌抗原包括(但不限于)彼等在EP1219711、US6,605,696、WO96/39629、WO97/20050、WO00/69903、WO00/69904、WO00/69卯5、WO00/69906、WO02/38594、WO02/26250、WO03/006665、WO04/033631、WO05/026200及WO05/011731中所述的抗原。因此，根据本发明供使用的疫苗包括如上所述的任何胞内劳森菌抗原，其引起或能够引起对抗胞内劳森菌的免疫反应。该疫苗优选至少提供对抗胞内劳森菌的增强性保护。因此，根据另一方面，本发明是关于一种接种年幼动物以对抗胞内劳森菌感染的方法，该方法包含自一(l)天大开始投予该年幼动物有效剂量的胞内劳森菌抗原的步骤，其中该胞内劳森菌抗原是选自由活的经修饰的胞内劳森菌细菌、杀死的胞内劳森菌细菌或胞内劳森菌细菌的一或多个亚单位组成的组。该疫苗优选包含经修饰的活胞内劳森菌细菌。疫苗更优选为EnterisolIleitisB3903(BoehringerIngelheimVetmedica,Inc.)。如上所述，接种优选在1天大至20天大时，更优选在1天大至10天大时，更优选在1天大至9天大时，更优选在1天大至8天大时，更优选在1天大至7天大时，更优选在l天大至6天大时，更优选在1天大至5天大时，更优选在1天大至4天大时，更优选在1天大至3天大时，更优选在1或2天大时，且最优选在1天大时发生。根据另一方面，本发明提供一种用于接种动物以对抗胞内劳森菌感染的方法，该方法包含投予该动物有效剂量的胞内劳森菌抗原的步骤，其中该动物具有或暴露于优选为每毫升至少1:4,更优选为1:16以上，更优选为1:64以上，更优选为1:128以上，更优选为1:256以上，更优选为1:512以上，且最优选为1:1024以上的可检测抗胞内劳森菌抗体滴定度，且其中该胞内劳森菌抗原是选自由活的经修饰的胞内劳森菌细菌、杀死的胞内劳森菌细菌或胞内劳森菌细菌的一或多个亚单位组成的组。该疫苗优选包含经修饰的活胞内劳森菌细菌。疫苗更优选为EnterisolIleitisB3903(BoehringerIngelheimVetmedica,Inc.)。此外，彼等抗体优选为母体来源的抗体。彼等抗体滴定度更优选在接种日存在于彼动物体内。根据另一方面，本发明提供一种用于接种年幼动物以对抗胞内劳森菌感染的方法，该方法包含投予该年幼动物有效剂量的胞内劳森菌抗原的步骤，其中该年幼动物具有或暴露于优选为每毫升至少1:4，更优选为1:16以上，更优选为1:64以上，更优选为1:128以上，更优选为1:256，更优选为1:512以上，最优选为1:1024以上的可检测抗胞内劳森菌抗体滴定度，且其中该胞内劳森菌抗原是选自由活的经修饰的胞内劳森菌细菌、杀死的胞内劳森菌细菌或胞内劳森菌细菌的一或多个亚单位组成的组。该疫苗优选包含经修饰的活胞内劳森菌细菌。疫苗更优选为EnterisolIleitisB3903(BoehringerIngelheimVetmedica，Inc.)。jt匕夕卜，4皮等4元体优选为母体来源的抗体。彼等抗体滴定度更优选在接种日存在于纟皮动物体内。该年幼动物的年龄优选为1天大至20天大之间。该年幼动物的年龄更优选为1天大至10天大之间，更优选为1天大至9天大之间，更优选为1天大至8天大之间，更优选为1天大至7天大之间，更优选为1天大至6天大之间，更优选为1天大至5天大之间，更优选为1天大至4天大之间，更优选为1天大至3天大之间，更优选为1或2天大，最优选为1天大。根据另一方面，本发明是关于一种接种年幼动物以对抗胞内劳森菌感染的方法，该方法包含以下步骤自一(l)天大开始投予该年幼动物约3.0TCIDs。至约6.0TCIDs。的剂量的活的经修饰的胞内劳森菌细菌。优选地，该纟田菌为疫苗EnterisolIleitisB3903(BoehringerIngelheimVetmedica,Inc.)中所包括的细菌。如上所述，接种优选在1天大至20天大时，更优选在1天大至10天大时，更优选在1天大至9天大时，更优选在1天大至8天大时，更优选在1天大至7天大时，更优选在1天大至6天大时，更优选在1天大至5天大时，更优选在1天大至4天大时，更优选在1天大至3天大时，更优选在1或2天大时，且最优选在1天大时发生。因此，根据另一方面，本发明是关于一种接种动物以对抗胞内劳森菌感染的方法，该方法包含以下步骤投予该动物约3.0TCID5q至约6.0TCID50的剂量的活的经修饰的胞内劳森菌细菌，其中该动物具有或暴露于优选为每毫升至少1:4,更优选为1:16以上，更优选为1:64以上，更优选为1:128以上，更优选为1:256，更优选为1:512以上，且最优选为1:1024以上的可;险测抗胞内劳森菌抗体滴定度。