呈现血管发生抑制作用的抗肿瘤类萜烯药物组合物abisilin的制作方法

专利名称：呈现血管发生抑制作用的抗肿瘤类萜烯药物组合物abisilin的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学、化学和制药工业，尤其涉及通过诱发一连串抗肿瘤过程来治疗 各种起因的肿瘤疾病的抗肿瘤药物的开发，包括通过使用诱发这些过程的无毒多重活性的 药剂，即基于来自针叶树的萜烯(类异戊二烯)的用于口服给药的药物组合物Abisilinji 制血管发生、诱导内源性程序性细胞死亡、减缓肿瘤细胞增殖以及激活抗复发和抗转移作 用，所述组合物包含以下成分类单萜、类倍半萜烯、中性双萜类、双萜酸、三萜酸、酚类化合 物以及不饱和的和饱和的脂肪酸。
此外，本发明可用于治疗多种与血管发生障碍有关的疾病，主要是由眼新血管形 成引起的疾病(视网膜病变或年龄依赖性黄斑变性)以及用于治疗慢性和急性肾病(肾小 球肾炎)情况中的肾小球系膜细胞增生性障碍、银屑病、渐进性粉瘤、动脉再狭窄、糖尿病、 类风湿性关节炎、慢性哮喘、子宫内膜异位、自身免疫疾病、动脉粥样硬化或移植后动脉粥 样硬化和许多其它疾病。
背景技术：
大多数被分类为化疗药物、激素类药物或生物应答调节剂的抗肿瘤药物的使用分 析表明，它们中的大多数增强了肿瘤结节消退，而不影响转移，但在肿瘤患者中这是最常见 的死亡原因。
在一种新型的抗肿瘤药物(即抗血管发生的药物)中发现了不仅抑制原发性肿瘤 生长而且抑制其转移的可能性，其由Judas Folkman博士于1971年首次提出(Folkman，J.， Tumor Angiogenesis TherapeuticImplication,N. Engl. J. Med. 1971 ；285 :1182-6)。抗血 管发生的药物具有许多优于传统抗肿瘤的化疗药物的优点，即选择性作用、抗药性、副作 用的风险减少和毒性降低。
通过阻断肿瘤血管形成，抗血管发生药物减缓或者中止肿瘤生长，并且抑制了转 移。
存在多种用于实施这个过程的方法，因为当前所述的情况并不是具有特定调节机 制的细胞直接损伤；相反，这是具有非常许多细胞靶的普通内皮细胞活性的调节增殖和/ 或迁移的抑制、细胞分化的阻断、血管发生生长因子(酪氨酸激酶受体CHER-1)的中和、对 血管内皮生长因子(VEGF)和血管生成素/TIF受体系统的作用、VEGFR-2和VEGFR-3血管 发生生长因子及其特异性受体的抑制以及基质金属蛋白酶的抑制。
内皮细胞的正常功能反应性还使得自身容易受损，这是因为其功能同样受到机体 的其它细胞系统决定。
这种靶标的多重性使得能推出许多潜在的抗血管发生的抑制剂。然而，对于现有 技术的抗血管发生的药物，只注意到了一些必要的优点。
例如，已知阿瓦斯丁(Avastin)是最有前景的抗肿瘤药物；这是一种具有抗血管 发生作用、能够通过选择性结合血管内皮生长因子(VEGF)而减轻血管形成和抑制肿瘤生长的单克隆抗体药理学类型中的药物(美国专利no. 60542297 ；美国专利no. 6639055)。
然而，阿瓦斯丁的临床功效(其将患有转移性结肠直肠癌患者的总存活期从15. 6 个月增加到20. 3个月，而只用化疗治疗的患者只能从13. 6个月增加到17. 7个月)刺激了 更有效药物的研究。而且，对于贝伐单抗(bevacizumab)，具有很多的禁忌症和副作用，贝伐 单抗是阿瓦斯丁的活性物质，其用于胃肠穿孔、出血、动脉血栓栓塞和其它疾病的综合疗法 中。
从逻辑上讲，预期阻碍新血管形成-增强化学信号的血管发生抑制剂有效对抗任 何类型的肿瘤，因为这些是共同的过程。
阿瓦斯丁的临床试验结果证明这些理论预期是不成立的。
还有影响VEGP/VEGF受体和血管生成素/TIE受体系统功能的已知组合和组合物， 它们能够增强血管形成的抑制作用，并且可用于治疗癌症(RU 2^2221，C2，2001年6月20 日)。这些多种化合物只对抗血管发生作用的多步机制的单独方面有作用，因此只是无意义 地影响抗肿瘤药剂功效的增强。研究对血管生成素/Tie2受体系统的作用，显示仅减缓了 所诱发的肿瘤的生长(Siemeister 等，Cancer Res. 59，3185-3191，1999)。
