专利名称：一种新型大豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化方法
技术领域：
本发明是关于一种新型大豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化方法，属于生物药物领域。
背景技术：
大豆蛋白是肉用动物饲料的主要成分之一，近年来，它在人类饮食中的作用也越 来越受到重视。然而，大豆蛋白(对人类而言)并不是一种理想的蛋白质来源，原因是除了 氨基酸组成方面的限制之外，抗营养因子也限制了大豆蛋白的应用。 大豆胰蛋白酶抑制剂(STI)是一种多肽类或蛋白质。它对植物本身具有保护作 用，可防止大豆籽粒自身发生分解代谢，使种子处于休眠状态，能调节大豆蛋白质的合成与 分解，并具有抗虫作用，因而是大豆必需成分。然而其对人类胰蛋白酶的抑制作用而使其 成为大豆中主要抗营养因子，从而降低了大豆蛋白的营养价值。与大豆中的另一种主要抗 营养因子大豆凝血素不同，STI有很强的耐热能力。大多数经过加热的豆类食品仍然残留 20%的胰蛋白酶抑制剂。为了提高大豆对人类营养与健康的价值，需要对大豆蛋白中那些 降低其营养价值的因子有更加深刻的认识。 目前，大豆胰蛋白酶抑制剂抗营养作用主要表现在抑制胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶 活性、降低蛋白质消化吸收和造成胰腺肿大两个方面。主要是胰蛋白酶抑制因子与小肠液 中胰蛋白酶、糜蛋白酶结合，生成无活性复合物，消耗和降解胰蛋白酶，导致肠道对蛋白质 消化、吸收及利用能力下降。同时，胰蛋白酶抑制剂与肠内胰蛋白酶结合后随粪便排出体 外，使肠内胰蛋白酶数量减少。因胰蛋白酶中含有丰富含硫氨基酸，若出现这种内源补偿性 分泌和排泄，必然会造成体内含硫氨基酸内源性散失，使原本缺乏含硫氨基酸大豆及豆制 品在食用后，机体内含硫氨基酸不仅得不到有效补充，且因食用大豆或豆制品而大量消耗 和散失，导致机体内含硫氨基酸耗散性缺乏，造成体内氨基酸代谢失调或不平衡。
从大豆中已分离出两种类型蛋白抑制剂，即Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂 (BBI)和Kunitz型胰蛋白酶抑制剂(KSTI)。 Bowman-Birk酶抑制剂(BBI)是一种丝氨酸 蛋白酶抑制剂，它有两个具有不同特异性的功能性抑制域， 一个对Chymotrypsin类似物具 有抑制作用，另一个对Spetrypsin类似物具有抑制作用。它是由71个氨基酸组成的多肽， 分子量为7975，分子内有7个二硫键。Ktmitz型胰蛋白酶抑制剂属典型丝氨酸蛋白酶抑制 剂，主要集中在大豆子叶中。它的分子量约2万，分子内有2个二硫键。
近年来国外报导发现低浓度的BBI在动物体内对直肠癌、肝癌等多种癌症有抑 制作用，其中对直肠癌抑制率达100%、对肝癌抑制率为71%、对口腔上皮癌的抑制率为 86%、对肺癌的抑制率为48%。另有报导大豆中微量胰蛋白酶抑制剂对于糖尿病治疗、调节 胰岛素失调有一定效果。大豆分离蛋白生产中普遍采用的碱溶解酸沉淀的工艺。产生大量 的大豆乳清废水。大豆乳清废水中含有多种生理活性成分，如大豆乳清蛋白、胰蛋白酶抑制 剂、大豆低聚糖、异黄酮类化合物等。将此类生理活性物质回收，既可解决废水污染问题，又 可获得一定的经济效益。因此对具有强抗癌活性且毒性小的胰蛋白酶抑制剂从大豆乳清废
3水中进行分离纯化，使其成为抗癌、治疗糖尿病的新药用于临床，对环境保护和治疗癌病有 十分积极的意义。 大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法已由Kakade等人在1974年提出。由于大豆胰蛋 白酶抑制剂对热、酸环境相对稳定。 一般采用水浸酸提、沉析再经离子交换或凝胶层析纯化 制得，一般得率和纯度都不高。本发明提供了一种新的分离纯化大豆胰蛋白酶抑制剂的方 法。利用大豆胰蛋白酶抑制剂可抑制胰蛋白酶的专一性，将胰蛋白酶固定化，分离纯化大豆 乳清蛋白获得高纯度的大豆胰蛋白酶抑制剂。
发明内容
本发明的目的之一是提供了一种新型大豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化方法。
本发明的目的之二是提供了以大豆胰蛋白酶抑制剂为药用成分开发新型抗肿瘤 药物提供了了资料。 本发明的技术解决方案如下 (1)大豆胰蛋白酶抑制剂的提取和初级分离 大豆乳清废水用HC1溶液调pH，静止，收集沉淀，离心干燥，得到大豆乳清蛋白。大 豆乳清蛋白加水，用NaOH溶液调pH，水浴搅拌溶解反应，用无水硫酸铵调饱和度，水浴保温 反应，离心除沉淀，重复一次。将沉淀先用蒸馏水透析，再用磷酸缓冲液透析去盐。