该细菌优选为疫苗EnterisolIleitis13B3903(BoehringerIngelheimVetmedica,Inc.)中所包4舌的细菌。因此，根据另一方面，本发明是关于一种接种年幼动物以对抗胞内劳森菌感染的方法，该方法包含以下步骤投予该年幼动物约3.0TCIDs。至约6.0TCID50的剂量的活的经修饰的胞内劳森菌细菌，其中该年幼动物具有或暴露于优选为每毫升至少1:4,更优选为1:16以上，更优选为1:64以上，更优选为1:128以上，更优选为1:256,更优选为1:512以上，且最优选为1:1024以上的可4企测抗胞内劳森菌抗体滴定度。该细菌优选为疫苗EnterisolIleitisB3903(BoehringerIngelheimVetmedica,Inc.)中所包括的纟田菌。如上所述，接种优选在1天大至20天大时，更优选在1天大至10天大时，更优选在1天大至9天大时，更优选在1天大至8天大时，更优选在1天大至7天大时，更优选在1天大至6天大时，更优选在1天大至5天大时，更优选在1天大至4天大时，更优选在1天大至3天大时，更优选在1或2天大时，且最优选在1天大时发生。根据另一方面，本发明是关于一种接种年幼动物以对抗胞内劳森菌感染的方法，该方法包含自一(l)天大开始投予该年幼动物有效剂量的胞内劳森菌抗原的步骤，其中该年幼动物对胞内劳森菌及抗胞内劳森菌母体抗体呈阴性。如上所述，接种优选在1天大至20天大时，更优选在1天大至10天大时，更优选在1天大至9天大时，更优选在1天大至8天大时，更优选在1天大至7天大时，更优选在1天大至6天大时，更优选在1天大至5天大时，更优选在1天大至4天大时，更优选在1天大至3天大时，更优选在1或2天大时，且最优选在1天大时发生。根据另一方面，本发明亦是关于一种胞内劳森菌抗原的新颖医疗用途，其用于制备在一(l)天大时开始对年幼动物接种以对抗胞内劳森菌感染的药剂(优选为疫苗组合物)，其中该年幼动物是在一(l)天大或一天大以上时经有效剂量的该胞内劳森菌抗原接种。该接种优选在1天大至20天大时，更优选在1天大至10天大时，更优选在1天大至9天大时，更优选在1天大至8天大时，更优选在1天大至7天大时，更优选在1天大至6天大时，更优选在1天大至5天大时，更优选在1天大至4天大时，更优选在1天大至3天大时，更优选在1或2天大时，且最优选在1天大时发生。根据另一方面，本发明亦是关于一种胞内劳森菌抗原的新医疗用途，其用于制备接种动物以对抗胞内劳森菌感染的药剂(优选为疫苗组合物)，其中该动物具有或暴露于优选为每毫升至少1:4,更优选为1:16以上，更优选为1:64以上，更优选为1:128以上，更优选为1:256,更优选为1:512以上，且最优选为1:1024以上的可检测抗胞内劳森菌抗体滴定度。根据另一方面，本发明亦是关于一种胞内劳森菌抗原的新颖医疗用途，其用于制备接种年幼动物以对抗胞内劳森菌感染的药剂(优选为疫苗组合物)，其中该年幼动物具有或暴露于优选为每毫升至少1:4，更优选为1:16以上，更优选为1:64以上，更优选为1:128以上，更优选为1:256,更优选为1:512以上，且最优选为1:1024以上的可检测抗胞内劳森菌抗体滴定度。该接种优选在1天大至20天大时，更优选在1天大至10天大时，更优选在1天大至9天大时，更优选在1天大至8天大时，更优选在1天大至7天大时，更优选在1天大至6天大时，更优选在1天大至5天大时，更优选在1天大至4天大时，更优选在1天大至3天大时，更优选在1或2天大时，且最优选在l天大时发生。根据上述该等医疗用途的另一方面，该胞内劳森菌抗原是选自由活的经修饰的胞内劳森菌细菌、杀死的胞内劳森菌细菌或胞内劳森菌细菌的一或多个亚单位组成的组。该胞内劳森菌抗原优选为活的经修饰的胞内劳森菌细菌。更优选地，该等动物是经约3.0TCIDso至约6.0TCID5o的剂量的活的经修饰的胞内劳森菌细菌投予。人员所知。举例而言，熟习此项技术者能够确定该组合物中可包含的额外组分(亦参见Remington'sPharmaceuticalSciences.(1990).第18版，MackPubl.Easton)。专业人员可使用已知的可注射、生理学上可接受的无菌溶液。对于制备适于非经肠注射或灌注的即用(ready-to-use)溶液而言，诸如盐水或相应血浆蛋白溶液之类等渗水溶液可容易地获得。该等疫苗组合物可以冻干态或干燥制剂形式存在，例如，作为组配试剂盒(kitsofparts),其可在使用之前在无菌条件下直接用已知的可注射溶液重建。此外，本发明的免疫原性及疫苗组合物可包括一或多种兽医可接受的载剂。