已知邻氨基苯甲酸和硫代邻氨基苯甲酸N-芳基酰胺类抑制与肿瘤疾病和血管发 生相关的VEGF酪氨酸激酶受体Fit-I的活性。它们的使用具有无意义的治疗功效。
关于生物活性谱和来源，本发明最相关的技术在于紫杉醇(Taxol)，它是一种有效 抑制内皮细胞增殖的抗肿瘤药物，即，表示血管发生抑制剂(Klauber，N等，Cancer Res.， 57，81-86，1997)。
紫杉醇首先是基于复杂结构的双萜类而被开发的，该复杂结构的双萜类即紫杉烷 类，其于1971年从太平洋红豆杉(Taxus brevifolia Nutl)的树皮材料中分离。现在，存 在几种已知的紫杉醇及其类似物的全合成的方法(USA Al，No. 5488116，2006年1月；RU No. 2196581,2000年5月4日)。多西他赛(Taxotere)是紫杉醇的一种半合成类似物，从 欧紫杉(Taxus baccata)材料中分离，并且使用来自物种西伯利亚红松(Pinus sibirica)， 和/或物种瑞士石松(Pinus cembra)，和/或冷杉属(Abies)，和/或落叶松属(Larix)的 针叶树的海松松脂的天然类萜烯复合物(RU 2051900C1,1996年1月10日)，通过从天然产 物分离活性成分或通过半合成途径(RU 2196581C2,2000年5月4日)，形成R-四醇，所述 半合成途径使用与樟脑混合的Iabdanoid双萜酸级分，并且将所得混合物暴露于、辐射以 产生R-四醇结构。
通过以上说明的方法制备的上述化合物具有以下缺点一定程度的毒性，这是所 有药物固有的(引起中性白细胞减少症、纤维状中性白细胞减少症、感染、呕吐、腹泻、口 炎、虚弱、神经(运动)和血液并发症，等等)以及低功效，这些缺点迫使肿瘤学家寻找这些 血管发生抑制剂与其它活性药剂的组合方案，用于提供更有效的治疗。
现有技术抗血管发生类萜烯药物的这些缺点可能源自对于其制备而提出的多步 骤方案，这些方案目标在于基于部分或完全合成分离纯形式的单独活性物质，其有利于各 种类型毒性显露，并且使药物丧失必需的多重活性。
因而，虽然存在用于抑制血管发生的多个靶标和许多现有技术技术药物固有的全 部优点但没有其本质缺点，预期这些组合物
-没有毒性；
-没有禁忌症；
-当与抗肿瘤细胞毒剂联合使用时(需要时)，减少其毒性并增强其功效；
-具有直接的抗肿瘤作用；
-引起抗复发和抗转移作用；
-不引起抗药性，尤其是对程序性细胞死亡的抗药性；
-表达新血管形成抑制选择性，并且中止肿瘤中的新血管形成；以及
-任选地，包括免疫调节、疼痛释放、抗细菌、抗炎和抗血管发生剂的多重活性谱中 的其它类型活性；
-能够诱导程序性细胞死亡。
鉴于现有技术方法和药物中存在的许多缺点，上述清单远非穷举达到所需结果需 要的条件。
能够对肿瘤生长过程同时引起所述多重活性效果的抗血管发生剂在现有技术中 是未知的，从中也不是显而易见的。
发明概述
本发明的目的在于寻找并且开发使用抗血管发生抗肿瘤剂选择性抑制或完全中 止新血管发生的药物，所述抗血管发生抗肿瘤剂没有现有技术药物存在的缺点，即，它在长 期使用中不引起任何毒副作用、没有禁忌症和不引起抗药性(尤其是对程序性细胞死亡的 抗药性)，并且当与细胞抑制性药物结合使用时，其不仅增强其功效，而且有利于减少其毒 性。此外，所要求保护的方法具有许多优于所有现有技术血管发生阻断剂的优点，即，其具 有直接的抗肿瘤作用、能够诱导程序性细胞死亡并且具有抗复发和抗转移活性，同时具有 免疫调节、抗菌、伤口愈合、抗炎、疼痛释放和其它活性。
在理论上，可预期多组分和多重活性的天然类萜烯的复合物没有现有技术血管发 生抑制方法内在的缺点，并且具有一些前述的必然优点。