透析溶液上离子交换柱，用的HC1洗脱，收集蛋白组分。合并洗脱液减压浓縮至原 体积1/3，用NaOH溶液调pH，再上离子交换柱用磷酸缓冲液洗脱，收集蛋白组分。
(2)固定化胰蛋白酶制备 碱性苯乙烯阴离子交换树脂经酸、碱、乙醇、去离子水洗活化后待用。取胰蛋白酶 溶于的磷酸缓冲液与处理过的树脂混合，缓慢搅拌吸附，加戊二醇搅拌均匀，交联，用的磷 酸缓冲液洗涤至液体无酶活性。
(3)胰蛋白酶抑制剂纯化 合并有胰蛋白酶活性的洗脱液，减压浓縮至原体积1/3。用HC1溶液调pH，上固定 化酶柱，HCl溶液洗脱，在280nm测蛋白质吸收值，至无蛋白吸收峰为止。再用含有NaCl、 CaCl2和异丙醇的HCl溶液洗脱，收集蛋白组分。将得到的洗脱液经浓縮、透析、真空干燥， 得到白色粉末物质。 本发明利用固定化酶的专一性分离大豆胰蛋白酶抑制剂，该方法操作简便、费用 低。该发明的技术关键在于胰蛋白酶的固定化并保持酶的高活力.使大豆胰蛋白酶抑制剂 与固定化胰蛋白酶充分结合，进而用混合溶剂洗脱下来，获得了高纯度的产品。得到的白色 粉末物质具有强抗癌活性且毒性小，它有望成为一种抗癌、治疗糖尿病的新药用于临床，并 且对环境保护和治疗癌症均有十分积极的意义。
权利要求
一种新型大豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化方法，其特征在于包括以下步骤(1)大豆胰蛋白酶抑制剂的提取和初级分离大豆乳清废水用HCl溶液调pH，静止，收集沉淀，离心干燥，得到大豆乳清蛋白。大豆乳清蛋白加水，用NaOH溶液调pH，水浴搅拌溶解反应，用无水硫酸铵调饱和度，水浴保温反应，离心除沉淀，重复一次。将沉淀先用蒸馏水透析，再用磷酸缓冲液透析去盐。透析溶液上离子交换柱，用的HCl洗脱，收集蛋白组分。合并洗脱液减压浓缩至原体积1/3，用NaOH溶液调pH，再上离子交换柱用磷酸缓冲液洗脱，收集蛋白组分。(2)固定化胰蛋白酶制备碱性苯乙烯阴离子交换树脂经酸、碱、乙醇、去离子水洗活化后待用。取胰蛋白酶溶于的磷酸缓冲液与处理过的树脂混合，缓慢搅拌吸附，加戊二醇搅拌均匀，交联，用的磷酸缓冲液洗涤至液体无酶活性。(3)胰蛋白酶抑制剂纯化合并有胰蛋白酶活性的洗脱液，减压浓缩至原体积1/3。用HCl溶液调pH，上固定化酶柱，HCl溶液洗脱，在280nm测蛋白质吸收值，至无蛋白吸收峰为止。再用含有NaCl、CaCl2和异丙醇的HCl溶液洗脱，收集蛋白组分。将得到的洗脱液经浓缩、透析、真空干燥，得到白色粉末物质。
2. 根据权利要求(1)中所说的大豆蛋白酶抑制剂的提取和初级分离，其特征在于大 豆乳清废水用20% (v/v)HCl调pH3.0，静止6 8h;大豆乳清蛋白按照(m : v = 1 : 5)加 入水，用lmol/L NaOH调pH至4.0，温度55t:，搅拌反应时间为lh，无水硫酸铵调饱和度至 30-55%，温度55。C，保温10min ;蒸馏水透析时间20_24h，0. Olmol/L p朋.8的磷酸缓冲液 透析时间10-12h ;透析液用0. lmmol/LpH5. 0的HC1洗脱，然后0. lmol/L的NaOH调pH8. 0， 再上离子交换柱用0. lmol/L pH7. 8的磷酸缓冲液洗脱。
3. 根据权利要求(2)中所说的固定化胰蛋白酶制备，其特征在于胰蛋白酶按照 (m : v=l : 100)与0. lmol/LpH6.8的磷酸缓冲液和处理过的树脂混合，反应lh，然后加 20倍胰蛋白酶量，交联3h ;0. lmol/LpH6. 8的磷酸缓冲液洗涤。
4. 根据权利要求(3)所说的胰蛋白酶抑制剂纯化，其特征在于用O. lmol/L的HCl 调pH5. 0，固定化酶柱(柱长60cm、直径2. 5cm、装柱长度30cm) ，0. lmmol/L HCl洗脱，流速 50 60mL/h ;然后用lmol/L NaCl、0. 01mol/LCaCl2和15%异丙醇的0. Olmol/L HCl，流速 50-60ml/h。
5. 根据权利要求(3)中所说得到的白色粉末物质，其特征在于它为大豆胰蛋白酶抑制 剂，它有望成为一种抗癌、治疗糖尿病的新药。
全文摘要
本发明公开了一种新型大豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化方法。利用大豆胰蛋白酶抑制剂可抑制胰蛋白酶的专一性，将胰蛋白酶固定化，分离纯化大豆乳清废水中大豆乳清蛋白获得高纯度的大豆胰蛋白酶抑制剂。该方法操作简便、费用低并获得了高纯度的产品。该大豆蛋白酶抑制剂具有强抗癌活性且毒性小，它有望成为一种抗癌、治疗糖尿病的新药用于临床，并且对环境保护和治疗癌症均有十分积极的意义。
文档编号A61P35/00GK101759801SQ20081016297
公开日2010年6月30日 申请日期2008年12月11日 优先权日2008年12月11日
发明者吴菁, 陈群 申请人:湖州来色生物基因工程有限公司;吴菁