如本文中所用的"兽医可接受的载剂"包括任何溶剂、分散介质、包衣剂、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌剂及抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂及其类似物。"稀释剂"可包括水、盐水(saline)、葡萄糖、乙醇、甘油及其类似物。等渗剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇及乳糖等。稳定剂包括白蛋白及乙二胺四乙酸的碱盐等。如本文中所使用的"佐剂"可包括氪氧化铝及硫酸铝，皂素例如QuilA、QS-21(CambridgeBiotechInc.,CambridgeMA)、GPI-0100(GalenicaPharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL)，油包水乳'液，7K包油孝L液，？jc包油包水乳液。乳液可特别地基于下列物质轻液态石蜡油(欧洲药典类型)；类异戊二烯油诸如角蓋烷或角豊烯；由烯烃，尤其为异丁烯或癸烯低聚得到的油；含有直链烷基的酸类或醇类的酯类，更尤其为植物油、油酸乙酯、丙二醇二(辛酸〃务酸)酯、三(辛酸/癸酸)甘油酯或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯类，尤其为异硬脂酸酯类。将油与乳化剂组合使用以形成乳液。该等乳化剂优选为非离子表现活性剂，尤其为视情况经乙氧基化的脱水山梨糖醇酯、二缩甘露醇酯(例如无水甘露糖醇油酸酯)、乙二醇酯、聚甘油酯、丙二醇酯及油酸、异硬脂酸、蓖麻酸或羟基硬脂酸的酯，以及聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(尤其为Pluronic产物，特别为L121)。参见Hunter等人，TheTheoryandPracticalApplicationofAdjuvants(Stewart-Tull，D.E.S.编)。JohnWiley及Sons,NY,第51-94页(1995)及Todd等人，Vaccine15:564-570(1997)。(其教示及内容据此以引用方式并入本文。)举例而言，有可能4吏用由M.Powell及M.Newman所编的"VaccineDesign,TheSubunitandAdjuvantApproach"，PlenumPress,1995的第147页上所述的SPT乳液及同一本书的第183页上所述的乳液MF59。(其教示及内容据此以引用方式并入本文。)佐剂的另一实例为选自丙烯酸或曱基丙烯酸的聚合物及顺丁烯二酸酐与烯基衍生物的共聚物的化合物。有利的佐剂化合物为联的丙烯酸或曱基丙烯酸的聚合物，尤其与糖类或多元醇类的聚烯基醚交联的丙烯酸或曱基丙烯酸的聚合物。此等化合物藉由术语卡波姆(carbomer)而为人所知(Phameuropa第8巻，第2期，1996年6月)。熟悉此项4支术者亦可参考美国专利第2，909，462号，其描述此类与具有至少3个羟基，优选为不超过8个羟基的多羟基化化合物交联的丙烯酸聚合物，至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂族基团置换。优选基团为彼等含有2至4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基及其他烯系不饱和基团。该等不饱和基团本身可含有诸如曱基等其他取代基。以卡巴浦尔(Carbopol)为名称所出售的产品(BFGoodrich,Ohio,USA)特别适合。其与烯丙基蔗糖或与烯丙基异戊四醇交联。其中，可提及Carbopol974P、934P及971P。最优选4吏用Carbopol9"P。在顺丁烯二酸酐与烯基书f生物的共聚物中，有共聚物EMA(Monsanto),其为顺丁煤二酸酐与乙烯的共聚物。此等聚合物在水中的溶解产生酸性溶液，其将被中和，优选中和至生理pH值以产生佐剂溶液，再向该佐剂溶液中并入免疫原性组合物、免疫组合物或疫苗组合物本身。另外合适的佐剂包括(但不限于)RIBI佐剂系统(RibiInc.)、嵌段共聚物(CytRx，AtlantaGA)、SAF-M(Chiron,EmeryvilleCA)、单磷酰基脂质A、阿夫立定(Avridine)脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌(E.coli)的热不稳定肠毒素(重组或其他方式)、霍乱毒素、IMS1314或胞壁酰基二肽等。