使本发明的发明人感到意外的是，在他们的科学研究中发现，类萜烯物质 Abisil (描述于专利 RU No. 2054945 中，1995 年 6 月沘日；RU No. 2198653，2002 年 3 月 29日)，其具有免疫调节、抗炎、伤口愈合、疼痛释放和抗细菌活性，并且还能够激活具有 神经介质合成障碍的病理状态(特别是癌症)中大脑皮层中神经末梢的特定体液介质 (RUNo. 2244928，2003年2月19日)，其是一种有效的血管发生抑制剂，表现出细胞毒活性， 以及诱导程序性细胞死亡、抗复发、抗转移和抗肿瘤的活性。
Abisil类萜烯物质用作新药物(即多重活性的类萜烯药物组合物Abisilin)的基 础，其表示一种口服剂型，即，20%的油溶液，具有新的药物活性谱，以及中止与血管发生障 碍(特别是恶性肿瘤生长中的血管发生障碍)相关的病理过程的新可能性。
类萜烯药物组合物Abisilin的多重活性是由于使用天然化学萜烯复合物来实现 的，该复合物含有刺激产生和刺激合成、提供松科代表性植物对抗环境影响的生物保护的 物质，该物质富含相同的单萜烯化合物。发现了天然萜烯复合物与单独在最终产物的使用 中不会引起前述现有技术抗血管发生药物固有的毒性作用。高治疗效果不仅归因于药物组 合物Abisilin所有活性物质的某些最佳作用，而且归因于它们的协同作用，所述活性物质 为来自松科针叶树的萜烯(类异戊二烯)，包含
-类倍半萜烯(3 6%)；
-中性类萜烯(11 15%)；
-双萜酸(23 28% )；
-三萜酸(8 16%);
-不饱和的和饱和的脂肪酸(0.1 0. 3% )；
-酚类化合物(0.1 0. 2% )；
-其余的为类单萜，其中相对于总萜烯组合物，乙酸冰片酯含量至少为10.0%，其 溶解于葵花子油中。
此外，具有血管发生抑制作用的抗肿瘤类萜烯药物组合物Abisilin的开发是基 于基本上新提出的策略，该策略是通过使用来自针叶植物中的内源性萜类化合物(该化合 物在该植物中合成以保护它们自身对抗环境的影响)，在人或动物体内由大脑结构开始产 生能够阻断正常生理过程调节失衡的它们自身的内源性物质。
研究了具有血管发生抑制作用的多重活性的抗肿瘤口服药物Abisilin的一般毒 性。
在本发明的一个优选变化方案中，基于一般毒性研究，将Abisilin以80至IOOmg/ kg体重的剂量口服给药(参见实施例1)。
本发明的另一个优选变化方案是使用1000 μ g/mL剂量的Abisilin诱导对肿瘤细 胞的选择性细胞毒作用的方法和通过类似于程序性细胞死亡的机制处死肿瘤细胞的方法， 至于该剂量，对于Jurkat细胞系而言，发现总计最大比例的对Αην+ΡΓ、Αην+ΡΓ和AnV—PI+阳 性的细胞，其占86. 6% (参见实施例2)。
本发明再-个更优选的变化方案是以10至100毫克/千克体重剂量口服给药2至 11天的期间，如所阐述的，使用必要的可移植实体肿瘤黑色素瘤B-16、Ca-755、LLC、CC_5、 CAC和肉瘤M-I的试剂盒，诱导Abisilin抗肿瘤活性的方法(参见实施例3)。
本发明代表各种起因的肿瘤疾病治疗的优选变化方案在于使用药物组合物 Abisilin，其可以呈溶液、片剂、明胶胶囊、丸剂、糖浆、混悬剂、散剂、乳剂、颗粒剂、微球体 或纳米球体的形式，或可用于实现药物活性成分受控释放的其它剂型。
在可移植肿瘤CAC、Ca-755和黑色素瘤B-16上研究了 Abisilin与现有技术药物 顺钼的联合给药，不仅证明了使用Abisilin可获得协同作用，而且证明了两种药物的治疗 意义的增强。
本发明的优选实施方案是通过使用Abisilin体外和体内实验，将促血管发生性 介质和抗血管发生性介质之间的自然平衡向后者占主导地位的方向移动的方法(参见实 施例4)。
此外，本发明的一个更优选实施方案是通过口服给予80至100毫克/千克体重剂 量的药物Abisilin，该药物用于诱导抗复发和抗转移作用的用途(参见实施例5)。