优选以每剂量约100叱至约10mg的量添加佐剂。更优选以每剂量约100吗至约10mg的量添加佐剂。更优选以每剂量约500ng至约5mg的量添加佐剂。更优选以每剂量约750jig至约2.5mg的量添加佐剂。最优选以每剂量约lmg的量添加佐剂。疫苗组合物可进一步包括一或多种其他免疫调节剂，诸如白介素、干扰素或其他细胞因子。疫苗组合物亦可包括遗传霉素(Gentamicin)及硫柳汞(Merthiolate)。虽然熟习技工可容易地确定适用于本发明的上下文中的佐剂及添加剂的量及浓度，但本发明涵盖了在每毫升疫苗组合物剂量中包含约50|ig至约2000吗佐剂且优选为约250吗佐剂的组合物。在另一优选实施例中，本发明涵盖包含约lfig/ml至约60吗/ml的抗生素且更优选为小于约30[ig/ml的抗生素的疫苗组合物。以任何习知方式，最优选经由经口灌服(oraldrench)将疫苗投予动物，优选为哺乳动物且更优选为猪。待投予的剂量将视具体病例而定，但在任的量:、、、'"、5'、、u'、'通常将本发明的疫苗以一或多个剂量投予易感动物，优选投予年幼小猪及/或具有抗胞内劳森菌抗体或暴露于抗胞内劳森菌抗体的小猪。可在最初接种之后以2至4周间隔1或2次投予活的或杀死的疫苗。对于减毒活疫苗而言，一剂为优选。如上所述，第一次或单一投予优选在1天大至20天大时，更优选在1天大至10天大时，更优选在1天大至9天大时，更优选在1天大至8天大时，更优选在1天大至7天大时，更优选在1天大至6天大时，更优选在1天大至5天大时，更优选在1天大至4天大时，更优选在1天大至3天大时，更优选在1或2天大时，且最优选在1天大时进行。若需要或必需第二次投予，则在第一次投予疫苗之后约1至约4周进行第二次投予。根据另一方面，在任何先前接种投予之后以3至12个月的间隔进行再接种。优选以6个月至一年的间隔进行随后疫苗剂量的投予。在另一优选方面中，在约2至3周龄之前接种的动物应再接种。优选以一年的间隔进行随后疫苗剂量的投予。在以下实施例中进一步描述本发明，提供以下实施例仅为说明的目的，不应解释为具有限制性。实际上，本发明的其他变体应为熟习此项才支术者显而易见。本文中所引用的所有公开案及专利是以引用的方式全文并入。实施例实施例1在来自母猪(生育不止i窝)及初产母猪(第一窝)的初乳及乳液样品中检测对胞内劳森菌具特异性的抗体材料与方法在产仔后24h内自25只母猪及25只初产母猪(gilt)取得初乳样品。在哺乳期第一周及第二周自相同猪取得乳液样品。在4。C两次将样品以2000g离心10min以分离乳液的脂肪部分。将样品的水样部分储存在-20。C下直至分析。在IFAT中自l:20最初稀释度开始连续2倍稀释后，检测抗胞内劳森菌的特异性抗体。除对于各样品而言，将FITC标记抗猪IgG、IgM及IgA抗体用于检测不同类Ig之外，如实施例5中及别处所述进行IFAT。在产仔后24小时内取得来自母猪及初产母猪的平行血样。根据制造商的指示以EnterisolIleitisELISA检验此等样品。结果图1中概述在初乳样品中抗体检测的结果。该图展示在IFAT中对于不同稀释度的IgG、IgM及IgA得到阳性结果的样品数目。在所有检验中初乳样品都不是阴性。仅一个来自母猪的初乳样品及一个来自初产母猪的初乳18样品为IgG阴性，而在一个来自初产母猪的样品中及三个来自母猪的样品未检测出特异性IgM。分别自初产母猪及母猪获得的25个样品中八个的对胞内劳森菌具特异性的IgA得分为阴性。在哺乳期第二周获得的乳液样品中，仅两个来自母猪的样品的IgG得到1:20的滴定度，而一个来自初产母猪的样品的IgA得分为阳性(l:20)。在哺乳期第三周，来自一只母猪及三只初产母猪的样品在1:20的稀释度得到IgG阳性结果。所有其他来自哺乳期第二周及第三周的样品测得为IgG、IgM及IgA阴性。所有在产仔后24h内取自母猪的血样在EnterisofIleitisELISA中为阳性，而自初产母猪获得的25个样品中2个样品得到阴性结果。来自血样的结果与来自初乳样品的结果之间无明显相关性。可总结出，在来自母猪及初产母猪的初乳中，存在对胞内劳森菌具特异性的IgG、IgM及IgA抗体。然而，在产仔后一周取得的乳液样品中，仅在6%的样品中可检测到低滴定度的胞内劳森菌特异性抗体。参考文献1.McOrist,S,等人(2003)PigJ.51,26-352.Collins,A.M.等人(2001)AllenD.LemanSwine,Conference3.Holyoake,P.K.等人(1994)JClinMicrobiol32,1980-1985,Kruse,P.E.(1983)Ann.Rech.Vet.14,349-3534.Bollwein,J.(2004)Doctoralthesis,LMU,Munich5.Knittel,J.P.等人(1998)AJVR59,722-726实施例2在途经胃肠道期间乳液抗体对胞内劳森菌的直接影响材料与方法在出生后24h内自母猪及初产母猪取得初乳样品。在哺乳期第一周及第二周取得母猪乳液样品。在4。C两次将样品以2000g离心lOmin以分离乳液的脂肪部分。将样品的水样部分储存在-20。C直至分析。在IFAT中自1:20最初稀释度开始连续2倍稀释后，；险测抗胞内劳森菌的特异性抗体。除对于各样品而言，将FITC标记抗猪IgG、IgM及IgA抗体用于检测不同类Ig之外，如实施例5中及别处(5)所述进行IFAT。基于IFAT结果选择具有不同Ig含量的乳液样品。以不同稀释度在初乳或母猪乳液样品中在室温培育胞内劳森菌培养物。将每一样品测试两次。在培育开始时(O小时)及在4小时后在室温量测胞内劳森菌的组织培养半数感染剂量(TCID50)。培养物的未稀释样品充当测试效能的对照。每次测TCIDso值时，使样品20次通过20号针来均质化。McCoy细胞在75cm"且织培养烧瓶中用DMEM/HAM，sF12培养基培养至100%长满的单层，将细胞用胰蛋白酶消化，分装于四个96孔微滴板上。将10"至10-7连续稀释的样品各接种六次于新鲜McCoy细胞上。在37。C在微嗜氧性条件下培育6天后，藉由冰冷丙酮/甲醇(50:50,v/v)固定细胞。藉由使用特异性单克隆抗劳森菌抗体且随后用FITC标记抗小鼠抗体进行标记，来检测胞内劳森菌的生长。将含有一或多个带5个或更多荧光胞内劳森菌的McCoy细胞的各孔判为阳性。藉由使用根据Spearmann及Karber(6)的50%终点公式求出TCID50。结果图1中概述来自TCID5o测试的结果及8个初乳(第l-5号)及乳液(第6-8号)样品的IgG、IgA及IgM滴定度。在所有实验中，培养物的对照样品得到所预期的TCID5o值。在室温培育4小时期间，所述测试无一发生胞内劳森菌滴定度的实质变化。因此，如此研究中所示，在途经胃肠道期间，母体抗体及母猪乳液似乎并不有效于灭活胞内劳森菌。参考文献1.vanAken;N.等人(2002)Proc.17thIPVS,Ames,Iowa,USA2.Kruse,P.E.(1983)Ann.Rech.Vet.14,349-3533.Collins,A.M.等人(2001)AllenD.LemanSwine，Conference4.Holyoake,P.K.等人(1994)JClinMicrobiol32,第1980-1985页5.Knittel，J.P.等人(1998)AJVR59,722-726.6.Karber，G.(1931)Arch.exp.Path.Pha腿.162,4807.Mauch，C.H.Y.及G.Bilkei(2004)Vet.Rec.155,532实施例3接种一天大的小猪的抗胞内劳森菌感染功效材料与方法本研究由三个涉及1天大的胞内劳森菌阴性及抗劳森菌母体抗体阴性哺乳小猪的实验组组成。在研究第0天，第1组的20只小猪各自(被接种)接受口服剂量的EnterisolIleitis(疫苗分离抹B3903)(按说明书(3)指示)。第2组(对照)的二十只小猪接受由生长培养基组成的安慰剂。使所有组的小猪在研究第20天断奶。在第21天，第1组及第2组的小猪经由管伺(gavage)而接受含有3.5xl(f个毒性胞内劳森菌2688/2685的小肠匀浆物。第三组的IO只猪(严格对照)在研究期间任何时期未接受疫苗、安慰剂或细菌攻击。在第42天，人道地使所有组的猪安乐死且进行尸体解剖。主要功效参数包括特别由胞内劳森菌所引起的回肠、盲肠及结肠的肉眼及微观损害。次要参数包括临床健康状态(行为、体况及粪便硬度)、平均每日体重增加量、粪便排菌(PCR)及血清转化(IFAT)(1)。结果在尸体解剖(第42天)时，与未接种的对照猪(回肠=1.16、盲肠=0.42、结肠=0.16)相比，受接种者(第1组)具有显著(pO.0003)较小的平均肉眼损害得分(回肠(0.21)、盲肠(0.0)及结肠(0.0))。与经接种猪(l."cm)相比，在对照组中小肠损害平均总长度(回肠、盲肠及结肠)显著(pO.0001)较高(8.89cm)。第3组(严格对照组)的平均肉眼肠损害得分为0.22,被认为是正常的。与经接种猪(0,53)相比，在对照组中回肠的劳森菌特异性平均微观损害得分显著(pO.02)较高(2.47)。此外，与经接种组相比，在对照组中总微观损害得分(pO.006)及IHC阳性猪百分比(pO.0001)显著较高。