以下给出实施例1至5，以说明本发明的优选实施方案，但它们不限制本发明的范围。
实施例1
在测定急性毒性中，在10000mg/kg的最大可能剂量下，没有观测到动物的死亡， 这使得根据俄罗斯国家标准(GOST) 12. 1.007-76，可以将所述药物归类为物质危害分类 IV。
在各自具有165 士 3克和163 士 3克平均体重的非纯种系谱雄性和雌性大鼠上进行 了亚慢性实验。将研究的药物胃内给药，每天给药一次，进行14天，其中对雄性大鼠的剂量 为100、500或1000mg/kg，对雌性大鼠的剂量为100和1000mg/kg。
根据实验结果，所研究剂量的Abisilin在实验动物的整体指标(体重增加、行为 反应、食物和水的摄入)；外周血的细胞组成；肝脏的排泄、吸收、蛋白质合成和碳水化合物 功能；血清胆固醇水平；以及心血管、排泄和神经系统的功能状况方面没有引起可靠的变 化。
以1000mg/kg的剂量，S卩，超过推荐治疗剂量十倍的剂量，使用Abisilin只在某些 实验动物中引起微弱的胃肠粘膜的局部刺激。
因此，以所研究的剂量给药的Abisilin的一般毒性研究显示，该使用不会引起机 体器官或组织的结构障碍。
实施例2
Abisilin对肿瘤细胞的细胞毒和程序性细胞死亡诱导活性
在以下肿瘤细胞系上进行了体外研究Jurkat (T-细胞淋巴细胞白血病)、 Raji (B-细胞白血病)、K562 (慢性髓细胞白血病)、U937 (髓细胞白血病)、Mel P(黑色素 瘤)、T 47 D (乳腺癌)、SK0V-3 (卵巢癌)和PC-3 (前列腺癌)。
使上述细胞系于37°C下和(X)2气氛中，在完全RPMI-1640培养基中生长，该培养基 含有10%胎牛血清、2mM/mL谷氨酰胺、0. lmg/mL庆大霉素、维生素、丙酮酸钠和氨基酸。
在研究中，用以下浓度使用Abisilin :300 μ g/mL、500 μ g/mL、800 μ g/mL 和 ΙΟΟΟμ g/mLo DMSO(二甲基亚砜)用作稀释剂。
通过比色法，使用MTT测定法，测定Abisilin的细胞毒活性。将5X IO4个细胞/ 毫升浓度的肿瘤细胞接种到^arsted平底96-孔平板上，向每个孔中加入20 μ L测试浓度 的Abisilin，然后将平板在标准温度和压力下温育72小时(一式3份研究各Abisilin浓 度)。所用的对照为不含Abisilin的三个孔，向该三个孔中加入20 μ L 1%DMS0。在温育 结束前5小时，向各孔中加入20 μ L MTT溶液(来自Sigma Chemical Co. ,U.S.A.)。在温 育结束之后，通过将平板在IOOOrpm下离心2-3分钟，使细胞沉淀。小心地收集上清液，并 向各孔中加入200 μ L DMSO (ICNBiomedicals，he.)，其是用于甲臜晶体的溶剂。将细胞重 悬浮，并且在37°C下温育10分钟，之后在Uniplan AIFR-01免疫酶反应读数器(俄罗斯) 中，在MOnm波长下，测定溶液的光密度(OD)。MTT通过活细胞代谢为水不溶性的甲臜，从 而改变与存活细胞量成比例的溶液的光密度。如果池中死亡细胞的数量为至少50%时，认 为肿瘤细胞对实验的药物是敏感的。每个实验重复进行三次。以(实验中的平均OD/对照 中的平均0D) X 100%确定存活率。
通过使用FITC缀合的膜联蛋白V，结合碘化丙锭(PI)活体染料的双重活体染色， 测定凋亡细胞。
按照以下的标准，评价膜联蛋白V-FITC和PI染色的细胞
膜联蛋白V阴性/PI阴性(Αην—ΡΓ)活细胞、膜联蛋白V阳性/PI阴性(AnV+ΡΓ) 早期凋亡细胞和膜联蛋白V阳性/PI阳性(AnV+PI+)晚期凋亡或坏死的细胞。对照由在相 同条件但不含Abisilin的情况下温育的肿瘤细胞和在相同条件但加入DMSO溶液代替 Abisilin的情况下培养的肿瘤细胞组成。
使用Matistika 6. 0软件进行实验数据的统计学处理。使用学生(Mudent)检 验，比较平均值(ρ < 0. 05时，认为差异是显著的)。