在盲肠及结肠方面，对照组具有比经接种组略高一点的平均微观损害得分及IHC阳性动物百分比(p〉0.05)。显著地(p0.05),与经接种组相比，细菌攻击(第35天)2周后较多对照猪为PCR阳性。在研究最后一天(第42天)，与彼等经接种组的猪(3/19)相比，对照组的猪(8/19)排出略多一点的胞内劳森菌(pX).05)。在研究期间第1组与第2组之间平均每日体重增加量或平均临床得分无显著(pX).05)差异。总而言之，主要功效参数(肉眼及微观小肠损害进展)表明，当对1天大、母体抗体阴性、未接触过劳森菌的小猪投予时，单一口服剂量的EnterisolIleitis有效对抗毒性细菌攻击。在此研究中，哺乳期间初乳及乳液中潜在的非劳森菌特异性催乳特性不干扰或妨碍疫苗对抗毒性胞内劳森菌攻击的效力。表l.胞内劳森菌粪便排菌者的比率。_组"且ID第0至21曰第28曰第35曰第42曰_PCR阳性PCR阳性PCR阳性PCR阳性<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>a'b相同字母表示无显著差异(p0.05)。0严格对照组未作统计分析。*各组有一只猪由于与胞内劳森菌无关的不良健康状态而被移除。参考文献1.McOrist等人(l993)InfectionandImmunity61:4286-42922.Knittel等人(1998)AmJVetRes59:722-726.3.Kroll等人(2004)AmJVetRes65:559-5654.Mauch及Bilkei(2004)VetRec155:5325.Marsteller等人(2003).SwineHealthProd11:127-1306.Stege等人(2004).VetMicro104:197-206实施例4用于检测及量化抗胞内劳森菌抗体的IFAT材料与方法在研究开始之前，将16只健康、怀孕及胞内劳森菌阴性母猪随机分为2组8只为超免疫组(A组)，8只为安慰剂投予对照组(B组)。在产仔之前倒数第55、35及14天，A组的各只母猪以市售EnterisolIleitis藉由直接经口灌服进行超免疫。用此方法投予疫苗剂涉及使用10ml无菌塑料注射器将疫苗应用于口腔后部。对照组(B组)接受等剂量的由悬浮于生长培养基中的未感染McCoy细胞组成的安慰剂。使A组怀孕母猪超免疫以求在产仔之前诱导高水平的母体免疫力。使每个怀孕母猪组住在多个分开的室中(以避免交叉污染)但处于相同条件(温度、通风及猪栏(pen)大小)。将每个室的母猪关在相同猪栏中。尽管研究调查者努力使受孕及产仔日期一致，但母猪并不都在同一天产仔。实情为，产仔发生在10天期间。为防止出现多个接种日及细菌攻击曰以致该研究中猪群之间变动过大，将产仔期间的平均产仔日期确定为研究的第0天。因此，在接种时(第21天)猪为3周±5天大。在第21天，按窝(litter)拣选100只健康、断奶小猪且随机分为六个处理组。住所限制及条件类似于上述母猪组。将超免疫母猪(A组)所生的小猪随机分至第1至3组，并在此后研究中称其为"超免疫来源，，小猪。将对照母猪(B组)所生的小猪随机分至第4至6组，并在此后研究中称其为"安慰剂来源"小猪。第1组及第4组(分别为20只猪/组)藉由直接经口灌服给予单一2ml剂量的EnterisolIleitis。第2组及第5组(分别为20只猪/组)给予等剂量的安慰剂(未感染的McCoy细胞+培养基)。第3组及第6组(IO只猪/组)为"严格阴性对照组"，在此研究期间其不接受疫苗或安慰剂处理，且不受细菌攻击。在断奶期后第22天，人道地使母猪安乐死且进行尸体解剖以用于评估由于PE引起的小肠损害进展。在研究的第42天，第1、2、4及5组经由胃内管饲接受每剂量lxl073TCID5o的异源毒性纯培养物胞内劳森菌分离抹N101494。细菌攻击的21天后，每天检验所有小猪的与PE相关的临床症状、腹泻、行为及体况，根据严重程度给出1至4级的评分(1=临床正常；4=严重疾病)。在研究第21、42及63天将猪称重以计算每组猪的平均每日体重增加量。计算平均每曰体重增加量(ADWG)以分析与猪正常生长性能有关的处理效果。猪在最初称重以获得在接受疫苗或安慰剂处理之前的组平均体重基数。发现所有组大小均匀(差异0.63公斤/猪)。组间第一关键ADWG评估时期发生于第21天(接种)至第42天(细菌攻击)，以测量疫苗接种或安慰剂接种的即刻效果。第二评估时期为第42天至63天(尸体解剖)，以测量以毒性纯培养物胞内劳森菌攻击的效果。于PE引起的小肠损害进展。结果母体抗体检测A组(超免疫)母猪在产仔期间在血清及初乳中检测到胞内劳森菌特异性IgG、IgA及IgM抗体。产仔时，63%的A组母猪(5只/8只母猪)对抗劳森菌IgG抗体为血清抗体阳性，而B组(对照)中0%的母猪(0/8)为阳性。此夕卜，A组母猪所生小猪仅在产仔日(第0天)至5周龄(第28天)时检测到血清IgG抗体，见图1。A组母猪分别有50。/。、75%及12.5%在初乳中检测到抗劳森菌IgG、IgA及IgM。A组母猪的初乳中平均抗体浓度为l:14(IgG，范围=1至1:64)、l:10(IgA，范围=1至l:32)及l:4(IgM，范围=1至1:4)。B组B组母猪中的一只猪在1:16的滴定度为IgA阳性。母体保护比较第2組(A组母猪所生猪)与第5组(B组母猪所生猪)中未接种的对照猪，以评估经疫苗超免疫的母猪(A组母猪)对抗毒性胞内劳森菌暴露的潜在母体保护作用。表1中概述所有组的平均肉眼及微观损害得分。与第2组猪(27.5°/。)相比，第5组猪(77%)的回肠及结肠中劳森菌特异性损害百分比较高。在研究的第63天，与第5组相比，第2组猪的回肠平均肉眼损害得分以及回肠及结肠平均微观(IHC)损害得分都显著(pO.05)较低。在研究的第21天(接种)至第42天(细菌攻击)，在任一组的粪便中由PCR未检测到胞内劳森菌排出，见图3。第2及第5组的粪便从第49天开始呈PCR阳性，且分别有5-25%及15-72%的在此期间排出胞内劳森菌的猪保持阳性直至第63天(研究终止)。在研究的第63天，与第5组(72%)相比，第2组中藉由PCR检测到显著(pO.05)较少的粪便排出(25。/。)。在研究第63天，与第2组(25%)相比，第5组猪的回肠中发现较高的组织PCR阳性百分比(45%)。第2组猪在扁桃体、肠系膜淋巴结及结肠中为胞内劳森菌PCR阴性。如上文第3.4节所述，在第5组猪的结肠及肠系膜淋巴组织中观察到不同PCR阳性。表2中概述所有测试组间平均体重增加量的比较。在第21天(接种)，第2组与第5组间平均初始体重一致，猪重分别为6.35及6.10公斤/猪。第21天(接种)至第42天(细菌攻击)，第2組(0.40公斤/猪)与第5组(0.41公斤/猪)间ADWG无显著差异。然而，在研究的第42天(细菌攻击)至第63天(研究终止)的21天评估期期间，与第5组猪(0.40公斤/猪)相比，第2组猪(0.46公斤/猪)的ADWG显著(pO.05)较高。超免疫猪中的疫苗功效将第1组中以EnterisolIleitis接种的猪与第2组中未接种的对照猪进行比较，以证实，可藉由评估3周龄的猪接种后对抗PE的保护性免疫来实现面临母体免疫时的接种。两个组中的猪都来自经疫苗超免疫的母猪(A组母猪)。此外，分析第1组与第4组的经疫苗处理的猪之间的主要及次要功效参数，以判定，疫苗对抗毒性胞内劳森菌攻击的功效是否类似。表1中概述所有组的平均肉眼及微观损害得分。与第1组猪(12.5%)相比，第2组猪(27,5%)的回肠及结肠中劳森菌特异性损害百分比较高。在研究的第63天，与第2组相比，第1组猪的平均肉眼损害得分(回肠)显著(pO.0》较低，且平均微观(IHC)损害得分(回肠及结肠)数值较低。此外，在接受接种的猪(第1组及第4组)中平均肉眼与微观损害得分或损害严重程度间无显著差异。在研究的第21天(接种)至第35天期间，在任一组(l或2组)的粪便中藉由PCR未检测到胞内劳森菌排出，见图3。第1组猪的粪便从第42天(细菌攻击)开始呈PCR阳性，在此期间排出胞内劳森菌的猪有11-16%保持阳性直至第63天(研究终止)。第2组猪的粪便从第49天开始呈PCR阳性，在此期间排出胞内劳森菌的猪有5-25%保持阳性直至第63天(研究终止)。第4组猪直到第42天(细菌攻击)才变为劳森菌DNAPCR阳性，并将阳性保持至第63天(研究终止)，期间排出者比率从25%减少至5%。在研究期间第l组与第2组、第l组与第4组之间胞内劳森菌粪便排菌者比率无显著差异的迹象。在研究的第63天(研究终止)，与第1组(20%)相比，第2组猪的回肠中发现略高的组织PCR阳性百分比(25%)。在研究终止时，发现第4组的组织PCR阳性百分比(5%)比第1组及第2组低。第1组与第2组、第1组与第4组间PCR阳性无显著差异。所有三组猪在扁桃体、肠系膜淋巴结及结肠中对胞内劳森菌为PCR阴性。表2中概述所有测试組间平均体重增加量的比较。在第21天(接种)，第1组与第2组间平均初始体重一致，猪重分別为6.53及6.35公斤/猪。第21天，在第1组与第4组间亦观测到一致的平均体重(分别为6.53公斤/猪及6.44公斤/猪)。第21天(接种)至第42天(细菌攻击)，第1纽(0.40公斤/猪)与第2组(0.41公斤/猪)间、或第1组与第4组(0.44公斤/猪)间ADWG无显著差异。