该研究显示，与Abisilin —起温育肿瘤细胞显示，Abisilin对Jurkat、Raji和 PC-3细胞系的细胞毒活性。Abisilin下肿瘤细胞存活率曲线显示于

图1中。
Abisilin对Jurkat细胞系具有最明显的细胞毒性，并且当Abisilin浓度为 1000 μ g/mL时，该细胞毒性总计为41.8%。随着Abisilin的浓度增加，活肿瘤细胞懂得百 分比含量降低，反之亦然。
在研究Abisilin对U937、K562、T 47D、SK0V-3和Mel P肿瘤细胞的活性中，没有检测到细胞毒性。
对300 μ g 和 1000 μ g Abisilin 浓度，对 Jurkat、Raji、PC_3 和 U937 系细胞，使用 膜联蛋白V/PI双重活体染色，测定了 Abisilin诱导的程序性细胞死亡。
发现Abisilin通过类似于程序性细胞死亡的机制，诱导所测定的细胞系的肿瘤 细胞死亡(表1)。
表 1
Abisilin诱导的程序性细胞死亡研究的结果
权利要求
1.用于治疗和预防肿瘤和其它疾病的药物，其中血管发生抑制是通过使用多重活性药 物组合物AbiSilin的治疗有效作用，其中活性成分为来自松科针叶树的萜烯(类异戊二 烯)，这些萜烯包含以下成分，以相对于总重量的百分比基础计，即-类倍半萜烯(3 6%)；-中性双萜类(11 15% )；-双萜酸(23 28%)；-三萜酸(8 16% )；-不饱和的和饱和的脂肪酸(0. 1 0. 3% )；-酚类化合物(0. 1 0.2% )；-其余的为类单萜，其中以特定比例计相对于总萜烯，乙酸冰片酯的含量至少为 10.0%,以及药学上可接受的载体和/赋形剂，其特征在于该组合物以有效量口服给予哺 乳动物，包括人。
2.根据权利要求1的用于治疗各种起因的肿瘤疾病的药物，该药物由药物组合物 Abisilin表示，其可以是溶液、片剂、明胶胶囊、丸剂、糖浆、混悬剂、散剂、乳剂、颗粒剂、微 球体或纳米球体的形式，或用于药物活性成分受控释放的其它剂型。
3.根据权利要求1或2的药物，其用于诱导血管发生系统抑制和引起直接的抗肿瘤、 抗复发和抗转移作用和内源性程序性细胞死亡系统的联合激活，所述药物组合物每天以80 至100毫克/千克体重的剂量口服给予患有肿瘤疾病的哺乳动物，包括人。
4.根据权利要求1、2或3的药物，其中所述药物组合物Abisilin与其它药物活性物质 (抗生素、细胞抑制剂等)联合使用。
全文摘要
本发明涉及医学、化学和制药工业，并且涉及用于治疗由血管发生调节障碍引起的疾病的药剂，尤其涉及通过诱导血管发生抑制以及通过联合活化程序性细胞死亡内源性系统，治疗不同起因的肿瘤疾病的方法，所述诱导血管发生抑制继发于直接的抗肿瘤、抗复发和抗转移作用。本发明使用新的口服药物形式‘Abisilin’，其含有涉及天然萜烯类化合物(类异戊二烯)的来源于松科针叶树的成分，该药物形式包含类倍半萜烯(3-6％)；中性双萜类(11-15％)；双萜酸(22-28％)；三萜酸(8-16％)；不饱和的和饱和的脂肪酸(0.1-0.3％)；酚类化合物(0.1-0.2％)；其余为类单萜，其中乙酸冰片酯的含量为总萜烯组合物的至少10.0％。预期该新的口服药物形式‘Abisilin’(表现出免疫调节、抗菌、抗炎、麻醉、伤口愈合和其它药理学上有意义的作用的物质)的使用无禁忌症和毒性作用；并且可与不同药剂共同使用，提供一种新的治疗方法，并且增强肿瘤疾病和许多其它由血管发生过程障碍引起的疾病的治疗功效。
文档编号A61K36/15GK102036672SQ200880128861
公开日2011年4月27日 申请日期2008年3月14日 优先权日2008年3月14日
发明者A·M·科兹洛夫, A·U·巴利辛尼科夫, F·I·马加诺娃, L·A·莱特瑟鲁斯, N·M·皮尼吉娜, Z·S·斯米尔诺夫娜 申请人:伊尼蒂雅姆-医药有限责任公司