第42天(细菌攻击)至第63天(研究终止)的21天评估期期间，第1组猪(0.45公斤/猪)与第4組猪(0.51公斤/猪)的ADWG有显著差异(p0.05)。在此研究的第21天至第63天，第1组与第2组间ADWG无显著差异。实施例5用IFAT检测及量化抗胞内劳森菌抗体25藉由免疫荧光抗体测试(IFAT),使用固定于96孔聚苯乙烯微滴板上的劳森菌全抗原及针对猪IgG的FITC标记抗体(knittel等人1998)，测试来自各母猪及猪的血液的血清样品中对抗胞内劳森菌的IgG抗体的存在。藉由使用针对猪IgM及IgA的FITC标记抗体略微修改IFA测试。将此经修改的方法用于在各母猪初乳中4企测除IgG外的此等抗体，以用于测定不同劳森菌特异性免疫球蛋白的浓度。将初乳在PBS中一式两份作2倍稀释，且转移(100)Lll/孔)至两组如上所述包被了劳森菌的96孔培养;f反中。将这些板在37。C培育30分钟，接着以PBS洗涤3次。将事先已在PBS中1:200稀释的4元猪IgM或IgAFITC4禺耳关^t体(KirkegaardandPerryLaboratories,Inc.)添力口至培养板中，接着重复培育及洗涤步骤。使用UV显微术检测各种特异性抗劳森菌抗体的滴定度。计算各种免疫球蛋白的IFAT阳性百分比及平均滴定度值用于组间比较，以求出母猪间IgG、IgM及IgA初乳抗体的频率及含量。参考文献1.Knittel等人(1998)AmJVetRes59:722-726。权利要求1.一种方法，其用于接种年幼动物以对抗胞内劳森菌(L.intracellularis)感染或用于接种具有抗胞内劳森菌抗体或暴露于抗胞内劳森菌抗体的动物，该方法包括投予有效剂量的胞内劳森菌抗原的步骤。2.权利要求1的方法，其中该等动物在1天大至9天大时接种。3.权利要求1或2的方法，其中该等动物在1天大至6天大时接种。4.权利要求l-3之一的方法，其中该等动物在1或2天大时接种。5.权利要求l-4之一的方法，其中该等动物具有或暴露于每毫升血清或流体至少1:4的可检测的抗胞内劳森菌抗体滴定度。6.权利要求1-4之一的方法，其中该等动物具有或暴露于每毫升血清或流体至少1:64的可检测的抗胞内劳森菌抗体滴定度。7.权利要求1-6之一的方法，其中该胞内劳森菌抗原是选自由活的经修饰的胞内劳森菌细菌、杀死的胞内劳森菌细菌、或胞内劳森菌细菌的一或多个亚单位组成的组。8.权利要求l-6之一的方法，其中该胞内劳森菌抗原为活的经修饰的胞内劳森菌细菌。9.权利要求8的方法，其中该年幼动物是投予约3.0TCIDso至约6.0TCID5Q的剂量的该活的经修饰的胞内劳森菌细菌。10.权利要求l-9之一的方法，其中该等动物为鸟、鱼、及哺乳动物诸如牛、猪、马及灵长类动物之类。11.权利要求10的方法，其中该等动物为猪。12.胞内劳森菌抗原的用途，其用于制备接种年幼动物以对抗胞内劳森菌感染或接种具有抗胞内劳森菌抗体或暴露于抗胞内劳森菌抗体的动物的药剂，其中该等动物被接种有效剂量的该胞内劳森菌抗原。13.权利要求12的用途，该等动物在1天大至9天大时接种。14.权利要求12或13的用途，该等动物在1天大至6天大时接种。15.权利要求12-14之一的用途，其中该等动物在天或2天大时接种。16.权利要求12-15之一的用途，其中该等动物具有或暴露于每毫升血清或流体至少1:4的可一企测的抗胞内劳森菌抗体滴定度。17.权利要求12-16之一的用途，其中该等动物具有或暴露于每毫升血清或流体至少1:64的可检测的抗胞内劳森菌抗体滴定度。18.权利要求12-17之一的用途，其中该胞内劳森菌抗原是选自由活的经修饰的胞内劳森菌细菌、杀死的胞内劳森菌细菌、或胞内劳森菌细菌的一或多个亚单位组成的组。19.权利要求12-18之一的用途，其中该胞内劳森菌抗原为活的经修饰的胞内劳森菌细菌。20.权利要求19的用途，其中该年幼动物是投予约3.0TCIDso至约6.0TCID5。的剂量的该活的经修饰的胞内劳森菌细菌。21.权利要求12-20之一的用途，其中该等动物为鸟、鱼、及哺乳动物诸如牛、猪、马及灵长类动物。22.权利要求21的用途，其中该等动物为猪。全文摘要本发明提供了对年幼动物进行免疫接种以抵抗胞内劳森菌的方法，包括对该动物给予有效量的胞内劳森菌抗原的步骤。本发明还提供了对具有抗胞内劳森菌抗体或已暴露于抗胞内劳森菌抗体的动物、尤其是年幼动物进行免疫接种的方法。尤其是，这些抗胞内劳森菌抗体是来自母体的抗体。文档编号A61K39/02GK101454020SQ200780019257公开日2009年6月10日申请日期2007年5月24日优先权日2006年5月25日发明者杰里米·克罗尔申请人:贝林格尔·英格海姆维特梅迪卡有限公司